关键词：
中华鲟
鳃细胞系
渗透压调节
转录组
摘要：
中华鲟(Acipenser sinensis)隶属鲟形目、鲟科、鲟属,是典型的溯河生殖洄游型鱼类,目前为极度濒危物种。为了研究中华鲟溯河洄游的渗透调节机制,本研究建立了中华鲟鳃细胞系,并检测不同渗透压处理后鳃细胞的形态变化和细胞增殖及凋亡特性。随后,对低渗渗透压、等渗渗透压和高渗渗透压处理的中华鲟鳃细胞进行转录组测序,分析不同渗透压处理下中华鲟鳃细胞的差异表达基因,再通过KEGG、GO富集分析、趋势分析和WGCNA分析,探究中华鲟鳃细胞在不同渗透压处理下的渗透压调节机制。本研究取得的主要结果如下:
1.中华鲟鳃细胞系的建立
采用组织贴壁法建立了中华鲟鳃细胞系。该细胞系在25℃、含有15%胎牛血清的DMEM培养基中生长最佳,2～3 d即可传代,已稳定传代至156代。冻存复苏后可保持正常细胞形态,细胞仍生长旺盛。通过脂质体转染法将p EGFP-N3质粒转入中华鲟鳃细胞,20%细胞可表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP),具有表达外源基因的能力。通过RT-PCR检测,发现建立的中华鲟鳃细胞系表达渗透压调节的关键基因。本研究建立了稳定传代的中华鲟鳃细胞系,为其渗透压调节机制研究提供了宝贵的材料。
2.不同渗透压环境下中华鲟鳃细胞系渗透压调节机制研究
本研究以不同渗透压的培养基处理中华鲟鳃细胞,低渗(150 m Osmol/kg)、等渗(300 m Osmol/kg)和高渗(600 m Osmol/kg),发现等渗处理组细胞形态没有发生改变,低渗处理组细胞形态变化较小,而高渗处理组细胞皱缩明显。利用5-乙炔-2’-脱氧尿苷(5-ethynyl-2’-deoxyuridine,Ed U)标记低渗、等渗和高渗处理的中华鲟鳃细胞,发现细胞增殖率分别为25.78±1.75%、61.22±0.86%、32.59±2.54%。不同渗透压培养基处理中华鲟鳃细胞36 h后,发现凋亡率分别为11.43±0.70%、4.51±0.91%、31.16±1.84%,高渗处理组细胞凋亡率显著高于其它两个处理组。接着,将不同渗透压处理组的鳃细胞进行转录组测序并比较分析,发现低渗处理组和等渗处理组的差异表达基因(differently expressed genes,DEGs)为15132个,而高渗处理组和等渗处理组的DEGs为20920个。
通过KEGG通路富集分析,发现差异表达基因显著富集到信号转导、代谢、消化、内分泌系统等相关信号通路,包括神经活性配体-受体相互作用、类固醇激素生物合成、细胞色素P450外源代谢作用、糖异生与糖酵解通路、钙离子信号通路等。对差异基因进行趋势分析,发现8545个DEGs基因表达水平随渗透压增加而升高,该趋势模块基因包括62个SLC溶质转运家族成员(nkcc1、slc5a5、slc26a5等),并富集到ABC转运体、近端小管碳酸氢盐回收、MAPK信号通路等KEGG通路。综上,高渗环境下鳃主要通过促进离子、氨基酸、糖类流动和能量代谢进行渗透压调节,低渗环境下主要通过蛋白质和脂类代谢供能,游离氨基酸等细胞渗透物代谢无显著差异。此外,我们还对渗透压处理产生DEGs进行了WGCNA分析,筛查得到响应细胞增殖和凋亡性状的关键模块,进一步分析发现细胞凋亡、细胞增殖相关模块富集到昼夜节律夹带、错配修复、心肌收缩途径等KEGG信号通路。
本研究建立了中华鲟鳃细胞系,为其渗透压调节机制的研究提供了体外材料,鉴定得到渗透压调节的关键基因及信号通路,为其渗透压调节机制的解析奠定基础。
欢迎来到三峡大学图书馆！
