关键词:
脑出血方
破血化瘀
队列研究
神经损伤
Hemin
细胞自噬
PI3K/AKT/mTOR信号通路
摘要:
目的:
1.采用双向队列研究方法,观察“破血化瘀、填精补髓”理论指导下的脑出血方(Nao-chu-xue Priscroption,NCXP)对不同病程的脑出血(intracerebral hemorrhage,ICH)患者临床疗效及预后的影响,为脑出血方的临床应用提供循证依据。
2.采用体内外实验,探讨脑出血方通过调控PI3K/AKT/mTOR信号通路干预细胞自噬发挥神经保护作用的起效机制,为该方的临床应用提供基础依据。
方法:
1.临床研究:双向队列研究设计方法,收集2020年1月-2024年1月符合纳入排除标准的ICH患者,以是否服用脑出血方为暴露因素分为治疗组和对照组,根据发病病程各分为急性期、恢复期、后遗症期三个亚组,收集各组性别、年龄、病程、病史等基线资料进行统计描述;收集两队列基线、治疗结束后的美国国立卫生研究院卒中量表(NIHSS)、日常生活能力量表(BI)评分,比较两队列的临床疗效;收集两队列基线、治疗结束3个月时的改良Rankin量表(mRS),评价两队列的致残及预后情况;运用相对危险度(RR)、归因危险度(AR)和Logistic单因素回归分析,分析脑出血方与预后良好/不良的关联强度。观察两组患者治疗前后的生化指标,记录不良反应事件,进行脑出血方的安全性评价。
2.体内实验:SD大鼠被随机分成假手术组、脑出血模型组、脑出血方低、中、高剂量组,运用自体血注射方法构建ICH大鼠模型。假手术组、模型组给予生理盐水灌胃,给药组分别给予0.13g/100g、0.26g/100g、0.52g/100g剂量的脑出血方,1次/d,10d后进行标本留取。Zea Longa5法用于评估各组在24h,3d,7d,10d时点的神经功能情况;取材后进行脑组织切片,观察并计算各组冠状位血肿最大面积比;HE染色、Western Blot、RT-qPCR技术分别用于观察和检测各组脑组织病理形态变化,LC3、Beclin1、ULK1、p62自噬蛋白表达及PI3K、AKT、mTOR的基因表达情况。
3.体外实验:(1)以小胶质细胞BV-2为研究对象,通过氯高铁血红素(Hemin)诱导建立ICH体外模型,CCK8法探索Hemin和脑出血方的最佳干预浓度后进行给药干预,流式细胞术和Western Blot技术用于检测细胞凋亡率及凋亡蛋白表达情况,以评价ICH体外模型的建立及脑出血方的保护作用。(2)使用Western Blot和RT-qPCR技术检测各组自噬相关基因和蛋白表达;CCK8法筛选自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)的最佳干预浓度及干预后的细胞活力,免疫荧光、Western Blot和RT-qPCR检测3-MA干预后各组自噬相关基因和蛋白表达,验证脑出血方对自噬的调控作用。(3)使用Western Blot和RT-qPCR技术检测各组PI3K、AKT、mTOR的基因和磷酸化蛋白表达;CCK8法探索PI3K通路抑制剂2-吗啉代-8-苯基色酮(2-(4-morpholinyl)-8-phenyl-4H-1-benzopyran-4-one,LY294002)的最佳干预浓度及干预后的细胞活力;Western Blot检测LY294002干预后自噬蛋白表达情况,验证脑出血方通过PI3K/AKT/mTOR通路调控ICH后细胞自噬发挥神经保护作用。
结果:
1.临床研究:(1)两组急性期、恢复期、后遗症期的NIHSS、BI以及mRS基线评分无明显差异(P>0.05)。治疗后两组NIHSS评分降低,BI评分增加,mRS评分减低,临床疗效显著;在改善神经功能、提高日常生活能力上,急性期组间比较差异显著(P<0.05),在恢复期、后遗症期组间比较差异无意义(P>0.05);在降低致残程度上,急性期、恢复期、后遗症期的组间比较差异无意义(P>0.05)。(2)RR=1.054,治疗组发生预后良好的概率是对照组的1.054倍;AR=0.17,AR%=59%,治疗组发生预后良好有59%归因于服用脑出血方。(2)单因素Logistic回归分析显示,急性期、恢复期、后遗症期的OR值分别为1.95、0.84、0.29,表明在急性期、恢复期、后遗症期,服用脑出血方相比不服用脑出血方发生预后良好的概率分别增加95%、降低16%、降低71%。(3)两组在治疗期间未出现不良反应事件,两种治疗方法安全性良好。
2.体内实验:(1)ICH后大鼠神经功能评分高于假手术组,脑组织内出血灶明显,伴见大量坏死神经细胞、炎性细胞浸润,细胞核固缩深染。脑出血方干预后,ICH大鼠神经功能评分降低,血肿面积减少,血肿周围组织病理形态得到改善。(2)ICH大鼠血肿周围组织中LC3 Ⅱ/Ⅰ、Beclin1、ULK1表达上调,p62表达下调,自噬被显著激活;PI3K