关键词:
猪流行性腹泻
流行病学调查
GⅡa型
病毒分离鉴定
灭活疫苗
摘要:
猪流行性腹泻(PED)是由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起的以呕吐、腹泻、厌食和脱水为特征的急性、高度传染性和严重的肠道疾病,已在世界各地造成巨大的经济损失。该病毒可影响所有品种和年龄组的猪,尤其是仔猪,其死亡率高达100%。PEDV于20世纪80年代在我国首次被发现,2010年10月我国发生PEDV毒株变异并引起的大规模PED暴发,造成严重的影响。原有疫苗接种可以有效预防经典毒株的感染,但自2010年10月以来,PEDV变异株引起了以严重呕吐、水样腹泻和高发病率和死亡率为主要临床特征的“持续性腹泻”,发病率和死亡率显著上升。这表明PEDV毒株在进化过程中发生了变异,传统疫苗已不能提供有效的交叉免疫保护,因此有必要通过PEDV流行病学调查优化免疫方案,寻找有效的治疗方法,以减少变异毒株感染造成的经济损失。面对新毒株的持续威胁,准确诊断PEDV病毒感染对防控该病至关重要。目前已有多种检测PEDV的方法,一般通过蛋白质或核酸检测,常见的有ELISA、血清中和试验(SNT)、胶体金试纸条(GICA)、免疫荧光(IF)和免疫组织化学(IHC)等免疫学方法,以及聚合酶链反应(PCR)、荧光定量PCR(RT-PCR)和等温扩增试验等分子生物学诊断方法。
为便于PEDV流行病学初筛,本研究建立了Taq Man实时荧光定量RT-PCR的PEDV检测方法。根据遗传演化保守的S1基因序列设计扩增引物、荧光定量RT-PCR检测引物和Taq Man探针,优化反应程序并测定其特异性、敏感性和重复性,从而建立RT-PCR。采用该检测方法对2021年01月至2023年06月河南省、山东省不同地区猪场的85份疑似PEDV阳性样本进行PEDV流行病学调查。测序获得18份样品的完整S基因核苷酸序列,根据序列进行核苷酸同源性与遗传演化以及S蛋白的关键氨基酸位点分析。根据遗传演化分析结果,用Vero E6细胞系对8份GIIa型样品进行PEDV病毒分离,对分离的PEDV临床分离株利用间接免疫荧光进行鉴定。随后在ABSL-2动物房进行PEDV GⅡa型HN08株的仔猪致病性试验,测定分离株PEDV HN08对仔猪的致病力。在上述毒力试验基础上,制备GⅡa型HN08毒株的灭活疫苗,对仔猪进行肌肉注射免疫和攻毒保护试验,评估疫苗的安全性和有效性。
试验结果表明,本研究成功建立了PEDV Taq Man实时荧光定量RT-PCR检测方法,其最优反应体系为:One Step q RT-PCR Probe 5×Master Mix 4μL,PEDV-S-F(10μM)、PEDV-S-R(10μM)各1μL,PEDV-S-Probe 0.5μL,核酸模板5μL,RNase-free water 8.5μL,总反应体系为20μL。反应程序:55℃15 min;95℃预变性30sec;95℃变性10 sec,60℃退火30 sec,共40个循环。标准曲线结果显示不同浓度的目的基因扩增与CT值之间存在良好的线性关系。特异性试验结果显示该方法只针对PEDV产生特异性的荧光扩增曲线,对其他腹泻病原未出现扩增曲线。灵敏度试验结果显示该方法检测质粒标准品的最低限度为1 copy/μL,具有良好的敏感性。重复试验表明该方法批内重复CT值的变异系数为0.48%~0.61%,批间重复CT值的变异系数为1.27%~1.67%,均小于5%。本研究建立的PEDV Taq Man实时荧光定量RT-PCR的检测方法具备良好的敏感性、特异性和重复性,可以用于PEDV的定量检测。
PEDV阳性分离毒株的遗传演化分析结果显示,18株PEDV中GⅠb分支1株、S INDEL分支3株、GⅡa分支10株、GⅡb分支4株,GⅡ分支毒株数量占绝对优势。18个毒株之间的S基因核苷酸同源性为93.4%~100%,与28株国内外代表性PEDV毒株的S基因核苷酸同源性为93.0%~99.9%,其中临床流行的S INDEL分支与现有的疫苗株的同源性较低为94.7%~95.9%。氨基酸位点分析显示,与S INDEL分支相比,GⅡa和GⅡb分支毒株在56-59位出现了4个氨基酸(GENQ)的插入,在160和161位点分别出现了2个氨基酸(DG)缺失。动物试验结果表明,临床分离的优势基因型PEDV GⅡa型HN08毒株对仔猪表现较强的致病性,以106.5TCID50/头剂量口服感染7日龄健康仔猪后,第2天开始仔猪出现呕吐和腹泻,第3天出现严重的水样腹泻,感染后第4天出现死亡,感染后第5天5头仔猪全部死亡,发病率和死亡率均为100%。此外,基于PEDV GⅡa型HN08株制备的灭活疫苗免疫仔猪后精神、采食等均正常,疫苗注射部位无红、肿和硬块发生,安全性好。免疫接种后攻毒,仔猪不发病,不排毒,可为免疫仔猪提供100%保护,免疫保护效率较高。
综上所