关键词： 异辛醇   黄曲霉   黄曲霉毒素B1   生长抑制   抑制机理  

摘要： 黄曲霉(Aspergillus falvus,***)可污染多种粮油农作物,包括玉米、小麦和花生等,造成它们的食用和经济价值降低。此外,***产生的黄曲霉毒素B1(AFB1)被国际癌症研究机构列为Ⅰ类致癌物,严重威胁到人和动物的生命安全。在课题组前人的研究成果中,发现一株枯草芽孢杆菌所产挥发性有机物质中的异辛醇具有稻谷防霉效果,但其抑菌效果和机理尚不明确。本文首先揭示了异辛醇对***的抑菌效果,接着对其生长和产毒的抑制机制进行初步探究,最后就异辛醇在高水分含量的玉米、小麦和花生储藏防腐中的应用进行了研究。主要的结果如下:1.通过平板对扣法和96孔板梯度稀释法两种不同的作用方式探讨了异辛醇对***的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC),接着研究了异辛醇对孢子萌发、菌丝体干重和菌落直径的影响。结果表明:异辛醇在熏蒸方式的平板对扣法和混入方式的96孔板梯度稀释法下对黄曲霉MIC分别为0.169μL/mL和6.25 μL/mL,这两种浓度下的异辛醇可以明显地降低孢子的萌发率、降低菌丝体干重和抑制菌落直径的再扩大。2.通过测定异辛醇对胞内物质泄露、电导率、麦角甾醇含量、细胞膜的完整性、活性氧含量、DNA损伤程度和AFB1的含量的影响,并结合SEM和TEM对细胞形态和微观结构进行观察,使用RT-qPCR技术分析了相关基因表达转录水平。结果表明:异辛醇处理后***的麦角甾醇含量降低,物质泄露严重,胞外电导率增加,细胞膜通透性增加,活性氧水平升高,DNA的损伤加剧,抑制AFBi含量的积累、麦角甾醇合成途径大部分相关基因、AFB1合成途径前期的调控基因aflD和全局调控因子LeaA、VeA和VelB基因进行表达下调,进而使得***生长和产毒受到阻碍。3.采用高水分含量的玉米、小麦和花生作为***的生长基质,在温度为28±2℃和湿度为75%的贮藏条件下,使用异辛醇熏蒸接种***后的玉米、小麦和花生,通过测定霉菌总数、脂肪酸值和AFB1含量,评价异辛醇熏蒸的防霉应用效果。结果表明:浓度0.169μL/mL的异辛醇就可以起到对玉米和小麦很好的防霉效果,同时异辛醇熏蒸可以显著抑制玉米、小麦和花生脂肪酸值的升高,有效降低AFB1的积累含量,从而可以延缓品质变劣的程度。

关键词： 蒽贝素,Embelin   多倍体癌细胞   耐药   白花酸藤果   抗癌药物筛选  

摘要： 【目的】 细胞的多倍体化普遍存在于癌症的发生、发展中,被认为赋予了癌细胞多种药物抵抗的能力,是临床治疗的一个难题。我们选用在人类癌症中过表达活跃的MYC和BCL-2基因,结合胞质分裂抑制构建多倍体细胞模型,在此细胞模型上对上千种富有抗癌活性的中药提取物进行筛选,致力于选出对多倍体癌细胞特异性杀伤,但对二倍体细胞或人体正常多倍体细胞无毒性的药物,并分析研究其对多倍体细胞致死作用机制。 【方法】 1.选用MYC和BCL-2双过表达这种频繁见于人类癌症的基因型,构建稳定表达的同源细胞系,之后通过抑制胞质分裂创建多倍体细胞模型。 2.在构建的多倍体和亲本二倍体细胞中进行高通量的筛选,得到能够只杀伤多倍体细胞,但对亲本二倍体细胞无明显毒性的中药提取物。 3.对筛选出来的中药提取物进行生物活性鉴定。 4.我们在多种基因型细胞中对筛选出来的药物进行毒性测试,并把该药物与多种结构相似、功能类似的化合物在模型细胞系中的进行多倍体选择性致死活性对比。 5.对筛选出来的中药提取物的作用机制进行研究。 【结果】 Aurora B激酶抑制剂AZD1152作用后,与RPE-MYC细胞相比,Bcl-2的过表达使71.8%的多倍体RPE-MYCBcl-2细胞存活下来,并且呈现出大核、双核或多核的多倍体表型。Bcl-2抑制剂YC137和BH3I-2能有效杀伤多倍体RPE-MYCBcl-2细胞但对二倍体细胞无损伤。其中,YC137杀死了超过90%的多倍体细胞。 在对各种细胞毒性药物和激酶抑制剂的毒性测试中只有钙蛋白酶抑制剂ALLN、雷帕霉素和PI3K抑制剂294002能优先杀死多倍体细胞,ALLN、雷帕霉素、294002对多倍体细胞的杀伤率分别为67.6%,39.4%,66.3%,其中294002对二倍体细胞的杀伤率达43.8%。 所筛选出的活性药物蒽贝素（Embelin）在多次实验中对多倍体RPE-MYCBcl-2细胞的抑制率为90.8%,但对二倍体细胞无明显毒性。与之相比,同为抗氧化剂的醌类化合物辅酶Q10和艾地苯醌对多倍体和二倍体细胞都没有杀伤力。在RPE-MYCAKT、RPE-MYCID1和RPE-MYCPI3K1074R等细胞系中无法复制Embelin在RPE-MYCBcl-2细胞中对多倍体的特异性杀伤效果。 Embelin没有在多倍体RPE-MYCBcl-2细胞中诱导LC3和caspase-3蛋白的活化,也没有诱导细胞色素C从线粒体内膜释放到细胞质中。同为XIAP抑制剂的AZD5582和SM-164对多倍体RPE-MYCBcl-2细胞有浓度依赖的细胞毒性,在所测试的最高浓度中,AZD5582杀死了80.3%的多倍体细胞,SM-164杀死了70.1%的多倍体细胞,并且它们对二倍体细胞都没有明显的杀伤性。对RPE-MYCBcl-2细胞进行XIAP蛋白的RNA干扰试验后,多倍体细胞和二倍体细胞都没有观察到明显的死亡。 【结论】 本研究对临床癌症耐药的治疗创建了新的研究系统,筛选出了能特异性的杀伤多倍体癌细胞的中药提取物Embelin。Bcl-2的过度表达可保护二倍体细胞免受Embelin的细胞毒性影响,但对多倍体细胞无保护作用。Embelin通过非Bcl-2抑制途径对多倍体细胞选择性致死,其作用机制不是通过简单的抗氧化活性,也没有诱导经典的细胞凋亡和自噬,对XIAP蛋白的抑制可能是作用的关键,需要进一步研究。

关键词： 中药制剂分析   教学改革   中药传统技能竞赛   实验教学   教学模式   考核评价  

摘要： 针对职业院校中药制剂分析传统实验教学模式存在的教学方式陈旧、实验内容缺乏探索性、教学评价方式单一、课程思政缺失、学生学习主动性差等问题，融合全国职业院校中药传统技能竞赛，构建“一中心四层次”—“线上+线下”和“三个结合”为一体的教学与考核评价新模式，并合理融入课程思政。新模式下学生在全国职业院校中药传统技能竞赛、大学生创新创业大赛、实习就业等方面取得了不错的成效，真正达到了“赛教融合”的效果。该模式可作为提升中药制剂分析教学质量和全国职业院校中药传统技能竞赛成绩的一种借鉴。

关键词： 纳米抗体   黄曲霉毒素B1   磁分离化学发光免疫分析   生物素/链霉亲和素定向偶联策略   侧流免疫层析  

摘要： 目的:黄曲霉毒素B1（AFB1）因其毒性和致癌性已被世界卫生组织癌症研究机构列为Ⅰ类致癌物。由于缺乏有效的脱毒手段,食物链积累成为AFB1威胁人类健康的主要途径。为确保食品安全,薄层色谱法、质谱法等分析方法常用于AFB1检测。但该类方法存在样本前处复杂、操作步骤繁琐、检测耗时长等缺点,难以满足现场、即时检测分析的需求。因此,本研究致力于开发以纳米抗体为基础的AFB1检测分析方法,以满足AFB1现场检测的需求。方法:1.抗AFB1纳米抗体噬菌体展示文库构建及VHH筛选。采用黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白（AFB1-BSA）完全抗原免疫健康双峰驼。以免疫双峰驼的外周血淋巴细胞为起始材料,设计简并引物,获取重链抗体基因片段,并以此为模板获取VHH基因片段。通过优化基因片段与质粒连接比例、电转化流程构建噬菌体展示VHH文库。利用噬菌体展示VHH筛选技术,通过逐轮递减抗原浓度、加大洗涤压力等筛选措施,有效富集特异性识别AFB1的阳性克隆噬菌体。之后将VHH基因克隆进入质粒,重组质粒通过原核表达系统实现VHH的可溶性表达。将筛选VHH基因序列输入Rosstta DOCK软件进行计算机分子对接验证。2.基于筛选的特异性高亲和力VHH,开发快速、稳定的磁分离化学发光免疫检测分析法用于检测谷物及其制品中的AFB1。设计引物调取大肠杆菌碱性磷酸酶（Alkaline Phosphatase,ALP）基因片段,ALP基因片段与VHH基因片段通过柔性肽连接,克隆至表达质粒,经原核表达制备ALP-VHH融合蛋白。基于环氧基与巯基的开环反应,制备AFB1-BSA修饰免疫磁珠。通过优化融合蛋白工作量、免疫磁珠粒径、反应时间、反应缓冲液酸碱度与盐离子浓度等检测条件提高检测分析灵敏度和稳定性。在最佳反应条件下,建立磁分离化学发光免疫检测法的竞争标准曲线,选择AFB1结构类似物与功能类似物评估该方法特异性。最后选择玉米、燕麦等加标样本验证其实际样本检测分析能力。3.开发基于生物素/链霉亲和素（Avi/streptavidin,Avi/SA）定向偶联策略的纳米抗体侧流免疫层析试纸条（VHH-LFIA）用于检测AFB1。通过酶联免疫吸附实验（Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）比对VHH与鼠抗AFB1单克隆抗体（Mouse anti-AFB1 m Ab）的有机溶剂、酸碱度、温度等耐受性,以确保VHH在复杂检测环境条件下的抗干扰能力。设计引物将VHH基因片段与Avi Tag基因片段通过柔性肽拼接,克隆至表达质粒,经原核表达制备VHH-Avi Tag融合蛋白。将AFB1-BSA完全抗原喷涂为试纸条检测线（Test line,T-line）,Biotin-BSA喷涂为试纸条质控线（Control line,C-line）制备检测试纸条。采用Avi/SA定向偶联策略,以量子点（Quantum dots,QDs）作为信号元件制备VHH-Avi/SA@QDs免疫检测探针,同时制备基于碳化二亚胺（EDC/NHS）随机偶联法的VHH@QDs免疫检测探针,比对二者检测分析能力。建立通过智能手机拍照的灰度比对信号输出策略。优化QDs粒径、T-line上AFB1-BSA工作浓度、反应缓冲液酸碱度、反应缓冲液甲醇浓度、反应缓冲液吐温-20浓度等检测条件。从灰度比对定量分析与裸眼观察定性分析两个角度确定本方法的检测灵敏度与稳定性。在最佳反应条件下,建立VHH-LFIA竞争标准曲线,选择AFB1结构类似物与功能类似物评估该方法特异性。为评估Avi/SA定向偶联策略的适用性,使用Au NPs作为信号元件替代QDs,制备VHH-Avi/SA@Au NPs免疫检测探针。通过加速老化实验评估VHH-LFIA稳定性,并与基于m Ab的商品化AFB1检测试纸条进行甲醇、温度、盐离子耐受性比对。最后选择燕麦加标样本验证其实际样本检测分析能力。结果:1.成功构建噬菌体展示纳米抗体文库。实验结果显示:构建噬菌体展示纳米抗体文库,经计算库容量达到6×10～7 CFU/mL;同时经基因测序多样性分析,纳米抗体库具有良好的多样性。从纳米抗体库中成功筛选制备3株特异性抗AFB1纳米抗体,分别命名为VHHC8、VHHE10、VHHE12。分别建立3种纳米抗体的标准曲线,实验结果表明VHHC8和VHHE10表现出对AFB1的高灵敏度,半抑制浓度(IC50)分别为0.969 ng/mL和1.349 ng/mL,线性范围分别为0.286～4.185 ng/mL和0.33～4.487 ng/mL;VHHE12灵敏度低于VHHC8和VHHE10,IC50为4.069 ng/mL,但其线性范围更宽,为1.00～11.141ng/mL,可适用于开发应对不同浓度AFB1限量标准的分析方法。分子对接

关键词： 黄曲霉毒素B1   骨碎补总黄酮   肉鸡   抗氧化   肠肝轴   胆汁酸代谢   铁死亡  

摘要： 黄曲霉毒素B1(Aflatoxin B1,AFB1)已被国际癌症研究机构评估为已知毒性最强的化学致癌物之一,肝脏是其主要靶器官。此外,胃肠道作为接触霉菌毒素的直接器官,AFB1暴露会损伤其黏膜屏障功能,破坏肠道菌群结构。肠道菌群的平衡对动物消化吸收、免疫调节等至关重要。因此,维持肠道菌群稳态可能是改善AFB1毒性损伤的潜在途径。中药提取物骨碎补总黄酮(Total flavonoids of Rhizoma Drynariae,TFRD)是从蕨类植物的干燥根茎中提取的天然黄酮类化合物,其对AFB1诱导的肉鸡肝脏损伤具有一定保护作用。因此,本试验旨在探讨AFB1诱导肝脏损伤的作用机制及TFRD的改善作用。本试验以90只1日龄爱拔益加(AA)肉鸡为受试对象,肉鸡适应性饲养3周后,随机分为3组:对照组(CON)、AFB1组、AFB1和TFRD共处理组(A+T)。其中,AFB1组和A+T组嗉囊注射AFB1(100μg/kg体重,溶于4%乙醇),连续7 d,建立AFB1暴露模型。CON组嗉囊注射等量的4%乙醇,饲喂基础日粮;A+T组肉鸡在基础日粮中添加125 mg/kg的TFRD。探究AFB1对肉鸡肝脏损伤的毒性机制,以及TFRD通过调控肠-肝轴对AFB1诱导的肝损伤的保护作用,主要研究内容与结果如下:(一)探讨TFRD对AFB1暴露肉鸡肠道微生物稳态及肠道屏障的改善作用。对各组肉鸡十二指肠内容物进行16S r RNA测序分析,发现TFRD能够改善AFB1暴露引起的肠道微生物紊乱,且与胆汁酸代谢相关的微生物粪杆菌属(Faecalibacterium)、罕见小球菌属(Subdoligranulum)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、瘤胃球菌属([Ruminococcus])在组间差异显著(p<0.05)。同时,补充TFRD有效改善了十二指肠肠道的形态结构损伤,通过增加隐窝杯状细胞的数目和黏蛋白MUC2的mRNA表达(p<0.05),以及紧密连接蛋白Occludin和Claudin-1的mRNA和蛋白表达水平(p<0.05),从而改善肠道屏障。(二)探讨胆汁酸代谢在AFB1暴露下的参与作用。本试验采集肉鸡血浆样品,利用广泛靶向代谢组学技术,研究不同处理条件下血浆样本之间的代谢产物差异。结合UPLC-MS/MS检测平台、自建数据库和多元统计分析方法,在CON组、AFB1组和A+T组的血浆中共鉴定出773种代谢产物。将鉴定出的代谢物进一步分析,在CON组与AFB1组共筛选出34个显著变化的代谢物,其中有15个上调,19个下调;在AFB1组和A+T组共筛选出57个显著变化的代谢物,其中17个上调,40个下调。KEGG富集分析差异代谢物,发现CON组和AFB1组差异代谢物主要富集在5-羟色胺能突触、花生四烯酸代谢、鞘脂信号通路、脂肪酸生物合成等通路;AFB1组和A+T组差异代谢物主要富集在初级胆汁酸生物合成、亚油酸代谢、胆汁分泌和硫代谢等通路。将CON和AFB1组,AFB1和A+T组间具有显著差异的共同代谢物作为潜在的生物标志物并进行韦恩分析,结果发现有9个共同差异代谢物,包括肌酸、3-N-甲基-L-组氨酸、L-肉碱、刺桐碱、三乙醇胺、L-酪氨酸甲酯4-硫酸盐、牛磺石胆酸、丙氨酸酪氨酸、肉碱C8:0。其中次级胆汁酸牛磺石胆酸在AFB1暴露后呈上升趋势,补充TFRD后显著下降(p<0.05)。另外,刺桐碱的相对含量在AFB1暴露后也显著增加(p<0.001),补充TFRD后显著下降(p<0.001)。提示两者在AFB1暴露肉鸡血浆代谢物中可能发挥解毒作用。此外,通过皮尔逊相关性分析发现差异血浆代谢物与肠道微生物密切相关,如牛磺石胆酸与瘤胃球菌属([Ruminococcus])、乳酸杆菌属(Lactobacillus)呈显著正相关(p<0.05),与罕见小球菌属(Subdoligranulum)呈显著负相关(p<0.05),进一步证明肠道微生物的紊乱影响胆汁酸代谢。(三)探讨TFRD缓解AFB1诱导的肝损伤的分子机制。在以上试验结果基础上,本试验分别检测了抗氧化酶活性水平以及脂质代谢关键调节因子和铁死亡关键基因的mRNA表达水平。首先TFRD有效缓解AFB1诱导的肝脏病理损伤,降低丙氨酸转氨酶(ALT)(p<0.001)和天冬氨酸转氨酶(AST)(p<0.01)活性,增加超氧化物歧化酶(SOD)(p<0.01)、谷胱甘肽过氧化物酶1(GPX1)(p<0.01)和过氧化氢酶(CAT)(p<0.05)活性,降低氧化产物丙二醛(MDA)水平(p<0.01),提高抗氧化能力。另外,肝脏油红染色显示AFB1组脂质严重聚积(p<0.001),且血清总胆固醇(TC)(p<0.01)和甘油三酯(TG)(p<0.001)均升高,提示脂质代谢异常,而补充TFRD有

关键词： 医疗机构中药制剂   传承创新发展   法治保障   完善路径  

摘要： 医疗机构中药制剂,特别是作为“独家秘方”的中药复方制剂,是我国医疗卫生行业的特色产物,作为市售药品的补充,其“简、便、验、廉”的特点有效地满足了病患的需求、弥补了市场空缺,在疾病治疗中发挥无可取代的作用。但其行业自建国以来从产生、发展到萎缩,走到如今,医疗机构中药制剂行业在困境中徘徊,如何通过传承创新发展的法治保障举措促进医疗机构中药制剂行业发展亟需进一步的系统研究。第一章首先从医疗机构中药制剂的来源与发展入手,介绍了与医疗机构中药制剂相关的概念释义与医疗机构中药制剂的监管历程,分析了医疗机构中药制剂行业受国家政策影响在各个时代发挥的作用与发展状况。对医疗机构中药制剂相关的政策法规颁布情况进行梳理,将医疗机构中药制剂发展进程分成四个历史时期——鼓励发展期(1950-1985)、蓬勃发展期(1985-2000)、规范发展期(2000-2010)、创新发展期(2010-至今)。在鼓励发展期,由于市场上药品稀缺,因医疗机构中药制剂能满足临床用药需求,故政策上和实践中对制剂的要求并不那么严格设限,医院都在大力开发和制作医疗机构中药制剂;在蓬勃发展期,出于改革开放与市场经济体制改革带来了医院效益机制的转变,作为医院的特色,医疗机构中药制剂获得了医院的大力支持,剂型和品种均有极大的创新与发展;但在蓬勃发展的同时,医疗机构中药制剂的质量和不良反应事件频发,名为院内制剂却在院外肆意流通,引起药品管理的混乱,人民医疗安全不能得到保障;在2000后,国家就开始对医疗机构中药制剂室设限,通过设置门槛与标准来规制医疗机构中药制剂的发展;后因政策出台的标准过于严苛,医疗机构中药制剂行业发展一蹶不振;后为促进中医药事业与中药新药的研究与发展,国家发布促进医疗机构中药制剂传承创新的政策,医疗机构中药制剂行业逐渐恢复生机。第二章北京市医疗机构中药制剂法规政策梳理与现状分析。目前北京市医疗机构中药制剂行业发展是较为缓慢的,通过梳理法规政策,指出北京市颁布的法规政策体系存在的一些问题与漏洞。其一,在传承方面,北京市《中医药条例》当中相关鼓励政策较少,法规修订不及时,北京市名老中医经验方评估开发保护机制阙如;其二,在创新方面,北京市发布的促进政策缺乏产业思维,虚置立法空间,知识产权保护体系缺位,致使新药转化动力不足;其三,在发展方面,北京市医疗机构中药制剂监管运行机制缺乏动态、连续的监管,法规规制目标单一,难以回应现实需求。第三章传统药物规制模式的法治考察与经验借鉴。介绍分析了日本、印度、欧洲、韩国等地的传统药物规制模式与药物注册简化办法,总结出可供我国借鉴的经验与规律。包括设置相对独立的规制机构与分类监管等级、知识产权保护的专门化和尊重对历史经验和规律的总结,简化传统药物的注册管理等。第四章促进北京市医疗机构中药制剂行业传承创新发展的法治保障路径构建。从重塑医疗机构中药制剂行业法治保障原则与思路出发;在传承方面,法治引航做好北京市医疗机构中药制剂传承工作;在创新方面,建立医疗机构中药制剂研发激励机制、完善符合中药院内制剂特点的知识产权保护机制;在发展方面,建立质量标准,及时修订更新监管规范等;在配套保障方面,多措并举以法治力促北京市医疗机构中药制剂传承创新发展等五个方面,提出对策建议,寻求多主体、多层次的合作治理以强化法治保障能力。

关键词： 粗棕榈油   黄曲霉毒素B1   赭曲霉毒素A   啶虫脒   苏丹染料   表面增强拉曼光谱学   纳米传感器   化学计量学   模式识别算法  

摘要： 粗棕榈油(CPO)作为一种用途广泛的食用热带植物油,以其独特的营养价值和低成本在食品加工、工业生产et al领域广受欢迎。然而,随着CPO市场的不断扩大,质量和安全问题引起了人们的极大关注,非法食品添加剂、农药残留和霉菌毒素污染et al问题给消费者带来了重大健康风险,故加强市场食品监督和检测对于解决这些健康问题至关重要。目前我国已经制定标准技术手段用于食品中危害成分的定性判别及定量检测。然而,这些常规检测技术依旧存在一些明显的局限性,包括仪器设备和试剂昂贵,操作复杂以及测试时间较长et al,因此亟需开发出高效便捷的方法。表面增强拉曼光谱分析技术(SERS)以其传感器多样性,超高灵敏度和独特的指纹特性et al原因被广泛成为理想替代方法应用于检测领域。本研究基于SERS结合化学计量学技术,构建高效、快速、经济、无损、灵敏、选择性和便携的检测方法,成功实现CPO中痕量危害物(食品添加剂、农药、霉菌)的检测。主要的研究内容如下:1.基于SERS结合化学计量学定性判别模型的CPO中染料掺假研究。针对传统的CPO中掺假的染料检测方法存在的检测时间长,设备维护费用贵et al问题,本章以苏丹红II和苏丹红IV染料为研究对象,基于SERS与化学计量学的结合成功开发出一种新渠道实现CPO中苏丹红染料掺假的快速准确检测。首先合成中空的金银纳米花作为增强基底,继而将其与不同浓度的(0.005 ppm–4 ppm)苏丹染料的CPO样品孵育,采集SERS光谱,基于主成分分析法分别辨别CPO中的苏丹红II和苏丹红IV,前三个主成分贡献率总和达到了99.88%和99.90%。此外,线性判别分析(LDA)和K最近邻(KNN)算法证明了CPO中苏丹II和IV染料的高检测率。本研究开发的Au@Ag SERS传感器对苏丹II和IV染料的检测线低至0.0028 ppm和0.0019 ppm。结果表明,本研究开发的具有快速、灵敏和低成本特性的SERS技术为CPO和其他食用油的品质检测提供了重要研究基础,并有望在未来广泛推广。2.基于SERS结合多变量分析模型的CPO中多种苏丹红含量检测掺假研究。针对CPO中多种染料掺假难以定性定量的问题,本章以四种苏丹红染料(I-IV)为研究对象,开展了基于SERS技术的CPO中多种染料同时定量检测研究。首先合成双金属金银核壳纳米花作为SERS增强基底,将合成的纳米基底分别与CPO中四种苏丹红染料(I-IV)混合,采集SERS光谱。采用偏最小二乘(PLS)、蚁群优化-PLS(ACO-PLS)模型和遗传算法-偏最小二乘(GA-PLS)模型分别构建SERS光谱与四种苏丹红染料浓度之间的定量关系模型。结果表明,对于苏丹I、II、III和IV,GA-PLS模型的校准系数(Rc)值分别为0.9844、0.9865、0.9884和0.9888。此外,苏丹I、II、III和IV的实际样品回收率分别为88.0-113.0%,92.0-103.0%,91.2-98.5%and 97.0-109.5%。结果表明,本研究开发的具有快速、灵敏和低成本特性的SERS技术为CPO和其他食用油的品质检测提供了重要研究基础,并有望在未来广泛推广。3.基于SERS结合化学计量学技术的CPO中农药残留检测研究。针对CPO中农药残留检测需求量大,检测速度要求高et al问题,本章以啶虫脒(ACE)农药为目标,开展基于SERS结合化学计量学技术的CPO中农药残留检测研究。本研究以银纳米作为增强基底,与不同浓度(5–100 ng/g)的ACE样本混合,采用三种不同的变量筛选方法以筛选出鲁棒性较强的预测模型:连续投影算法-偏最小二乘法(SPA-PLS)、随机跳蛙-偏最小二乘法(RF-PLS)和无信息变量消除-偏最小二乘法(UVE-PLS)构建SERS强度与ACE浓度的定量检测模型。结果表明,RF-PLS模型表现出最优的预测性能,Rc值为0.990,预测系数(Rp)值为0.989,RMSECV(交叉验证的均方根误差)值为4.74,RMSEP(预测的均方根误差)值为5.17。最后,基于加标回收实验,RF-PLS模型的回收率介于93.89%和108.32%之间,结果表明该方法可用于ACE残留的定量检测。4.基于表面增强拉曼散射技术(SERS)结合化学计量学的原油棕榈油(CPO)中霉菌毒素的检测研究:具体来说,该研究侧重于使用Qu ECh ERS(快速,简便,廉价,有效,耐用,安全)提取方法和SERS技术来构建定量预测模型,检测原油棕榈油(CPO)中的黄曲霉毒素B1(AFB1)。首先合成金纳米粒子(Au NPs)作为SERS信号基底,与萃取后不同浓度的加标样品共同孵育,在最优条件下采集SERS信号,基于信号强度与目标浓度建立自举软收缩-偏最小二乘(BOSS-PLS)预测模型。结果

关键词： 黄曲霉毒素B1   骨碎补总黄酮   肉鸡胸肌   肉品质   拉曼光谱   代谢组学  

摘要： 鸡肉是人类膳食结构中非常重要的蛋白质来源,以其高蛋白、低脂肪、相对低廉的价格等特点深受消费者的青睐。然而,因饲料原料储存不当等原因导致的饲料霉变问题一直困扰着家禽养殖业的健康发展。以往研究报道饲料霉变的问题不仅影响家禽自身的健康,还威胁着禽肉的品质。黄曲霉毒素B1(AFB1)是一种引起饲料霉变最常见的食源性霉菌毒素,可能在农产品的生产、储存和运输等多个过程中产生,且分布广泛、不易去除。中草药以其纯天然、高效低毒的特点,在肉鸡饲养过程中作为饲料添加剂得到了广泛的利用。其中,骨碎补总黄酮(TFRD)作为中草药骨碎补的主要提取物,具有免疫调节、抗炎、抗氧化等多种药理活性,可能在降低AFB1毒性,改善家禽肌肉品质等方面发挥着潜在作用。因此,本研究重点研究AFB1对动物源性食品中肉品质的毒性作用,以及TFRD如何降低AFB1的毒性作用。将160只21日龄爱拔益加肉鸡(AA肉鸡)随机分为对照组(CON组)、黄曲霉毒素B1组(AFB1组)、骨碎补总黄酮组(TFRD组)和治疗组(AFB1+TFRD组),每组4个重复笼,每个重复笼10只鸡,试验周期为7天。研究一:AFB1对肉鸡胸肌肉品质影响及TFRD治疗效果的研究选取21日龄AA肉鸡为试验动物,通过嗉囊注射50μg/kg体重剂量的AFB1进行暴露并通过基础饲粮中添加125 mg/kg剂量的的骨碎补总黄酮进行治疗,观察临床症状,对肉品质相关指标进行检测。结果如下:(1)肉鸡进行AFB1暴露后,AFB1组胸肌比重显著高于CON组肉鸡胸肌比重(p<0.05),AFB1组胸肌的品质参数(如:肉色、p H、滴水损失)有所改变,胸肌肉色亮度L值相较于CON组发生显著性的下降(p<0.05),24小时后AFB1组肉样的p H值显著高于其余三组(p<0.05),AFB1组滴水损失相较于TFRD组有显著性升高(p<0.05)。(2)肉鸡进行AFB1暴露后,低频核磁共振试验发现CON组相比AFB1组胸肌中不流动水显著增加(p<0.05),质构分析中发现AFB1组胸肌质地(如:硬度和弹性)相较于对照组发生显著性下降(p<0.05)。(3)TFRD具有治疗效果,能够有效恢复胸肌的质地,改善胸肌肉品质,TFRD组胸肌肉色黄度b*值相较于CON组发生显著性的下降(p<0.05),AFB1组滴水损失相较于TFRD组有显著性升高(p<0.05),TFRD组相较于AFB1组质构分析中硬度、弹性、胶着性、咀嚼性、回复性都有显著性的上升(p<0.05)。研究二:基于代谢组学研究AFB1及TFRD对肉鸡胸肌代谢物影响选取CON组、AFB1组、TFRD组和AFB1+TFRD组胸肌样本进行代谢组学分析,所有数据分析均基于武汉迈特维尔生物科技有限公司自建的MWDB数据库。对鉴定的代谢物进行PCA分析、三元分析和KEGG富集分析。此外,筛选差异代谢物并通过皮尔逊相关性(Pearson)检验,分析肉品质相关参数与各组间差异代谢物之间的关系。(1)基于广泛靶向代谢组技术分析,共检测到762个代谢产物。OPLS-DA分析显示各组样本有明显分离,AFB1对肉鸡胸肌代谢造成了严重的干扰。(2)试验组之间明显不同的代谢物进行KEGG富集分析的结果显示,AFB1暴露引发代谢物主要在初级胆汁酸生物合成、赖氨酸降解、亚油酸代谢、胆固醇代谢和胆汁分泌方面富集。此外,补充TFRD后代谢物主要富集在氨基酸代谢、能量代谢和脂质代谢方面。(3)胸肌差异代谢物与肉品质密切相关,异亮氨酸-精氨酸和精氨酸-亮氨酸与肉色-a*呈正相关(p<0.05)。胸肌p H值与异亮氨酸-精氨酸、精氨酸-亮氨酸和丙氨酸-酪氨酸明显正相关(p<0.05)。剪切力和牛磺鹅去氧胆酸之间有明显的正相关(p<0.05)。(4)肉鸡进行AFB1暴露后TFRD补充可能影响肉鸡胸肌的蛋白质二级结构,拉曼光谱检测发现胸肌肌肉的纤维二级结构,AFB1组的ɑ-螺旋结构的含量明显高于AFB1+TFRD组(p<0.05)。研究三:AFB1引起的胸肌氧化损伤及TFRD的治疗效果的研究为探究氧化应激和炎症损伤在AFB1暴露引起肉品质损伤中的作用机制,采用肉鸡血浆进行氧化标志物和抗氧化酶活性的检测,并采用RT-q PCR检测胸肌组织抗氧化和炎症因子相关基因的表达水平。与代谢组筛选差异性代谢产物进行皮尔逊相关性分析,进一步探究差异代谢物与氧化炎症相关参数之间的潜在关系。(1)肉鸡进行AFB1暴露后,氧化应激与炎症相关指标发生了变化,添加TFRD可以逆转AFB1对肉鸡胸肌炎症和氧化应激的影响,与AFB1组相比,AFB1+TFRD组的肉鸡胸肌中SOD和CAT表达水平明显升高(p<0.05),与AFB1组相比,AFB1+TFRD组的肉鸡胸肌中炎症因子IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α的m RNA表达明显下降(p<0.0

关键词： 纳米酶   快速检测   胆固醇   过氧化钙   黄曲霉毒素B1  

摘要： 随着纳米科学与技术的发展,基于无机纳米材料的新型人工模拟酶（纳米酶）受到越来越多的关注,与天然酶相比,纳米酶具有反应条件温和、设计灵活、易修饰及稳定性高等独特优势。本文设计和合成了不同复合材料的纳米酶,探究了影响它们类酶活性的因素,并利用纳米酶优异的性质实现了对食品中胆固醇、过氧化钙和黄曲霉毒素B1的精确检测,旨在发掘具有高活性的纳米酶,从而实现更灵敏、快捷、经济的食品快速检测方法。本研究取得的主要成果如下:1.设计并组装了一种介孔二氧化硅修饰的磁性纳米颗粒（Fe3O4@Si O2）,该纳米颗粒具有内在的类过氧化物酶（POD）催化活性。介孔Si O2可以保证纳米酶具有灵活的尺寸、良好的分散性和稳定性。对合成的Fe3O4@Si O2类POD样特性及最佳反应条件进行了探索,进一步对其稳态动力学及催化性能和机理进行了深入研究。通过将催化氧化诱导的显色反应与胆固醇氧化酶相结合,Fe3O4@Si O2可用于胆固醇的可视化比色测定,线性范围为10–300μM,检测限低至7.12μM。该方法成功应用于测定牛奶和蛋黄样品中的胆固醇含量的比色检测,具有低成本、准确、高效和特异性强的特点。2.通过组装二元铜锚定的介孔二氧化硅磁性纳米粒子（Fe3O4@Si O2@Cu O）,制备了一种具有级联增强类POD活性的新型异相纳米酶。利用透射电子显微镜、扫描电子显微镜、傅立叶变换红外光谱、X射线衍射仪和动态激光散射仪对所制备的纳米酶进行了表征。利用该异相纳米酶实现了面粉中Ca O2的超灵敏可视化检测,其检测范围为0.1–5 m M,检测限为5.6×10-3 m M,且不受多种干扰物的影响,具有良好的特异性。3.基于上述Fe3O4@Si O2@Cu O纳米酶较高的类POD催化活性建立了一种用于安全高效检测谷物食品中AFB1的间接竞争酶联免疫法。通过在Fe3O4@Si O2@Cu O纳米酶表面连接兔抗鼠二抗,代替天然辣根过氧化物酶标记的二抗,用于间接竞争酶联免疫法对小麦、玉米等谷物食品中AFB1进行检测,该方法得出吸光度与底物浓度的对数值的线性关系良好,检测范围为0.06–61.93 ng/m L,检测限为0.0037 ng/m L。

关键词： 黄曲霉毒素B1   胶体金试纸   枯草芽孢杆菌   脱毒处理  

摘要： 黄曲霉毒素B1（AflatoxinB1，AFB1）是一种真菌毒素，普遍存在于农产品中，每年给食品工业和畜牧业带来巨大的经济损失。长期接触AFB1会造成免疫系统功能障碍、生长障碍和生殖功能下降。因此，迫切需要建立饲料中简便有效，适用于大批量现场检测AFB1的方法，经过检测后，对超标的饲料进行脱毒处理，减少畜牧业的损失。目前生物降解AFB1的方法因其高效、温和、无毒害残留等优点已经成为研究热点。本研究通过改变AFB1的结构制备人工抗原，通过免疫剂量、免疫间隔的选择制备了抗AFB1单克隆抗体，研制了胶体金免疫层析试纸，筛选出能够高效降解AFB1的菌株，初步研究了菌株的降解机理，通过对饲料进行检测，确定其AFB1的含量，进而对其进行降解。研究内容如下：　　（1）本研究根据AFB1的分子结构和活性位点，采用肟化活泼酯法（Oximationactiveester，OAE）引入羧基，生成AFB1肟（AflatoxinB1oxime，AFB1O），在碳二亚胺（1-Ethyl-3-(3-dimethyllaminopropyl)carbodiimide，EDC）的作用下与载体蛋白牛血清白蛋白（Bovineserumalbumin，BSA）和卵清蛋白（Ovalbumin，OVA）偶联，分别制备出人工免疫原AFB1-BSA和包被抗原AFB1-OVA，经过紫外（Ultraviolet，UV）鉴定、蛋白质凝胶电泳（Sodiumdodecylsulfatepolyacrylamidegelelectrophoresis，SDS-PAGE）鉴定，结果表明，免疫原AFB1-BSA制备成功，其分子结合比为9.21∶1。通过免疫Balb/C小鼠获得AFB1多克隆抗体（Polyclonalantibody，pAb），用间接非竞争酶联免疫吸附试验（Indirectnon-competitiveenzyme-linkedimmunosorbentassay，inELISA）测定血清AFB1pAb效价，间接竞争ELISA（IndirectcompetitiveELISA，icELISA）测定AFB1pAb的特异性和敏感性，结果表明，免疫的4只小鼠的AFB1pAb效价均达到1∶1.28×104，并且对AFB1有较强的特异性和较高的敏感性，为下一步单克隆抗体的制备奠定了基础。　　（2）对小鼠脾细胞和NS0骨髓瘤细胞进行细胞融合，通过3次亚克隆，筛选出3株效价高、灵敏度好的单克隆杂交瘤细胞株1G4、3F8和4B6，选择其中效价最高，灵敏度最好，能够稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株1G4建立杂交瘤细胞系，用体内诱生腹水法制备AFB1单克隆抗体（Monoclonalantibody，mAb），用饱和硫酸盐沉淀法纯化AFB1mAb。用inELISA测定细胞培养上清和腹水AFB1mAb效价，icELISA测定其50%抑制浓度（50%inhibitionconcentration，IC50），交叉反应试验（Crossreaction，CR）测定其特异性，结果表明，AFB1mAb的腹水效价可到1∶5.12×105，IgG亚型为IgG2a+κ链，亲和常数（Affinityconstant，Ka）为2.08×108L/mol，对AFB1的IC50为0.203μg/L，与AFB2、AFG1、AFG2的CR分别为53.2%，22.9%和20.5%，与其他霉菌毒素无CR，能够特异性识别AFB1，为下一步建立AFB1的高灵敏度检测方法提供了核心试剂。　　（3）利用柠檬酸三钠还原法制备了胶体金溶液，利用胶体金标记所制备的抗体，建立AFB1胶体金免疫层析试纸的检测方法。通过Mey氏稳定法试验，确定抗体偶联胶体金的最适pH和浓度为6.8和18μg/mL，通过优化检测线（Testline，T）T线和质控线（Controlline，C）C线的最佳包被浓度，将1.2mg/mLAFB1-BSA和0.8mg/mL山羊抗小鼠IgG（Goatanti-mouseIgG，GaMIgG）包被在硝酸纤维素（Nitrocellulose，NC）膜上。对试纸条的材料进行筛选和预处理后进行组装，其对AFB1的最低检测限为1ng/mL，能够特异性地识别AFB1，与其他霉菌毒素无CR。对89份饲料样本的检测结果表明，与液相色谱-质谱联用（Liquidchromatography-massspectrometrycoupling，LC-MS）检测结果的符合率达到97.8%，所研制的AFB1试纸的检测结果是可靠的，可用于食品和饲料中AFB1的污染检测。　　（4）本研究在新乡市动物园采集27个动物粪便与土壤样品，以香豆素为唯一的碳源进行筛选，筛选出6株可以在香豆素初筛培养基上稳定生长的菌株。经过对AFB1的降解试验，H17的降解率最高为96.2%