关键词：
中华鲟软骨
硫酸软骨素
提取分离
结构表征
抗氧化活性
摘要：
中华鲟(Chinese sturgeon)隶属脊索动物门、脊椎动物亚门、硬骨鱼纲、硬鳞总目、鲟形目、鲟科、鲟属,享有“活化石”之盛誉。中华鲟全身是宝,营养价值高,具有独特的医药和保健价值,其中硫酸软骨素是重要的活性成分之一。经研究表明,硫酸软骨素具有抗氧化、抗凝血、调节血脂、增强免疫等多种生物活性,是目前市场上较为重要的生化药品和化妆品添加剂,具有重要的研究与开发价值。近年来,许多国家先后开展了鲟鱼人工养殖,随着中华鲟鱼养殖业在我国的迅猛发展,其养殖的年产量迅速增加,我国现已跃居世界第一养殖大国,这为中华鲟鱼中活性成分的深入研究提供了丰富的资源。目前对于中华鲟的研究主要集中在养殖方面,关于深加工方面的研究甚少,对其中的活性物质如硫酸软骨素主要还是停留在提取阶段的研究,还未见中华鲟硫酸软骨素的纯化、结构鉴定、体外抗氧化和抗凝血等研究的相关报道。因此,本文主要研究中华鲟软骨中硫酸软骨素的提取、分离和纯化方法,并运用气相色谱(GC)、高效液相色谱(HPLC)、红外光谱(IR)、核磁共振(NMR)、原子力显微镜(AFM)等现代分析手段对中华鲟软骨中硫酸软骨素结构进行鉴定,考察其体外抗氧化和抗凝血活性,为中华鲟软骨中硫酸软骨素的研究与开发提供科学依据。主要研究内容和结果如下:
研究中华鲟软骨中硫酸软骨素的提取工艺。采用碱提酶解方法提取中华鲟软骨中硫酸软骨素。采用单因素实验和响应面分析法,确定碱提的最佳工艺条件为料液比9.2,NaOH浓度4.4％,提取时间3.9 h;根据单因素试验,确定酶解的最佳条件为,酶种类选择胃蛋白酶,加酶量1％,酶解时间4 h。在此优化条件下,硫酸软骨素得率为26.51±0.30％。
考察咔唑法测定中华鲟软骨中硫酸软骨素含量的方法。以葡萄糖醛酸为标准品,通过计算样品中葡萄糖醛酸含量,进而转换为硫酸软骨素含量。D-葡萄糖醛酸在10μg／mL～50μg／mL范围内线性关系良好,回归方程为Y=0.015 X-0.037(Y为吸光度,X为D-葡萄糖醛酸浓度,μg／mL),相关系数r=0.9997,低、中、高三个不同浓度的加样回收率分别为100.87％、100.73％和101.29％(n=5),其RSD值分别为2.74％、2.56％和2.22％。实验结果表明,该方法快速,重现性好,可用作中华鲟软骨中硫酸软骨素含量的测定。
研究中华鲟软骨中硫酸软骨素的分离纯化。采用最优工艺制备得到中华鲟软骨中硫酸软骨素粗品CS,经三氯乙酸除蛋白,DEAE-52纤维素柱纯化得到CS-1和CS-2;再经Sephadex G-100凝胶柱纯化,得到CS-11和CS-22两种组分,经HPLC检测为单一对称峰,表明CS-11和CS-22都为均一组分,其相对分子量分别为13425和42207。
对中华鲟软骨CS-11的结构进行表征。运用UV、IR、GC、NMR、AFM等现代分析手段对CS-11组分进行表征。GC用于测定CS-11的单糖组成,结果表明,CS-11主要由葡萄糖、葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基半乳糖组成,其摩尔比为葡萄糖:葡萄糖醛酸:N-乙酰氨基半乳糖=0.09:1:0.94;UV分析显示,CS-11不含有蛋白质和核酸;IR分析表明,CS-11具有一般硫酸软骨素的特征吸收峰,含有乙酰氨基、羧基、硫酸基和糖环等官能团,在855 cm-1和819 cm-1存在吸收峰,表明CS-11结构中同时含有C4和C6的硫酸基;NMR分析表明CS-11为β构型吡喃糖,谱图中显示含有乙酰基和羧基信号峰;AFM研究CS-11的微观形态表明,CS-11分子聚集紧密成团。
比较CS粗品和CS-11纯品的体外抗氧化和体外抗凝血生物活性。体外抗氧化实验表明,CS粗品和CS-11纯品对三种自由基(·OH、DPPH·、ABTS+)均有一定的清除作用。CS粗品对·OH、DPPH·的清除能力强于CS-11,而CS-11纯品对ABTS+的清除能力强于CS粗品。体外抗凝血实验表明,CS粗品和CS-11纯品均能显著延长凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶时间(TT),且均呈现量效关系,并且纯品抗凝效果显著优于粗品。实验结果提示,中华鲟软骨中硫酸软骨素组分主要通过抑制内外源凝血途径以及凝血酶活性等多个途径起到抗凝血作用。
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