关键词： 中华鲟   卵黄沉积及水解   饲料脂肪水平   基因克隆   基因表达  

摘要： 中华鲟(Acipenser sinensis)是我国特有的大型生殖洄游性鱼类,数量稀少。为更好的保护这一珍稀资源,中华鲟的人工繁殖工作很早就已经开展。但由于养殖过程中大多数中华鲟雌性个体始终无法突破生殖障碍由II期顺利过渡到III期,这给人工增殖工作带来很大的困难。因此,研究其卵巢发育的分子机制以及影响其卵巢发育的关键营养因子至关重要。本文系统地克隆了中华鲟卵黄沉积及水解关键基因的c DNA全序列,对其分子特征及功能进行了详细的分析。最后通过投喂中华鲟不同脂肪水平的饲料,根据卵巢的发育状况以及卵黄沉积及水解相关基因的表达情况来研究饲料中不同水平的脂肪对其卵巢发育的影响。研究结果如下:1.关于中华鲟卵黄沉积及水解关键基因的分子鉴定及表达分析本文首次较系统地克隆得到了6个中华鲟卵黄沉积及水解关键基因(vtgr,atp6v1c1,atp6v1h,ctsb,ctsd和ctsl)的c DNA全长序列,对其c DNA及氨基酸序列进行生物信息学分析发现,我们克隆得到的6条基因(vtgr,atp6v1c1,atp6v1h,ctsb,ctsd和ctsl)的序列全长分别是3640 bp,1638 bp,1751 bp,1317 bp,1483bp和1438 bp,包括的开放阅读框分别是2568 bp,1152 bp,1434 bp,1020 bp,1191 bp和1020 bp,分别编码855,383,477,339,396和339个氨基酸。与其他脊椎动物氨基酸序列比对结果显示:相似性分别为76.4-85.7%,93.2-97.1%,93-97.7%,75.9-83.2%,66.4-92.7%和71.5-87.9%,同源性分别为70.4-81.5%,88-93.5%,89.2-94.8%,68.5-78.2%,58.9-86.1%和63.2-80.5%。结构域分析显示:中华鲟VTGR的氨基酸序列含有8个半胱氨酸富集的配体结合域(LBD),5个低密度脂蛋白受体YWTD结构域,3个类表皮生长因子结构域(EGF),1个跨膜结构域(TM)以及1个胞内域(CD)。中华鲟ATP6V1C1的氨基酸序列包括了7个酪蛋白激酶II磷酸化位点、5个N-肉豆蔻酰化位点、4个蛋白激酶C磷酸化位点、2个酪氨酸激酶磷酸化位点、2个O-糖基化位点、1个酰胺化位点和1个膜螺旋。中华鲟ATP6V1H氨基酸序列包含5个重复结构和27个α螺旋结构。中华鲟CTSB氨基酸序列包含3个半胱氨酸蛋白酶的保守活性位点(C108,H278,N298),1个氧阴离子穴(Q),1个保守的N-糖基化位点,1个GCNGG保守序列和1个闭塞环。中华鲟CTSD氨基酸序列包含1个前体域、1个天冬氨酸蛋白酶结构域、2个活性位点、2个保守的N-糖基化位点。中华鲟CTSL氨基酸序列包含1个保守ERWNIN结构域、4个催化必须残基。时空表达的结果表明:这些基因在Ⅱ、Ⅲ期的卵巢中表达量相对比较高,在其他各组织中这些基因也均有差异性表达。氨基酸同源性分析、功能结构域分析以及系统进化树分析表明:中华鲟和雀鳝相关氨基酸序列的相似性以及同源性最高,亲缘关系最近。总而言之,这些基因在进化过程中是相对较为保守的,这为我们研究其生理功能以及分子机制奠定了基础。2.不同脂肪水平的饲料对中华鲟亲鱼卵巢发育的影响为研究饲料脂肪对中华鲟卵巢发育的影响,本研究分别用三种含不同脂肪水平(10%、14%、18%)的饲料进行性腺II期的中华鲟雌鱼培育。养殖一年后检测3组鱼的性腺发育推进程度以及卵黄沉积及水解相关的基因表达情况。结果表明:性腺分期的推进程度、卵巢厚度(d)以及卵巢区域比例(Po)都随着饲料中脂肪增加而增加,甚至在18%脂肪组中有2尾雌鱼卵巢直接进入III期。经卡方检验分析,性腺分期的推进程度与饲料中脂肪添加量显著相关。基因表达结果显示,饲料中脂肪显著上调了卵黄沉积及水解关键基因的表达水平。本研究初步解析中华鲟卵黄沉积及水解关键基因的分子特征及功能,为进一步探究中华鲟卵巢发育的分子机制奠定基础的同时也可以为研究亲鱼营养以及中华鲟的繁育与保护提供新的思路。

关键词： 中华鲟   性腺发育   血清代谢   养分沉积   能量代谢  

摘要： 自上个世纪八十年代葛洲坝等水利工程的修建以来,野生中华鲟数量急剧下降,为了保护中华鲟物种资源,中华鲟的人工繁殖早已开展。遗憾的是,人工繁殖中华鲟的雌性亲本性腺难以发育成熟,其背后的生理机制仍不清楚,温度、光照、营养等都可能是阻碍其性腺发育成熟的因素。本实验从亲鱼营养与代谢角度对性腺发育分别处于Ⅱ期、Ⅲ期和Ⅳ期的雌性中华鲟进行研究:首先对血清生化指标和代谢组学进行分析;然后进行肌肉组织学观察及相对脂滴含量分析,并分析卵巢(卵粒)组织学,卵巢能量(AMPK)代谢、脂代谢、卵黄蛋白沉积及精氨酸代谢相关基因表达。综合这两部分研究探明中华鲟雌鱼在卵巢发育期间的养分沉积、机体代谢响应及相关机制。结果显示:1在中华鲟卵巢发育Ⅱ期至Ⅳ期过程中,血清中总蛋白、甘油三酯、低密度脂蛋白以及大量氨基酸含量都在Ⅱ期和/或Ⅲ期较高,因此卵巢营养物质的蓄积可能主要是在Ⅱ期和Ⅲ期;在性腺发育至Ⅳ期左右,血清中脂氧素、叶酸生物合成相关代谢物、丙氨酸、组氨酸以及牛磺酸含量相对较高,这些物质可能在卵母细胞的最终成熟以及排卵方面发挥其特殊的生理功能。2在雌性中华鲟性腺发育II期至IV期过程中,卵母细胞体积剧烈增大,大量脂滴和卵黄蛋白沉积其中,同时肌肉切片中脂滴相对面积随着卵巢发育显著下降,表明肌肉中的脂滴有可能迁移到性腺。3卵巢中AMPK调控、脂代谢以及卵黄蛋白沉积相关基因表达情况证明,雌性中华鲟性腺发育II期至III期过程中,由于脂滴和卵黄蛋白的大量沉积,卵巢组织对能量的需求也随之增加,卵母细胞中脂质生成和脂质分解都处于活跃的动态变化中,以维持整体的代谢平衡。4精氨酸代谢相关基因表达情况证明,精氨酸可能是雌性中华鲟性腺发育过程中非常重要的氨基酸,这与其合成多胺类物质、合成肌酸等多种生理功能有关。本研究的开展可为探究中华鲟雌鱼性腺成熟的调控机制提供理论依据,并有助于解决雌性中华鲟卵巢发育障碍。

关键词： 中华鲟   种群生存力   栖息地适宜性   性比   种群资源量  

摘要： 中华鲟(Acipenser sinensis)是国家一级保护动物,其繁殖和生存受到越来越大的关注。2003年,世界上最大的水电站三峡工程建成并开始运行,改变了产卵场的水温和水文节律,对中华鲟种群产生了深远的影响。虽然自上世纪80年代以来,国内广泛开展了关于中华鲟的相关研究,但目前为止仍然缺乏有关三峡工程对中华鲟种群生存和繁殖的系统的、长时间尺度的影响研究。为探究中华鲟种群资源不断衰退原因,本研究结合中华鲟种群动态的时间变化,重点分析了中华鲟种群衰退的主导因素,以及中华鲟种群对栖息地环境变化的响应。并利用二维水动力学模型模拟了三峡工程对中华鲟栖息地适合度变化及其繁殖的影响;利用漩涡模型和种群矩阵模型模拟预测了环境变动下中华鲟的种群动态。本研究结果可为进一步保护中华鲟种群资源提供理论基础和科学支撑。主要研究结果如下:(1)中华鲟繁殖群体数量变动研究表明:人为活动对种群的影响在逐年加剧。而中华鲟繁殖群体资源量在加剧的人为活动影响下进一步下降,自2011年开始下降到50尾以下并仍逐年降低,根据50/500理论法则,种群将不能维持长时间的持续生存。(2)中华鲟栖息地研究表明:大坝运行至少需要达到10000 m3/s流量才能提供适合的中华鲟产卵环境,达到17000 m3/s时可为中华鲟提供最佳的产卵场条件。三峡工程蓄水引起中华鲟产卵场繁殖季节流量显著下降,导致中华鲟栖息地适宜性面积不断减小,限制了中华鲟的自然繁殖规模。栖息地适宜性的改变是2002年以后影响中华鲟繁殖的主要因素。因此,通过生态调度恢复中华鲟种群的栖息地适宜度是促进中华鲟种群恢复的重要手段。(3)中华鲟种群生存力研究表明:2010年以后,随着参与繁殖的雌鲟比例和雌雄性比的升高,种群增长率出现了升高的趋势。因此,雌雄性比的偏倚可能是中华鲟种群应对环境变化的生存对策。而对种群增长率影响最大的因素是雌鱼参与繁殖活动的比例,其次是捕捞影响,最后是雄雌性比。因此,通过生态调度提供最适的产卵场环境以达到最大数量的雌鱼参加繁殖活动是目前促进中华鲟种群自然恢复的最可行手段。(4)中华鲟种群瞬态动力学研究表明:中华鲟种群受到干扰后,种群动态在一定时期内波动,最终恢复到稳定水平。对于种群瞬态动力学而言,叠加的不确定因素延长了种群恢复到稳定水平的时间,2003年以后逐渐加剧的人为活动促使中华鲟种群变动幅度加剧。因此,三峡工程蓄水造成的中华鲟繁殖期产卵场流量变化以是造成中华鲟种群动态进一步下降的主要原因。干扰分析还表明增加20-30龄雌鲟个体数量或者促进这阶段雌鲟个体的生长是促进中华鲟恢复的最有效手段,而增加1-5龄的雌鲟个体则会促使种群进一步衰退。总之,三峡工程的运行使得中华鲟产卵场的适宜性下降,影响了中华鲟的繁殖活动。而三峡工程的影响叠加其他人为活动以及葛洲坝的影响,使得中华鲟种群恢复到稳定状态的时间延长,种群动态下降幅度增大,是近年中华鲟种群进一步衰退的主导因素。通过生态调度消除三峡工程运行的影响是维持中华鲟种群生存的最有效和最可行的手段。

摘要： 11月28日,农业农村部与中国长江三峡集团有限公司在湖北宜昌联合开展中华鲟增殖放流活动,共放流大规格子二代中华鲟150尾。农业农村部部长韩长赋、三峡集团董事长雷鸣山出席活动。韩长赋强调,要深入贯彻习近平生态文明思想,落实总书记重要指示精神,切实抓好中华鲟等珍稀物种抢救保护,加力推进长江水生生物保护工作,争取早日重现长江清水绿岸、鱼翔浅底的美丽景象。

关键词： 中华鲟   海水适应   生长   生理特性  

摘要： 中华鲟(Acipenser sinensis Gray),大型溯河产卵洄游性鱼类,属于国家一级保护动物。目前,中华鲟的自然繁殖活动已连续三年未监测到,自然资源急剧衰退,而中华鲟全人工繁殖技术的成功,使得不同年龄梯度的中华鲟初具规模,但中华鲟的保种养殖均以淡水为主,长期的淡水环境使中华鲟面临性成熟个体比例低、成熟个体小、繁殖力低、繁殖后代个体质量下降等诸多问题。由于中华鲟的生活史大部分在海水中,海水盐度对其生长发育的影响不容忽视。因此,海水养殖可能是中华鲟迁地保护的必然过程。为了揭示中华鲟幼鱼在自然盐度环境下的适应性和生理特性,以1.5龄中华鲟为试验材料,进行了为期120天的模拟降河与如海洄游试验,包括25天的海水驯化和95天的后续海水(25‰)养殖。在海水驯化过程中取4个时间点(第0、9、17、25天)和海水养殖过程中1个时间点(第120天)进行样品的采集,用于研究海水适应过程中中华鲟幼鱼生长性能、血液学参数、血清生理特征和组织器官结构的适应性变化,旨在获得中华鲟海水保种养殖的基础参数。主要研究结果由以下四部分构成:1.海水驯化和海水养殖过程中中华鲟幼鱼的生长性能在整个实验过程中,个体没有表现出明显的应激反应或异常行为。在海水组(SW)中观察到100%的存活率,而在淡水组(FW)中有一尾鱼死亡,表明人工繁殖的中华鲟具有一定的耐盐性。盐度对饵料系数(FCR)和肥满度(CF)的影响不显著(P>0.05),在海水驯化过程中,中华鲟的体重在海水组和淡水组两组中均逐渐增加,特定生长率在两组间差异不显著(P>0.05),然而,经过大约3个月的海水养殖,两组间的平均重量和特定生长率(SGR)有显著差异(P<0.05)。2.海水驯化和海水养殖过程中中华鲟幼鱼血液学参数的变化盐度对红细胞(RBC)数量的影响不显著(P>0.05)。但经过3个月的海水养殖后,海水组白细胞(WBC)数量明显增加(P<0.05),但淋巴细胞(LY)百分比在两组间的差异无统计学差异(P>0.05)。3.海水驯化和海水养殖过程中中华鲟幼鱼血清生化的变化随着海水盐度的变化,血清渗透压立即升高,在第9天时,血清渗透压首次显著升高,随后保持稳定。海水养殖3个月后,海水组血清渗透压明显高于淡水组(P<0.05)。Na和Cl的血清浓度变化规律和渗透压相似,而Ca和K的血清浓度变化不明显。海水组鱼的血清皮质醇浓度在盐度为9‰时达到最高值,随后下降到淡水水平,并保持在一个相对较低的水平,与随后海水养殖中的淡水组相似。盐度升高的过程中,生长激素(GH)含量没有明显的变化,但在17‰盐度后,海水组的含量增加得更大,并保持高于淡水组的水平在海水驯化过程中,海水组总蛋白(TP)含量逐渐降低,但经过3个月的海水养殖后,其总蛋白含量有所增加且高于淡水组。在整个实验过程中,血清总抗氧化能力(T-AOC)、总超氧化物歧化酶(T-SOD)和免疫球蛋白M(IgM)水平上均表现出相似的变化规律。海水驯化期间,两组间这三个指标水平上无显著性差异,但经过3个月海水养殖后,海水组总抗氧化能力和免疫球蛋白M水平显著性高于淡水组(P<0.05)。于此相反,海水组的总超氧化物歧化酶水平显著性低于淡水组(P<0.05)。4.海水适应过程中中华鲟幼鱼组织器官结构的适应性变化通过组织学观察发现,中华鲟幼鱼海水适应过程中,随着盐度的升高,鳃组织上的鳃小片宽度显著减小(P<0.05),相邻鳃小片间距、泌氯细胞直径显著增加(P<0.05);肾脏组织中的肾小球长径显著减小(P<0.05),同时数量也略有降低;而肠道组织结构未观察到明显的变化;脾脏组织中出现淋巴细胞聚集和黑色素巨噬细胞中心增多;肝脏组织中肝细胞胞质空泡化逐渐增多。

关键词： 中华鲟   青鱼   细胞系   dazl   PGCs   卵巢  

摘要： 鱼类细胞系作为理想的体外研究模型,已经成为鱼类生物学研究不可或缺的工具,各个物种不同组织特异性细胞系的分离将为该物种生理学、毒理学、病毒学、基因功能分析、种质资源保护及转基因等领域研究提供特异的、基础的、低成本的研究材料。中华鲟(Acipenser sinensis)是鲟属鱼类中个体最大,生活纬度最南的江海洄游性鱼类,由于过度捕捞、筑坝、航运和污染等人为活动导致中华鲟数量急剧减少,已濒临灭绝。此外,由于其体型巨大,生长缓慢,性成熟周期长等生物学特性导致其种群难以恢复。目前对中华鲟的研究主要集中在形态学、资源生态学和生殖生物学等方面,而在细胞生物学方面研究较少。建立中华鲟组织细胞系有两个重要原因:第一,在细胞水平上保护中华鲟种质资源,第二,中华鲟组织细胞系可作为体外研究模型,支持中华鲟细胞遗传学和生物学等方面的研究。本研究建立了青鱼(Mylopharyngodon piceus)鳍条及中华鲟精巢、肌肉、皮肤、肝脏、鳍条5种组织细胞系,分别命名为MPF、AST、ASM、ASSK、ASL和ASF。目前,MPF传至81代,5种中华鲟组织细胞系均传代到60代,6种细胞的适宜生长温度为28℃,均生长在含有10%FBS、10 ng/m Lβ-FGF、鱼血清和鱼类胚胎提取液的DMEM全培养基中,生长状态良好,MPF的细胞类型为上皮样细胞,中华鲟细胞类型主要为成纤维样细胞和上皮样细胞。染色体分析结果显示青鱼MPF染色体众数为48,属于正常的二倍体细胞;中华鲟细胞染色体众数为264,为多倍体细胞。MPF细胞系的线粒体16s r RNA序列分析结果与NCBI中青鱼的16s r RNA序列相似度高于99%。中华鲟细胞系的18s r RNA序列分析结果与NCBI中中华鲟的18s r RNA序列相似度也均高于99%,这些结果证明了细胞系的来源;通过脂质体转染法、杆状病毒转导法和电穿孔法测试了MPF、AST和ASM 3种细胞的转染效率:MPF的脂质体转染法和电穿孔法的瞬时转染效率分别为8%和24%;脂质体转染法和杆状病毒转导法对中华鲟细胞无效而电穿孔法有效,击穿电压200 V并且击穿时间10 ms时,对中华鲟细胞损伤最小且瞬时转染效率为15%。另外,利用睡美人转座子系统成功构建了转基因AST和ASM细胞系。对青鱼细胞系MPF,进行了基因表达检测和病毒敏感性分析,结果显示,在MPF细胞中存在干细胞标记因子nanog和oct4的表达,说明MPF可能为青鱼鳍条成体干细胞系;MPF细胞对鲤春病毒血症病毒(SVCV)病毒敏感,能产生病变效应,且SVCV可在MPF细胞中大量增殖。青鱼鳍条细胞系的建立不仅可作为研究青鱼基因功能和病毒致病机制的体外工具,为大型淡水鱼类的研究提供理想的体外模型,或许还可以为鱼类干细胞相关基因的功能研究提供材料。通过建立中华鲟细胞系,在细胞水平上保护了珍稀物种中华鲟的种质资源,通过筛选出中华鲟细胞最优的外源基因导入方法,使中华鲟细胞成为研究中华鲟基因功能的理想体外模型。生殖细胞的发育是生物生长发育、繁殖延续的一个重要且复杂的过程,对生殖细胞增殖分化的分子学机理的研究一直是生命科学的重要课题。Dazl是DAZ家族的重要成员,是生殖细胞的重要标记基因,其在大部分脊椎动物的两性生殖细胞中特异表达,其编码的RNA结合蛋白在生殖细胞的发育和分化过程中发挥着重要作用。青鱼是我国传统的“四大家鱼”之一,其体型大、生长快、口感好且营养价值高,是我国重要的人工养殖品种,但青鱼性成熟周期长,且人工繁殖难度较高。因此对青鱼生殖细胞标记基因dazl的鉴定,为研究青鱼生殖细胞的发育和性腺分化提供重要的工具和参考。本研究通过RACE技术在青鱼中克隆了dazl c DNA,序列全长2013 bp,编码216个氨基酸。蛋白序列比对结果显示,其含有RRM(RNA recognition motif)保守区域和一个DAZ重复序列,青鱼Dazl与斑马鱼(Danio rerio)的Dazl序列相似度最高,为85%。通过构建青鱼Dazl重组表达载体诱导Dazl蛋白并制备了兔抗Dazl多克隆抗体,经过验证Dazl抗体可以特异性的识别青鱼Dazl原核表达蛋白、卵巢组织内源蛋白和真核表达蛋白。在组织中,dazl只在青鱼的性腺中表达,组织原位杂交和免疫荧光结果均表明dazl在青鱼的早期卵母细胞中表达,主要分布在I、II和III期卵母细胞的细胞质中。在胚胎发育过程中,dazl在早期胚胎中表达量较高,随着胚胎的发育表达量逐渐降低,到原肠期几乎检测不到表达。整胚原位杂交结果显示dazl在早期胚胎的各个细胞中均表达。通过Tail-PCR技术扩增出1612 bp的青鱼dazl基因5’侧翼区启动子序列,并构建启动子不同区段的荧光素酶报告系统psi-CHECK-1612、psi-CHECK-938和psi

关键词： 长江鲟   中华鲟   细胞系   TLR1   TLR4   cathelicidin   NK‐lysin   表达模式  

摘要： 中华鲟(Acipenser sinensis)、长江鲟(Acipenser dabryanus)、白鲟(Psephuyrus gladius)是长江流域特有的鲟鱼,其中白鲟已宣告灭绝,中华鲟、长江鲟也处于不同程度的濒危状态。虽然人工繁殖有突破,但随着养殖规模的扩大,中华鲟、长江鲟在养殖过程中主要受到细菌性疾病的困扰,然而我们对抵御这些病原菌的免疫反应所涉及的分子机制知之甚少,也为鲟鱼的保护研究增加了一定的难度。作为国家保护动物,中华鲟、长江鲟资源数量较少,能作为科研用鱼更是有限。细胞系是研究免疫基因和免疫机制的有效途径之一,本研究针对上述问题,首先开展了中华鲟脾脏、肾脏和长江鲟鳍条组织细胞系的建立工作,在此基础上,对长江鲟免疫相关基因TLR1、TLR4和NK-Lysin、cathelicidin两种抗菌肽的克隆与表达模式进行了研究。取得的结果如下:(1)鲟细胞系的建立本研究分离培养了三种鲟组织细胞,能够连续传代,其中中华鲟脾脏组织细胞达到25代、肾脏组织细胞达25代、长江鲟鳍条组织细胞到67代。简要摸索了鲟细胞最适培养条件,其适宜温度为25℃,最佳培养基为M199。细胞的成功培养为后续相关实验开展提供了宝贵的材料,进一步达到保护鲟鱼资源的目的。(2)长江鲟TLR1和TLR的克隆与表达模式TLR(Toll-like receptor,Toll样受体)是硬骨鱼天然免疫系统中一类重要的PRR(pattern recognition receptor,模式识别受体)。然而关于TLRs的信息在最原始物种长江鲟中报道较少。本研究利用RT-PCR和RACE-PCR技术克隆了长江鲟TLR1和TLR4的全长基因。获得的TLR1全长2957bp,编码767个氨基酸,TLR4 c DNA全长2902bp,编码830个氨基酸。TLR1和TLR4都有几个典型的TLRs基序,包括信号肽、富含亮氨酸重复序列(LRR)基序、跨膜结构域和TIR基序。此外,TLR4在其TIR基序中含有3个保守域,参与TLRs信号转导。在TLR4中还发现了一个对识别哺乳动物TLR4的LPS很重要的脯氨酸。并分析了TLR1和TRL4的理化特性。实时荧光定量PCR结果显示,两种转录本均在11种正常组织中普遍表达,但表现出不同的表达模式,其中TLR1在心脏中高表达,TLR4在皮肤中高表达。此外,TLR1和TLR4基因在LPS和Poly I:C刺激后在头肾白细胞中表达上调,表明这两个基因都参与了长江鲟对LPS和Poly I:C的免疫应答,为进一步阐明鱼类TLRs的配体特异性和信号转导途径提供了基础。(3)Cathelicidin、NK-Lysin两种抗菌肽的克隆与表达模式抗菌肽(AMPs)是许多物种天然免疫反应的保守成分。在本研究中,从长江鲟中克隆了两个AMPs(分别为1576和606 bp)的c DNA序列。系统发育分析表明,这两个AMP与其他鱼类的同源蛋白序列聚在一起。NK-Lysin在胚胎发育早期高表达,表明存在母源表达。组织分布分析表明,cathelicidin在肝脏中表达最高,NKLysin在脾脏中表达最高。Poly I:C处理后,cathelicidin在诱导后12小时和24小时表达上调,而在72小时表达下调,NK-Lysin表达增加,在24小时达到高峰。LPS处理后,在6、24、48小时明显上调cathelicidin的表达,在6、12小时显著上调NK-Lysin的表达。这些结果提示,两种AMPs可能参与了Poly I:C或LPS刺激诱导的免疫应答。

摘要： 4月22日,在湖北省宜昌市的长江珍稀鱼类放流点,10000尾大大小小的子二代中华鲟回归长江怀抱,对自然环境中的中华鲟物种资源再做补充。这是自1984年首次放流以来,三峡集团中华鲟研究所连续实施的第62次中华鲟放流活动,也是自2009年首次开展中华鲟子二代放流以来,

关键词： 中华鲟   种群资源   遗传多样性   繁殖策略   增殖放流  

摘要： 中华鲟(Acipenser sinensis Gray，1835)是一种大型的溯河洄游性鱼类，近年来其野生种群数量急剧下降，对该物种的生存造成了严重威胁。特别是葛洲坝、三峡大坝等大型水电工程的修建，显著地改变了下泄江水的流量大小、水位涨落、水温升降等环境要素的自然节律，致使中华鲟繁殖需求的水文条件及产卵场栖息环境等遭到了破坏，再加上电捕等人为活动的影响，中华鲟的繁殖活动受到强烈的抑制。特别是在2013、2015、2017、2018，甚至2019年，葛洲坝下产卵场均未监测到中华鲟自然繁殖，中华鲟的繁殖状况令人担忧。目前，对中华鲟研究主要集中于种群资源调查，以及少数的家系遗传评估及个体生理生化水平工作，缺乏对中华鲟连续长期的遗传学监测研究，其个体繁殖成功率、交配体系等繁殖策略也缺乏研究。本研究采用微卫星、线粒体DNA分析，结合基础生物学资料，系统地对连续多年采集的中华鲟幼鲟样本进行遗传多样性及变化趋势分析，同时推测中华鲟的繁殖群体的动态变化及繁殖策略。此外，本研究还通过微卫星标记和环境DNA技术对中华鲟增殖放流状况及产卵场附近该物种的时空分布及活动特征进行了评估。主要研究结果如下:　　(1)测定了出生于2014年的15尾中华鲟幼鲟线粒体(mtDNA)全基因组，其序列全长为16524bp-16688bp，在不同个体间存在由重复序列差异引起的长度多态性。共检测到8个单倍型，单倍型多样性和核苷酸多样性较高(H:0.8760±0.0035)，π:0.0011±0.0010）。基于线粒体Cytb、COI基因的群体遗传多样性分析显示，2006-2015年度捕获的216尾中华鲟幼鱼的单倍型多样性和核苷酸多样性较低(H:0.392±0.037;π:0.0010±0.0057)。基于20对微卫星(SSR)分子标记对2006-2015年捕获的216尾野生幼鱼进行遗传多样性分析，结果表明，共获得等位基因228个，不同年度种群间的等位基因数量为4.0-9.55，平均值为8.19±1.94;基因型丰度平均值为96.94±0.077;不同年度观测杂合度及期望杂合度普遍高于0.7，表明中华鲟群体整体具有较高的遗传多样性。　　(2)基于20对SSR分子标记对2006-2015年误捕的216尾中华鲟幼鱼进行个体间亲缘关系鉴定，共检测出56对全同胞关系，15对半同胞关系。基于个体间亲缘关系及统计学分析发现，个体间繁殖成功率在2005-2009年，没有稳定性规律性表现，2010-2014年，为均匀性的繁殖成功。此外，同胞关系分析揭示了中华鲟为重复生殖的物种，其生殖间隔为2-6年。半同胞关系结合线粒体基因分析表明，中华鲟在交配制度上为多夫多妻的混交多配制。中华鲟现阶段的繁殖策略有利于维持其种群的遗传多样性。　　(3)依据2006-2015年误捕的中华鲟幼鱼样本，采用微卫星分析的方法，对实际繁殖群体数量(Nc')及有效繁殖群体大小(Nb)和有效群体大小(Ne)进行了估算。结果表明，有效繁殖群体大小(Nb:9-48)、有效群体大小(Ne:39-182)及实际繁殖群体数量(Nc':10-57)均较小。此外，动态变化结果分析显示2005-2014年中华鲟的繁殖群体大小与综合适宜度具有密切的关系。繁殖群体大小处于波动下降过程，实际繁殖群体大小下降61.40％。同时，基于同胞法估算的有效繁殖群体大小(Nbsib)与基于水声学调查的繁殖群体大小（Nc）比值范围为0.227～0.615，平均值为0.391;基于连锁不平衡法校正估算的有效群体大小（NeAdj）与基于水声学调查的繁殖群体大小（Nc）比值范围为0.236～2.528，平均值为1.151。　　(4)基于中华鲟线粒体全基因组序列，设计了一对可以用于水环境DNA(eDNA)监测的中华鲟引物，并使用数字PCR(DDPCR)建立了用于定量检测中华鲟eDNA的标准，其最小检测极限为0.17copy/μl。基于eDNA技术对葛洲坝江段中华鲟产卵场附近30km水域进行监测。结果发现，葛洲坝下、夷陵长江大桥、胭脂坝及古老背四个采样点均能检测到中华鲟的eDNA。基于线性混合模型对中华鲟产卵场的eDNA进行时空分布分析，结果表明，季节是影响其结果的最主要因素。eDNA浓度在8～9(10)月呈上升趋势，其中葛洲坝和夷陵长江大桥的eDNA浓度在9月达到高峰，胭脂坝和古老背的eDNA浓度在10月达到高峰。所有采样点的eDNA浓度在11-12月都迅速下降。此外，eDNA监测与水声学调查结果具有一致性(r=0.994)，均暗示了中华鲟种群数量较小。　　(5)基于微卫星数据发现，2016-2019四个年度增殖放流种群仍旧具备较高的遗传多样性，杂合度较高（He:0.785±0.095;Ho:0.721±0.178）。但增殖放流群体的整体平均等位基因数(p＜0.

关键词： 长江口   中华鲟   种群特征   标志放流   洄游   鱼类种间共现  

摘要： 本研究对长江口中华鲟自然种群特征、降海洄游习性,及其栖息地鱼类群落关系等方面开展长期跟踪监测和科学研究,并以此为基础,进行中华鲟标志放流、人工驯养、海洋中华鲟洄游及分布等保护研究,保护长江口中华鲟种群和海洋中华鲟种群,以延续中华鲟种群。主要研究内容和结果如下:1.人工驯养中华鲟野生幼鱼能够实现中华鲟个体救护、活体基因留存、种群多样性保存的中华鲟保护目的。2006年和2015年对误捕于长江口的160尾中华鲟野生幼鱼,开展人工驯养环境下的生物学特征研究。结果显示,2006年实验中华鲟,6～8月平均体长和平均体重分别从15.4±0.64cm和26±1.34g,增加到29.2±0.75cm和108±3.87g,日均增长1.54mm,日均增重0.9g。2015年实验中华鲟,经过3个月的人工驯养,平均体长和平均体重分别由14.90±0.22cm和22.25±1.34g,增加到28.32±0.84cm和148.65±3.02g,日均增长1.49mm,日均增重1.40g。拟合中华鲟幼鱼的体长与体重的关系分别为:W2006=0.1215L2.0313（R2=0.9457）、W2015=0.0086L2.9051（R2=0.996）,2015年人工驯养中华鲟幼鱼生长好于2006年的。当实验池水体水温超过24℃时,中华鲟幼鱼瞬时增长（重）率随水温升高而降低。人工驯养的野生中华鲟幼鱼个体体长、体重变异系数小,平均低于2.60%和3.66%,表明个体生长速度快、差异小、大小规格整齐,也说明了人工驯养的野生中华鲟幼鱼没有因为环境、饵料等变化而造成生长的停滞或缓慢。与同期野生环境下的中华鲟幼鱼比较,两者的生长存在差异性。总体上人工驯养环境下的野生中华鲟幼鱼生长状况要好于自然生长的。另外,实验中华鲟死亡率为5.0%,致死疾病包括肠炎、水霉病和细菌性烂鳃病。研究表明,野生中华鲟幼鱼对人工驯养环境具有较强的适应能力,生长速度快,便于驯化养殖,说明人工驯养野生中华鲟幼鱼有助于中华鲟的保护。2.2004-2018年,在长江口采样固定监测网监测和全年的随机调查的方式,共计监测到中华鲟幼鱼6600尾,中华鲟成体（年龄>8岁）有10尾,中华鲟亚成体（年龄为2-8岁）74尾。监测结果表明,2004-2018年长江口中华鲟幼鱼补充量呈连续下降的趋势,2014年后出现补充量断裂的现象。2014、2016、2018年均未监测到中华鲟幼鱼,从而更加证实了中华鲟自然繁殖行为从连续转为偶发的变化。2015-2018年中华鲟幼鱼在长江口的时空分布特征则与文献记载有所变化,出现了首现时间提前（近一个月）,终现时间延迟（约一个月）和出现时长由每年的5月到9月,变化成不连续年份的4月到10月的新特点,推论长江中可能形成新的产卵场,且距离长江口更近,或者中华鲟自然产卵时间提前。长江口中华鲟幼鱼多年平均体长为22.7cm,多年平均体重为99.0g,两者均呈逐年减少的趋势;长江口中华鲟幼鱼肥满度的变化规律和生长指数b的变化呈显著关系。从网具对中华鲟幼鱼的损害性分析,致死率由高到低的网具分别为定置张网（24.84%）、刺网（18.45%）、浮动张网（9.33%）、插网（3.05%）。通过长江口中华鲟幼鱼补充量、时空分布、生长特征等方面的变化研究,为长江口及长江流域中华鲟保护和管理提供了方向。3.2004年至2014年在长江口水域标志放流中华鲟12570尾,开展中华鲟降海洄游习性和海洋中分布的研究,以提高海洋中华鲟种群的保护能力。标志放流野生中华鲟872尾,人工繁育F1中华鲟11698尾,年龄包含1～25龄中的11个年龄段。2004-2009年以放流1龄人工繁育F1中华鲟为主,2010年以后逐步以放流大规格的6龄人工繁育F1中华鲟为主。放流前1个月开始对中华鲟实施盐度、摄食和波浪驯化,并逐步植入标志。放流中华鲟均进行了体内体外双重标志,标志类型包括射频综合标志（Passive Integrated Transponder tags,PIT）、体外银牌（Silver brand tag,SBT）、飘带（Plastic streamer tag,PST）、骨板标志（Plastic bone armor tag,PBT）、锚标（Plastic tipped dart tag,PDT）5种常规标志,以及脱落式卫星数据回收标志（POP-UP satellite archival tag,PAT）1种卫星标志。运输过程中,放流中华鲟采用单体充氧打包运输,放流时,使用连续活水放流槽和滑梯投放中华鲟,以减少中华鲟的伤害。研究结果显示:（1）共收集到24尾次常规标志中华鲟回捕信息,以及18尾PAT标志中华鲟的标志信息,常规标志回捕率为0.19%,PAT标志回收率为52.9%。（2）标志回捕或标志信息回收的时间在1～198