关键词:
皮肤癣菌病
流行病学
交叉引物扩增
恒温扩增
qPCR
摘要:
研究背景
皮肤癣菌病是临床最常见的浅部真菌感染性疾病,全球患病率约为20%~25%。目前,皮肤癣菌主要依赖直接镜检和真菌培养进行鉴定,但直接镜检受主观因素影响较大,而真菌培养耗时长。虽然PCR技术已经相当成熟,但依赖检验科PCR扩增环境及设备。MALDI-TOF MS技术需要基于培养物进行鉴定,且丝状菌数据库仍不完善。皮肤科门诊的皮肤癣菌病患者数量多,快速诊断需求迫切,经典的方法无法快速精确到种的水平,导致大量患者在病原学证据不足的情况下实施经验性治疗。因此,临床急需一种“立等可取”的鉴定方法,恒温扩增技术则是病原体即时检验(Point-Of-Care testing,POCT)的重要实现方式。
研究目的
本研究基于皮肤癣菌病的流行现状,和目前诊断技术的发展方向,分为两个部分:第一部分旨在了解皮肤癣菌病的临床流行病学情况,第二部分旨在研发交叉引物扩增(Cross Priming Amplification,CPA)诊断体系,以开发一套适用于皮肤科门诊的检测技术体系,从而改变我国真菌病及其他感染性疾病的诊疗路径。
研究方法
第一部分调查了2021年1月至2023年11月就诊于上海长征医院皮肤科门诊,并确诊为皮肤癣菌病的1084人次,使用SPSS 27.0软件和卡方检验的方法对患者信息进行统计学分析。
第二部分结合了“交叉引物扩增技术”和“快速核酸提取技术”。首先,针对高发的皮肤癣菌设计特异性引物,并与已知的物种序列进行比对,确定了实验阳性菌株和阴性菌株。随后,提取出所有实验菌株的核酸,筛选出适合的引物,进行了反应体系的优化,确定了CPA最佳反应体系,之后利用实验菌株的核酸验证了反应体系的特异性和敏感性,同时设置了实时荧光定量PCR(Real-time Quantitative PCR,qPCR)作为平行参照。最后,采集临床甲屑、皮屑样本,利用两种“快速核酸提取技术”(试剂盒法、溶解液法)提取核酸,分别进行CPA和qPCR扩增,检测感染的阴阳性,对比两种分子诊断技术和传统的“金标准”方法的符合程度。
结果
第一部分的统计数据显示,以“直接镜检+真菌培养”为鉴定的“金标准”,红色毛癣菌(799/1084,73.71%)是本地区皮肤癣菌感染最常见的菌种,其次为须癣毛癣菌(234/1084,21.59%)。在感染类型方面,甲癣(n=459/1084,42.34%)最为常见,其次为足癣(n=196/1084,18.08%)、股癣(n=159/1084,14.67%)和体癣(n=138/1084,12.73%)。同时患有甲癣和足癣的有23例,“两足一手”的患者有3例。对年龄分布进行分析显示,皮肤癣菌病的发病人群集中在21~70岁(n=897/1084,82.75%)。其中,头癣(n=8/14,57.14%)最好发于1~10岁的儿童,甲癣(n=271/459,59.04%)好发于21~40岁的青年人。分析性别与感染的关系显示,发现股癣(男/女=129/30,P<0.01)和甲癣(男/女=267/192,P=0.005)发病以男性为主,而感染犬小孢子菌的女性稍多于男性(男/女=13/26,P<0.001)。
第二部分的实验结果表明,CPA体系可覆盖红色毛癣菌、须癣毛癣菌、犬小孢子菌、絮状表皮癣菌、断发毛癣菌、铁锈色小孢子菌这6种皮肤癣菌,其最适温度为63℃,最佳反应为90循环数(1.5h)。用117株菌株验证,发现CPA体系具有100%的特异性,敏感性可达到2.5×10~2copies/u L。在100份临床样本中的应用显示,与“金标准”比较,CPA体系表现出100%的特异度和95%的灵敏度,实验耗时约1.5h~2h。与此同时,作为对照的qPCR技术同样表现出100%的特异性,敏感性能够达到1×10~2copies/u L,在100份临床样本中的应用表现出100%的特异度和灵敏度,实验时间大约1.5h。
结论
本地区皮肤癣菌感染以红色毛癣菌最常见,其次为须癣毛癣菌,感染类型以甲癣最多,其次为足癣、股癣、体癣,与国内外流行病学规律基本一致。
CPA技术相较于qPCR技术更为简便,整个反应过程仅需用一种酶,在中等温度(63℃)下进行,无需进行高温变性步骤,也不依赖大型的实验仪器设备。CPA技术的综合成本只有qPCR的1/6,其所用的扩增酶价格低,在大规模检测时可节约经济成本,更适合用于临床样本的POCT。并且,与传统的直接镜检+真菌培养(通常需要14天)相比,CPA在时间效率方面具有显著的优势,同时在准确性上也能匹敌传统方法。检测结果可及时指导临床治疗用药,提高诊疗效率。
综上所述,本课题在开展流行病学调查的基础上,针对常见的皮肤癣菌,成功研发出了一套快速、简便、准确、经济的皮肤癣菌病交叉引物扩增诊断体系,有效地弥补了传统