关键词:
中华鲟
长江鲟
运动性气单胞菌
肠道菌群
益生菌
摘要:
鲟形目(Acipenseriformes)鱼类是硬骨鱼纲中唯一现存的大型软骨硬鳞鱼类,具有极高的科学价值和经济价值。受过度捕捞、水利工程建设、栖息地破坏等人类活动的影响,全球27种鲟鱼类中已有25种处于不同程度的濒危状态。为拯救濒危的鲟鱼类,同时满足市场对鲟鱼子酱日益增长的需求,许多国家和地区先后开展了鲟鱼的人工养殖,全球鲟鱼养殖业蓬勃发展。自2003年以来,我国已经成为全球最大的鲟鱼养殖国。然而,随着鲟鱼种质资源的衰退和集约化养殖程度的不断提高,鲟鱼病害问题日益凸显,严重制约着濒危鲟人工保种及鲟鱼养殖业的可持续发展。本文主要针对湖北省3个养殖基地中华鲟(Acipenser sinensis)成鱼和幼鱼爆发的细菌性败血症,开展病原生物学、病理学、致病机制等方面的研究。同时,从健康的中华鲟和长江鲟(Acipenser dabryanus)肠道中分离筛选潜在的益生菌,以期为鲟鱼频发的细菌性疾病的防治提供科学依据。本研究采用的主要方法和得到的主要结果如下:1.2015至2017年间,湖北省3个养殖基地子二代中华鲟成鱼和幼鱼发生了严重的细菌性败血症。采用传统的病原菌分离培养方法,从濒死的中华鲟肝脏和脾脏中分离获得11株优势菌株。根据科赫法则人工感染健康的长江鲟,发现其中9株为致病菌,且从受感染的长江鲟肝脏中再次分离得到相同的病原菌。通过对菌株形态特征,生理生化特征,16S rRNA、gyrB、rpoD基因序列及系统发育树分析,确定9株病原菌均为运动性气单胞菌,且以维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)和嗜水气单胞(Aeromonas hydrophila)为主。另外,观察了长江鲟感染维氏气单胞菌和嗜水气单胞菌后的组织病理变化,并对2种病原菌进行了药物敏感性分析。组织病理学研究表明,长江鲟感染嗜水气单胞菌和维氏气单胞菌后表现出相似的病理特征,即肝脏实质细胞坏死、局灶性出血;脾脏红髓和白髓坏死;肾小球水肿、肾小管上皮细胞凝固性坏死;肠道粘膜脱落、结构完整性被破坏。药物敏感性试验结果表明,嗜水气单胞菌和维氏气单胞菌均对氟喹诺酮类、第三代和第四代头孢类抗生素敏感,而对苯唑西林、氨苄西林、青霉素等抗生素耐药。2.为探究嗜水气单胞菌和维氏气单胞菌对鲟鱼的致病机制,对长江鲟人工感染上述2种病原菌前后的脾脏组织进行转录组学分析。高通量测序共获得410996612条Clean reads,组装成26939820条Contigs,521713条Transcripts,254211条Unigenes。差异表达基因分析表明,嗜水气单胞菌感染组长江鲟的脾脏共有5574个显著性差异表达基因,其中2716个基因上调表达,2854个基因下调表达;维氏气单胞菌感染组长江鲟的脾脏共有1724个显著性差异表达基因,其中835个基因上调表达,889个基因下调表达,两组共有差异表达基因1087个。进一步分析表明,嗜水气单胞菌感染组长江鲟脾脏的差异表达基因主要富集于8条免疫相关的信号通路中,分别是Toll-like受体信号通路、吞噬体、细胞因子与细胞因子受体相互作用、溶酶体、肠道IgA产生的免疫网络、神经活性配体与受体相互作用、单纯疱疹感染和Jak-STAT受体信号通路;维氏气单胞菌感染组长江鲟脾脏的差异表达基因主要富集于5条免疫相关的信号通路中,分别是吞噬体、细胞因子与细胞因子受体相互作用、神经活性配体与受体相互作用、溶酶体和单纯疱疹感染。最后,随机挑选6个免疫相关的差异表达基因(LTBR、MHC2、Integrin、CD40L、V-type ATPase和CDH3)进行实时荧光定量PCR验证,发现荧光定量PCR与转录组分析结果的表达趋势基本一致,从而证明了转录组测序结果的可靠性。3.为探究嗜水气单胞菌感染对长江鲟肠道菌群的影响,采用Illumina Miseq高通量测序技术比较分析了嗜水气单胞菌感染组(患病组)和对照组(健康组)长江鲟肠道菌群的差异。基于Unweighted unifrac距离算法的主成分分析(PCoA)比较健康组和患病组长江鲟肠道菌群的结构差异。结果显示,健康组和患病组长江鲟的肠道菌群分布于不同的聚类群,表明嗜水气单胞菌感染对长江鲟肠道菌群结构造成了明显的改变。进一步分析表明,患病组长江鲟的肠道菌群Alpha多样性指数(Invsimpson index)显著性低于健康组(P<0.05)。群落组成分析表明,患病组长江鲟肠道菌群中梭杆菌门(Fusobacteria)、软壁菌门(Tenericutes)和拟杆菌门(Bacteroidetes)丰度明显高于健康组,而厚壁菌门(Firmicutes)和变形菌门(Proteobacteria)丰度明显低于健康组。最后,对健康组和患病组长江鲟肠道菌群中的差异物种进行组间Wilcox秩和检验分析。结果显示,患病