关键词： PRRSV   分子流行病学调查   免疫保护   肠-肺轴   抗病毒机制  

摘要： 猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的以妊娠母猪繁殖障碍、断奶前后仔猪死亡和各日龄仔猪呼吸道症状为主要特征的猪病毒性疾病。PRRSV是一种单股正链RNA病毒,包括以Lelystad virus为代表的欧洲型(European genotype,PRRSV-1)和以ATCC VR-2332为代表的北美洲型(North American genotype,PRRSV-2)。我国PRRSV流行情况复杂,先后出现PRRSV-2经典毒株流行时期、高致病性PRRSV毒株(HP-PRRSV)流行时期及以类NADC30为主的多基因型毒株共存流行时期。近年,类NADC34毒株区域流行率越来越高,受到极大关注。PRRSV基因组高突变特征使得当前疫苗对不同毒株的保护作用有限,给PRRS疫情防控提出了巨大挑战。据此,本研究开展了以下三方面的工作: 1.我国猪繁殖与呼吸综合征病毒的分子流行病学调查研究 为全面了解我国PRRSV流行情况,本研究以五大生猪养殖区21个省的100余个养殖场为研究对象,选择2021年10月至2022年12月共五个季度,按月连续采集初生仔猪处理液、断奶仔猪血清、8～10周龄保育仔猪口腔液,通过定量RT-PCR检测方法和PRRSV ORF5基因测序方法确定样本基因型。结果显示:共采集437场批7518份样本,PRRSV样本阳性率为32.1%,其中73.6%为PRRSV野毒株。五大区中,北部区、东部区和中南区的场批PRRSV阳性率接近于全国平均水平,西北区的阳性率最高,西南区的阳性率最低。进一步选取500份PRRSV野毒样本进行流行比例分析,含75份PRRSV-1(15%)和390份PRRSV-2(85%)单病原感染,以及25份PRRSV-1和PRRSV-2的混合感染(5%),10份PRRSV-2多谱系混合感染(2%)四种类型;其中PRRSV-2野毒株单谱系感染样本的ORF5基因系统发育进化分析结果显示:谱系1、谱系3和谱系8分别占500份样本总数的60%、8%和10%。在谱系1中,亚谱系1.5和亚谱系1.8分别占比在500份样本总数的5.4%和54.6%。进一步通过符合连续采样要求的217个阳性场批分析养殖场内PRRSV感染时间,约59%(128/217)在出生早期感染或垂直传播转为阳性,30.88%在断奶前转为阳性,10.14%在保育早期转为阳性,综合评估约90%场批在断奶前转为阳性。由此可见,我国PRRS整体防控压力较大。 2.商品化PRRS活疫苗对异源类NADC34毒株的保护效果研究 面对PRRS整体防控压力,且目前尚无针对PRRSV-2谱系1株的商品化疫苗,本研究选择谱系5毒株(VR2332和R98 MLVs)疫苗免疫PRRSV病原和抗体双阴性的断奶仔猪,并在免疫后28d感染异源强毒株JS2021NADC34。在感染后14d内评估仔猪的直肠温度、病毒血症、胸腺和肺部的大体病变、肺部的显微病变以及病毒分布和鼻腔排毒情况等临床症状,同时监测疫苗诱导的体液免疫反应和攻毒后死亡率。结果显示:相对于PRRSV R98 MLVs疫苗,PRRSV VR2332 MLV对JS2021NADC34毒株感染的断奶仔猪表现出更好的保护效果,免疫仔猪表现出短暂且轻微的症状,肺部出现轻度病变,轻度胸腺萎缩,血清和鼻拭子中的病毒水平较低,生长性能更好,存活率为100%。因此,PRRSV VR2332 MLV对高致病性PRRSV类NADC34毒株亦具有一定效果。 ***2332株疫苗通过“肠-肺轴”调控PRRSV免疫应答机制研究 为了探究VR2332 MLV疫苗可能产生的保护机制,本研究分别设置攻毒组(PC组)、免疫攻毒组(BI组)、免疫不攻毒组(BI2组)及正常动物对照组(SC组)进行动物体免疫和攻毒实验,在观察上节所列临床特征及监测病毒载量的同时,增加评估肺脏微观炎性细胞浸润,分析促炎或抑炎因子和天然免疫因子IFN-α/-β等细胞因子的转录水平。结果显示,BI组与PC组相比,在m RNA水平IL-8极显著下降、TNF-α极显著上升,抑炎因子IL-10表达极显著下降,天然免疫因子IFN-α和IFN-β表达升高但差异不显著,间质性肺炎和炎性细胞浸润评分下降显著,可见,VR2332疫苗免疫仔猪可减少类NADC34毒株免疫抑制效应及缓解炎症作用。为进一步探究各组免疫水平差异的可能原因,对肺脏开展SCFAs靶向代谢组学检测,肺脏丙酸含量存在PC

关键词： 鸭源鸡毒支原体   套式PCR   流行病学调查   分离鉴定  

摘要： 鸡毒支原体（Mycoplasma gallisepticum,MG）可以导致鸡、鸭、鹅等禽类慢性呼吸道疾病,严重危害养禽业的健康发展。众多研究报道证实,MG已广泛流行于世界各地的鸡群中,在众多宿主中,鸭也是其中之一,且可以通过水平和垂直两种方式在鸭群内传播。值得关注的是我国的鸭肉生产与消费总量均排名世界第一,并且养鸭业仍在不断扩大且向着集约化发展,这无疑增加了鸭群MG的感染率,而我国鸭群中MG的流行情况尚未明确。因此,建立有效的检测方法在鸭群中进行MG病原学监测,对MG的防控和净化具有重要意义。 本研究利用MG mg C2为靶基因,以MG F36株基因组DNA为模板,通过扩增条件摸索,特异性、灵敏性验证,构建了鸭源MG套式PCR检测方法。该方法能够特异性的扩增MG,与其它病原体无交叉反应。将MG DNA浓度稀释到5×10-6ng/μL时,仍有明显的目的条带扩增,且与地高辛标记的MG核酸探针符合率为92%。为进一步验证其临床适应性,利用该方法对收集的来自山东和内蒙古部分地区15个未免疫MG疫苗的规模化鸭场1002份临床样本,进行MG感染现状及流行情况检测分析。结果显示,在上述样本中共检测到阳性样本228份,总阳性率为22.75%,其中以商品蛋鸭群MG感染最为严重,阳性率达34.83%,商品肉鸭群阳性率为17.33%,病死鸭胚阳性率为6.67%。挑选来自不同来源的阳性样本进行mg C2基因的遗传进化分析,结果表明各MG野生株同源性在73.3%～99.8%之间,表现出遗传多样性,而与国际鸡源MG参考株同源性在68.4%～98.4%之间,表明部分鸭源MG具有独立的起源。初步明确了MG在鸭群中的流行和遗传进化规律。 为进一步分析鸭源MG的致病性及遗传多样性。参照鸡源MG分离培养方法,对鸭源MG的体外培养条件进行了优化,通过菌落形态学观察结合分子生物学方法,成功从临床样本中分离获得26株鸭源MG。以不同的分离地区为依据,选择4株分离株进行鸭胚致病性试验,评估分离株的致病性,结果发现攻毒鸭胚总体死亡率不高,仅分离株1-9攻毒鸭胚死亡率达到60%,另有部分攻毒鸭胚表现为弱雏。其中,死亡胚体表现为发育迟缓,弱雏表现为啄壳不全、身体蜷缩、卵黄吸收不彻底,剖检后可见MG感染典型的气囊增厚和干酪样渗出物症状。为明确分离株1-9的遗传背景,对其进行全基因组测序,数据显示,1-9全长962,503 bp,GC含量为31%。在预测的1576个基因中,共有599个进行了功能分类,其中与翻译、核糖体结构和合成相关的基因数量最多（43.9%）,毒力基因分布在21个毒力因子中。通过绘制基于16s r RNA和单拷贝基因集的系统发育进化树发现,分离株1-9与鸡源参考株之间有着较远的遗传进化距离。 上述结果表明,以MG mg C2基因为检测靶标,为临床鸭源MG的检测建立了特异性强、灵敏性高的套式PCR检测方法,为鸭源MG的防控提供可靠检测技术;进一步评估了MG在鸭群中的流行情况和分离株间的亲缘关系及遗传背景,为鸭源MG致病性研究及功能基因的挖掘提供科学依据。

关键词： 儿童流感嗜血杆菌   耐药性   侵袭性   β-内酰胺酶  

摘要： 背景和目的　　在对儿童呼吸道造成感染的许多病原菌之中Hi-流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae,Hi)是非常重要的一种。近年来采用广谱抗生素药物治疗呼吸系统感染越来越普遍，Hi耐药性快速提升。不同地区Hi耐药性存在差异，同时，儿童用药的特殊性，需要持续监测本地区儿童Hi的流行病学和耐药性，明确当前推荐药。本研究旨在探讨河南地区2016-2021年儿童流感嗜血杆菌耐药性情况以及具体分布特征，尤其是侵袭性流感嗜血杆菌耐药情况，希望能够通过研究为临床治疗过程中用药合理性提升提供一定的理论依据。　　方法　　选择河南省某儿童医院2016年1月至2021年12月报告的8272例流感嗜血杆菌感染病例作为研究对象。　　1.在医院临床微生物科LIS信息系统中查询患儿的性别、年龄、标本类型等流行病学特征;采用玻片凝集法检测流感嗜血杆菌血清型;采用Vitek2-Compact细菌鉴定及药敏分析仪、Kirby-Bauer(K-B)纸片扩散法、E-test条法等方式对药物的敏感性以及菌株的耐药情况进行检测;头孢硝噻吩显色法测定β-内酰胺酶。　　2.选择报告为侵袭性流感嗜血杆菌感染的患儿及其对应菌株，分析患儿的临床资料和抗菌治疗效果;分析侵袭性流感嗜血杆菌对常用抗菌药物的耐药性和敏感性。根据患儿病情将其分为重症组和非重症组，分析两组侵袭性流感嗜血杆菌感染患儿的临床特征和耐药性。　　结果　　1.2016-2021年该院共分离8272株流感嗜血杆菌，标本主要来源于呼吸道和分泌物。其中痰液标本(83.60％,6915/8272)和眼分泌物标本(10.17％,841/8272)占比较多，血液、无菌体液菌株占比较低(0.37％,31/8272)。8272株流感嗜血杆菌来自男孩5008株(60.54％),女孩3264株(39.46％)。28天～1岁患儿检出流感嗜血杆菌5484株(66.30％)，其次为1～3岁龄1596株(19.29％)。　　感染具有一定的季节性，春季33.04％(2733/8272)、冬季32.12％(2657/8272)检出较多。本研究8272株流感嗜血杆菌中，有7532株为不可分型流感嗜血杆菌(***,NTHi)，占比91.05％。可分型流感嗜血杆菌只占8.95％(740/8272),以Hid为主，占比3.43％(284/8272),Hib仅占0.26％(22/8272)。　　2.13种常用抗生素中药敏试验结果的结果表明:流感嗜血杆菌对下列药物拥有较高的敏感度，如美罗培南、环丙沙星、头孢他啶、头孢噻肟、氯霉素等。耐药率较高的抗生素:头孢呋辛、复方新诺明、氨苄西林等。2016年至2021年期间，流感嗜血杆菌对多种抗生素的耐药率均上升，包括二代头孢(头孢呋辛)，氨苄西林/舒巴坦等，对于氯霉素药物的耐药性在2016年至2021年期间有所下降。对复方新诺明和氨苄西林的耐药率始终在较高水平;阿奇霉素的耐药性处于波动状态。　　3.β-内酰胺酶流感嗜血杆菌阴性菌株占比为27.89％。2016-2021年流感嗜血杆菌β-内酰胺酶产酶率分别为68.75％、71.27％、74.28％、77.96％、63.67％和66.90％;β-内酰胺酶阴性氨苄西林耐药流感嗜血杆菌的平均检出率数据达7.76％(179/2307)。　　4.29株完成药敏试验的侵袭性流感嗜血杆菌均为不可分型流感嗜血杆菌(***,NTHi)。侵袭性流感嗜血杆菌感染常见于婴儿和学龄前儿童，主要由血液中检出，无明显季节性。常见症状为发热，其他包括白细胞、CRP-C反应蛋白、PCT-降钙素原升高。超过50％的侵袭性流感嗜血杆菌感染患者合并肺或上呼吸道感染。耐受侵袭性流感嗜血杆菌的药物主要包括头孢呋辛、氨苄西林以及复方新诺明等，且以β-内酰胺酶阳性为主。27例(93.10％)患儿治愈或好转出院，2例(6.90％)患儿死亡。　　结论　　河南地区流感嗜血杆菌主要来源于痰液标本;三岁内婴幼儿期是其高发阶段，男孩易感，春、冬季是高发季节;NTHi是儿童感染的主要类型。2016年至2021年河南地区流感嗜血杆菌对药物耐药呈上升趋势，且以β-内酰胺酶阳性为主。29株侵袭性流感嗜血杆菌均为NTHi，耐药形势严峻，建议临床提高警惕，推荐三代头孢(头孢他啶、头孢噻肟)和美罗培南作为河南地区侵袭性流感嗜血杆菌的首选治疗方案。

关键词： 噪声   有机溶剂   联合暴露   听力损失   影响因素  

摘要： 研究目的:有机溶剂与噪声联合暴露对工人听力危害严重,目前检测方法单一,不能完全评估其联合暴露的危害性。基于此,本研究拟在浙江省某地区联合接触噪声和有机溶剂的企业进行工人听力损失的流行病学调查。在此基础上,按照工人暴露因素不同分组,通过噪声和有机溶剂环境检测结果,联合利用多种听力检测手段评估工人的听力损伤情况,综合评价噪声和有机溶剂联合暴露的工人听力损伤状况,为完善听力损失的早期检测提供基础,为同时接触噪声和有机溶剂的工人提供听力防护的参考建议。 研究方法:采用典型抽样的方法在浙江省内选取某地区2家家具企业和1家制鞋企业的430名工人作为研究样本。采用自行设计的调查表,对3家企业所有工人进行职业史、个人基本情况和听力防护情况调查。在流行病学调查基础上,按照工种和暴露因素不同将工人分为单纯接触噪声组（180人）、噪声和有机溶剂联合暴露组（113人）、对照组（137人）。采用数字噪声记录仪记录工作场所噪声强度,采用个体采样和定点区域采样方法检测空气中有机溶剂,通过气相色谱仪测定有机溶剂浓度。使用经校准的听力计进行双耳气导纯音听阈测试,常频测试包括0.5k Hz、1k Hz、2 k Hz、3 k Hz、4 k Hz、6 k Hz、8 k Hz 7个频率,扩展高频测试包括9k Hz、10k Hz、11.2k Hz、12k Hz、14k Hz、16k Hz 6个频率。畸变产物耳声发射检测使用带DPOAE440模块的Interacoustics Titan设备在符合标准的隔音室内进行,测试频率为包含11个频率。声反射使用Interacoustics Titan设备进行测试,声反射测试中的声刺激包括226 Hz探测音和0.5、1和2k Hz的纯音。噪声下言语测听通过在电脑上播放中文版BKB-SIN言语材料,然后通过丹麦Interacoustics AD629型听力在70d B HL固定语音水平下进行测试。采用统计描述方法分析人口学资料、噪声和有机溶剂暴露水平和听力检测指标。采用单因素方差分析（ANOVA）比较三组研究对象在多个变量上的差异,两两比较使用Bonferroni校正检验进行。采用卡方检验分析分类变量之间的差异。听力损失的影响因素研究,采用单因素和多因素Logistic回归分析,OR值（比值比）和95%可信区间用来估计听力损失发生的风险大小。 研究结果: 1.研究对象基本情况 按照严格的纳入排除标准,共纳入430名工人。其中,噪声和有机溶剂联合暴露组113人（26.3%）,噪声暴露组180人（41.9%）,不接触噪声和有机溶剂的对照组137人（31.8%）。三组研究对象性别（χ2=0.15,P>0.05）、年龄（χ2=1.87,P>0.05）和工龄之间差异没有统计学意义（F=2.91,P>0.05）。 2.工作环境有害因素检测结果 （1）不同暴露组噪声强度:对照组工作场所噪声强度（LAeq,8h）为68.8±5.5d B（A）,噪声组工作场所噪声强度为(86.4±4.6 d B（A）);联合暴露组工作场所的噪声强度为(85.6±6.9 d B（A）)。对照组所处的环境噪声在国家允许范围,其余两组均超过国家8小时允许噪声强度85 d B（A）。 （2）不同岗位噪声暴露强度:家具制造业的工种中锻造岗的噪声强度（LAeq,8h）最高(88.66±1.16 d B（A）),而金属加工岗位噪声强度最低(83.46±5.21d B（A）);制鞋业中,噪声强度最高的岗位为印刷岗(87.54±12.43 d B（A）),噪声强度最低的岗位为成型岗(82.38±5.43 d B（A）)。 （3）工作场所有机溶剂检测结果:定点区域采样结果显示空气中耳毒性有机溶剂主要为甲苯,空气中耳毒性有机溶剂暴露浓度在职业接触限值范围内。个体采样结果显示工人接触的耳毒性有机溶剂类型主要为甲苯和苯,工人接触耳毒性有机溶剂水平也在职业接触限值范围内。 3.听力水平的生物检测结果 （1）常频测试结果:噪声组、联合暴露组与对照组相比,各频率下平均听力阈值均增高（P<0.05）。联合接触噪声和有机溶剂的工人低频（1k Hz、2k Hz）和高频（3k Hz、4k Hz和8k Hz）听力阈值均高于噪声组和对照组（P<0.05）。 （2）扩展高频率测试结果:噪声组、联合暴露组双耳纯音听力阈值在不同频段,与对照组相比,差异均具有统计学意义（P<0.05）。联合暴露组工人双耳平均听力阈值在9k Hz、10 k Hz、和14k Hz下高于噪声组,差异具有统计学意义（P<0.05）。 （3）畸变产物耳声发射（DPOAE）检测结果:噪声组、联合暴露组与对照组相比,DPOAE振幅引出率差异均具有统计学意义（P<0.05）;其中,左耳和右耳除1.5、2、9、10k Hz外,其