关键词： 小鼠   AFB1   肝脏损伤   PINK1/Parkin信号通路   线粒体自噬  

摘要： 黄曲霉毒素B1（AFB1）是毒性极强的真菌毒素,可造成人类和动物肝脏损伤。氧化应激是AFB1致肝脏损伤的主要诱发因素,可导致肝脏线粒体损伤,受损的线粒体进一步触发NLRP3炎症小体过度活化,促进肝脏损伤。而线粒体自噬可特异性清除受损的线粒体,以抵御多种因素诱导的肝脏损伤,PINK1/Parkin途径是调控线粒体自噬的经典通路,但其在AFB1致小鼠肝脏损伤中发挥何种作用尚无定论。因此,本研究以“PINK1/Parkin介导的线粒体自噬保护AFB1致小鼠肝脏损伤”为理论假说,拟开展以下两方面的研究:（1）AFB1亚慢性毒性试验:以C57BL/6野生型（WT）雄性小鼠为受试对象,随机分为对照组（CG）、低剂量组（LG）、中剂量组（MG）和高剂量组（HG）,连续28 d灌胃给予AFB1,观测小鼠肝脏结构和功能、氧化应激状态、线粒体结构和功能、NLRP3炎症小体及线粒体自噬关键因子的表达,旨在明确线粒体自噬与AFB1所致小鼠肝脏损伤的相关性,并筛选出Parkin基因敲除(Parkin-/-)干预试验中AFB1的适宜暴露剂量;（2）Parkin-/-干预试验:以WT和Parkin-/-的C57BL/6雄性小鼠为受试对象,将其分为WT对照组（WCG）、Parkin-/-对照组（PCG）、WT AFB1暴露组（WAG）和Parkin-/-AFB1暴露（PAG）,连续28 d灌胃给予AFB1,观测小鼠肝脏结构和功能、氧化应激状态、线粒体结构和功能、NLRP3炎症小体及线粒体自噬关键因子的表达,旨在探明PINK1/Parkin介导的线粒体自噬在AFB1致小鼠肝脏损伤中的作用。试验结果如下:（1）AFB1亚慢性毒性试验结果:1)与CG相比,MG和HG小鼠精神沉郁,活动迟缓,体重增长抑制,表明AFB1诱导小鼠生长抑制。2)与CG相比,MG和HG小鼠肝脏重量及肝体系数显著降低,肝脏显微及超微结构损伤显著,血清中AST和ALT活性显著增高,表明AFB1损伤小鼠肝脏结构及功能。3)与CG相比,MG和HG小鼠肝脏ROS含量显著增高,SOD活性显著降低,表明AFB1诱导小鼠肝脏氧化应激。4)与CG相比,MG和HG小鼠肝脏超微结构中可见显著的线粒体结构损伤,肝脏ΔΨM及ATP含量显著降低,表明AFB1可诱导小鼠肝脏线粒体结构和功能损伤。5)与CG相比,MG和HG小鼠肝脏NLRP3、Pro-Caspase-1、Caspase-1、ASC、IL-18和IL-11β的蛋白表达均显著增高,表明AFB1能够激活小鼠肝脏NLRP3炎症小体。6)与CG相比,MG和HG小鼠肝脏PINK1、p-Parkin和LC3 II蛋白表达显著增强,p62蛋白表达显著减弱,表明AFB1能够激活小鼠肝脏PINK1/Parkin介导的线粒体自噬。7)MG和HG小鼠肝脏均显著受损,但MG肝脏线粒体自噬水平最高,故选择0.75mg/kg作为后续试验的AFB1暴露剂量。（2）Parkin-/-干预试验结果:1)与WAG相比,PAG小鼠精神抑制状态加重,反应更迟缓,体重增长抑制,表明Parkin-/-可加剧小鼠生长抑制。2)与WAG相比,PAG小鼠肝脏重量及肝体系数降低,肝脏显微超微结构损伤加剧,血清中AST及ALT活性上升,表明Parkin-/-可加重小鼠肝脏结构及功能损伤。3)与WAG相比,PAG小鼠肝脏ROS和MDA含量增高,SOD和GSH-Px活性降低,表明Parkin-/-可加重小鼠肝脏氧化应激。4)与WAG相比,PAG小鼠肝脏超微结构中可见显著的线粒体结构损伤,肝脏ΔΨM及ATP含量降低,表明Parkin-/-可加重小鼠肝脏线粒体结构和功能损伤。5)与WAG相比,PAG小鼠肝脏NLRP3、Pro-Caspase-1、Caspase-1、ASC、IL-18和IL-11β蛋白表达增高,表明Parkin-/-可加剧小鼠肝脏NLRP3炎症小体活化。6)与WAG相比,PAG小鼠肝脏PINK1和LC3 II蛋白表达下降,p62蛋白表达升高,说明Parkin-/-抑制小鼠肝脏线粒体自噬。结论:AFB1暴露可激活肝脏PINK1/Parkin介导的线粒体自噬,其在AFB1致小鼠肝脏损伤中发挥保护作用,该保护作用与清除肝脏受损的线粒体,抑制氧化应激和NLRP3炎症小体活化有关。

关键词： 黄曲霉毒素B1   玉米赤霉烯酮   牛乳腺细胞   大鼠   乳腺   妊娠期和泌乳期   代谢组学   转录组学  

摘要： 黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1,AFB1）作为自然界中已知的最强致癌物,能严重影响畜禽的生产性能和健康。AFB1在肝脏中会代谢成黄曲霉毒素M1（Aflatoxin M1,AFM1）,通过乳腺进入牛奶中引起食品安全问题,并可能与AFB1共存,共同损伤乳腺健康。玉米赤霉烯酮（Zearalenone,ZEN）是一种能紊乱激素稳态的真菌毒素,能改变动物对外源有害物质的敏感性。ZEN常常与AFB1共同污染饲料,而妊娠期和泌乳期的哺乳动物处于内分泌的特殊时期,因此ZEN可能会影响AFB1对妊娠期和泌乳期哺乳动物的毒性。本文通过细胞试验研究了AFB1和AFM1对奶牛乳腺细胞的影响及其机理;通过动物试验研究了AFB1对妊娠期和泌乳期大鼠乳腺、卵巢、肝脏和脾脏的毒性,以及ZEN对其毒性的影响和机制。研究结果可为评估真菌毒素对妊娠期和泌乳期哺乳动物的影响以及相关饲料卫生措施的制定提供理论指导和科学依据。主要从以下三个方面开展研究:一、AFB1和AFM1对牛乳腺细胞的影响及其机理将牛乳腺上皮细胞分为6个组:对照组;2 mg/L AFB1组;10 mg/L AFB1组;2mg/L AFM1组;10 mg/L AFM1组;2 mg/L AFB1+2 mg/L AFM1组。各组细胞按相应的毒素水平处理24 h后,检测AFB1和AFM1对乳腺细胞的细胞存活率、细胞凋亡、细胞周期、线粒体膜电位、抗氧化能力、RNA m6A甲基化水平的影响以及AFB1转化成AFM1的水平,并通过转录组学分析毒素对基因表达的影响。主要的试验结果如下:***1和AFM1降低了乳腺细胞的细胞存活率、处于分裂期的细胞比例和线粒体膜电位异常的细胞比例,提高了凋亡细胞的比例;AFB1组比AFM1组造成了更严重的细胞死亡、细胞凋亡和细胞周期阻滞。AFB1组乳腺细胞的抗氧化能力明显降低。AFB1经牛乳腺细胞培养处理后未检出AFM1。结果表明,AFB1和AFM1对乳腺细胞均具有较强的细胞毒性,相同剂量时AFB1的毒性强于AFM1。该乳腺细胞不能将AFB1转化成AFM1。与单独的2 mg/L AFB1或AFM1组相比,2 mg/L AFB1+2 mg/L AFM1组造成了更严重的细胞死亡、细胞周期阻滞和细胞凋亡,说明AFB1和AFM1对乳腺细胞的毒性具有累加效应。2.转录组学的结果发现,AFB1和AFM1造成许多与细胞增殖、细胞凋亡、细胞周期、细胞间紧密连接和氧化应激相关基因的表达发生变化,且降低了RNA m6A甲基化的水平。表明AFB1和AFM1对乳腺细胞的基因表达造成广泛影响并存在剂量依赖效应,AFB1和AFM1可能是通过影响基因的表观遗传修饰来发挥其毒效应。AFB1组引起的差异基因数量明显多于AFM1组,表明AFB1对乳腺细胞中基因表达的影响更大。与单独的2 mg/L AFB1或AFM1组相比,2 mg/L AFB1+2 mg/L AFM1组造成了更严重的细胞损伤和更多相关的基因表达发生改变,表明AFB1和AFM1对乳腺细胞基因表达的影响具有累加效应。二、AFB1对大鼠乳腺和卵巢的毒性及ZEN对其毒性的影响和机制将40只受孕的Sprague-Dawley（SD）大鼠随机分为4个处理组,每组10只,每只单笼饲养。各组分别饲以不同处理的日粮:对照组（饲喂基础日粮）、AFB1组（饲喂基础日粮+2 mg/kg AFB1）、AFB1+1 ZEN组（饲喂基础日粮+2 mg/kg AFB1+1mg/kg ZEN）和AFB1+10 ZEN组（饲喂基础日粮+2 mg/kg AFB1+10 mg/kg ZEN）。试验时间为妊娠期和泌乳期,记录母鼠每周的平均体重、平均日增重和平均日采食量等生长性能以及产仔数、单次泌乳量和仔鼠体重等繁殖性能。在第35 d时采集母鼠的血清、乳腺和卵巢,进行血生化分析、RT-q PCR检测、代谢组学和转录组学的分析,探究AFB1对大鼠乳腺和卵巢的毒性及ZEN对其毒性的影响和机制。主要的试验结果如下:1.与对照组相比,AFB1组降低了母鼠在妊娠期和泌乳期的平均体重、平均日增重和平均日采食量（P<0.05）,仔鼠的平均体重降低了24.3%,但窝产仔数平均增加了2.4只。AFB1组的谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）、血中的尿素氮（BUN）和葡萄糖分别升高了38.3%、70.6%、78.5%、22.0%和17.9%（P<0.05）;总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、胆固醇（CHOL）和甘油三酯（TG）分别降低了15.6%、13.3%、14.7%和9.0%（P<0.05）。与AFB1组相比,采食量、仔鼠体重和血清生化指标在AFB1+1 ZEN组中的变化有所缓解,但在AFB1+10 ZEN组中的变化更为剧烈。结果表明,AFB1降低了妊娠期和泌乳期大鼠的

关键词： 适配体传感器   黄曲霉毒素B1   界面电容   快速检测  

摘要： 黄曲霉毒素B1(AFB1)是一种具有高毒性、强致癌性的食品污染物,影响农畜业发展的同时还会通过食物链进入人和动物体内,对公众健康构成严重威胁。为了有效保障食品安全,迫切需要对AFB1进行快速、精准、特异性的检测。 本文基于适配体修饰的金叉指电极(IDE),利用适配体-AFB1的靶标结合机制和界面电容传感机制,在不额外使用预富集装置的前提下,结合交流动电(ACEK)微流体作用实现对待测AFB1分子的快速定向驱动与富集,研发了一种简单灵敏的电容式适配体传感器,实现对超低浓度AFB1的快速检测,从采样到结果的时间短至30 s。并通过理论分析、仿真验证和实验验证,成功搭建传感器测试平台对AFB1标准溶液进行检测,结果表明,该传感器具有宽线性范围:1 f M～1 p M,检出限低至0.472 f M,并对AFB1具有良好的特异性,选择比为2296:1。更进一步,为了验证该传感器在实际样品检测中的可靠性和实用性,对玉米全粉质控样品进行AFB1检测,同样表现出快速、灵敏、低成本和高选择比等性能。最后,该传感器在中央储备粮库完成了示范性应用。 此外,本文还利用电化学检测法结合ACEK微流体富集技术设计了一种涡流增敏微纳物探测仪。其主体检测部件包含检测模块和富集模块,可实现检测与富集一体化,前端附加信号激励电路,后端连接便携式恒电位仪或电化学工作站进行数据读出,三者结合构建了的一种快速、简单、灵敏的非机械式涡流增敏探测仪。该探测仪可适用于包括AFB1在内的多种微纳物质的检测,尤其适用于粮油食品中危害物的测定。

关键词： 丁酸梭菌   工艺优化   黄曲霉毒素B1   降解   诱变育种  

摘要： 丁酸梭菌（Clostridium butyricum）作为专性厌氧的新一代芽孢益生菌,具有耐热、耐酸与抗逆性强等特性,极具应用价值与开发前景。本研究首先以提高丁酸梭菌生物量为主要目标,利用单因素实验结合Plackett-Burman实验设计与响应面法对丁酸梭菌的发酵工艺进行优化,采用紫外照射与LiCl联合处理的方式对丁酸梭菌进行复合诱变以提高菌株的产酸能力,并进一步考察其发酵代谢产物对黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1,AFB1）的降解作用和防止粮食作物霉变的应用潜力。本研究主要研究结果如下: （1）本研究在单因素实验的基础上,采用Plackett-Burman实验设计、最陡爬坡实验与Box-Behnken实验设计,对丁酸梭菌的发酵培养基进行优化,以期获得发酵培养基最佳组合。结果表明,优化后的丁酸梭菌发酵培养基组成为葡萄糖18.1 g/L、大豆蛋白胨29.7 g/L、磷酸氢二钾3.8 g/L、氯化钠2.0 g/L、乙酸钠4.0 g/L、结晶硫酸镁1.2g/L、L-半胱氨酸盐酸盐0.3 g/L;培养条件为p H 6.5、37℃、接种量4%（v/v）。优化后的丁酸梭菌生物量（按细胞数计）提高至2.28×10～9个/m L,是优化前的2.85倍,发酵液中总产酸量提高了1.2倍。 （2）利用紫外线照射和LiCl对丁酸梭菌进行复合诱变,经过初筛和复筛以及传代稳定性检验,最终得到一株性状稳定,且产酸能力显著提高的诱变菌,命名为DSL-129。该诱变菌株的最高耐丁酸钠能力提升至45 g/L,比原始菌株提高了50%,总产酸量可达143 mmol/L,较原始菌株提高了1.5倍。 （3）采用牛津杯法测定丁酸梭菌发酵液的抑菌活性。结果表明,发酵液对黄曲霉菌（Aspergillus flavus）及其他致病细菌均有显著的抑制作用。进一步将丁酸梭菌发酵液应用于玉米粉的防霉实验,结果表明发酵液对玉米粉中含有的黄曲霉孢子具有明显的抑制生长作用。深入研究发现将丁酸梭菌发酵上清液浓缩后作用于AFB1 72 h时,AFB1的降解率达到68.65%,初步分析该发酵上清液中对AFB1具有脱毒作用的活性组分推测为丁酸梭菌分泌产生的胞外酶。本研究将丁酸梭菌发酵液应用于抑制黄曲霉菌的生长与降解AFB1,以期为丁酸梭菌降解AFB1以及其他霉菌毒素的应用提供参考依据。

关键词： 介质阻挡等离子体   黄曲霉毒素B1   阿月浑子   降解产物   营养品质  

摘要： 阿月浑子是木本油料树种之一种豆科植物。其果核富含油脂、蛋白质、矿物质、多种维生素及生物活性成分,具有一定的保健和药用价值。然而坚果的种仁含有脂肪54.6%～60%,潮湿的环境和不当的储存条件导致阿月浑子易感染黄曲霉毒素B1,造成品质损失同时给人类带来食用安全隐患。这使选择高效降解方法、探究降解机制及降解后营养品质变化是我国坚果研究过程中亟待研究与解决的问题。阿月浑子坚果仁作为原料,通过单因素试验和响应面试验优化等离子体降解阿月浑子中的黄曲霉毒素B1。介质阻挡等离子体在放电功率200 W,放电时间5 s和放电间距0.4 cm的条件下降解乙腈中的黄曲霉毒素B1,运用高效液相色谱-质谱联用仪和电喷雾-傅里叶变换-离子回旋共振质谱进行分析。通过液质数据和高分辨质谱验证进行初步的分子量分析,再以Masshunter匹配和双键等价值进行推导,并结合已报道的等离子体机理,分析出5种降解产物的分子式及结构式,再对可能的降解产物进行轰击获得二级质谱碎片,依据质谱裂解规律再次匹配,加以确证5种降解产物的结构式并命名,从而精准分析其降解途径。为研究等离子体降解阿月浑子中AFB1后对营养物质是否有影响,检测阿月浑子降解前后的理化性质和脂肪酸组成、扫描电镜和观察内部结构、贮藏稳定性实验观察处理效果的维持时间。研究结果如下: 1.阿月浑子坚果仁为原料,通过单因素试验和响应面试验优化等离子体降解阿月浑子中的黄曲霉毒素B1,AFB1的最大理论降解率为98.5%,实测值为93.4%,确定了该条件为最佳工艺条件。 2.通过分析得到的分子结构和再次确认的二级质谱数据密切匹配,并阐明了五个降解产物结构和三个降解途径。在降解率为35.8%的情况下,根据5种降解产物毒性位点损失的情况,推测介质阻挡等离子体处理之后产物毒性与降解率一致。 3.研究发现等离子体处理后对理化性质无显著变化,扫描电镜发现内部结构变饱满,贮藏稳定性实验发现处理后品质可保持两周,脂肪酸比例更接近推荐值。可得出等离子体处理对阿月浑子不仅有降毒效果,还能起到保鲜作用。

关键词： 小麦   微波技术   黄曲霉毒素B1   含水率   化学计量学方法   定量检测  

摘要： 小麦是我国最重要的主粮之一,其品质直接影响人民的生命健康。微波信号能够反映物质内部丰富的信息,在谷物品质无损检测中备受关注。本文针对小麦霉变等品质检测的准确性和快速性需求,提出了一种基于微波透射方式的双外差混频探测结构,并基于此开发了一套用于小麦或其他谷物品质检测的微波分析装置,以小麦为试验对象,着重讨论了基于微波技术的小麦黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1,AFB1）定量检测和小麦含水率定量检测方法研究。具体研究内容如下:（1）微波装置硬件设计。分别设计了硬件电路和机械结构,包括由微控制器、微波源、微波检测前端、宽频微带天线、幅值相位检测器、混频器等组成的硬件系统;机械结构主要包含金属屏蔽腔体、载物盒、装置外壳与底座。微波装置各模块合理布局实现便携式、一体化设计,减少装置系统噪声,以提高检测精度和灵敏度。（2）微波装置软件设计。分别设计了上位机程序和下位机程序软件,下位机程序设计以STM32单片机为核心控制检测装置在2.5 GHz-11.5 GHz频率范围内对小麦进行检测,并把采集的数据发送到上位机;上位机对采集的数据进行数据存储、曲线绘制、数据显示以及谷物品质定量检测。（3）基于微波装置的小麦AFB1检测试验研究。通过自制微波检测装置采集不同AFB1含量的小麦样本在扫描频率范围内的透射系数,采用最小二乘滤波对其进行预处理,引入自助软收缩法（Bootstrapping Soft Shrinkage,BOSS）算法进行特征筛选,并分别构建基于优化特征变量的线性模型（Partial Least Squares,PLS）和非线性模型（Support Vector Machine,SVM、Extreme Learning Machine,ELM、Random Forest,RF）以实现小麦AFB1含量的快速、定量测定,并使用随机化检验对模型性能进行比较。研究结果显示,BOSS特征优化算法可以筛选出针对性强的特征变量,减少模型输入的特征数量、有效降低模型的复杂度。其中,非线性模型与线性模型相比取得了更佳的泛化性能,BOSS-SVM模型在所有的模型中性能最佳,其在预测集中的预测均方根误差（Root Mean Square Error of Prediction,RMSEP）、决定系数（Coefficient of Determination,）和预测偏差（Relative Prediction Deviation,RPD）分别为2.8μg·kg-1、0.97和5.7。研究结果表明,利用自制的小型化微波检测装置结合适当的化学计量学方法可以高精度实现小麦中AFB1含量的定量检测。此外,使用合理的检验技术可以对模型的性能进一步校正,避免视觉误差。（4）基于微波装置的小麦含水率检测试验研究。通过微波装置获取小麦样本在2.5GHz-11.5 GHz频率范围内的透射系数,利用竞争性自适应重加权算法（Competitive Adaptive Reweighted Sampling,CARS）对经过最小二乘滤波预处理后的透射系数进行特征粗选,再采用遗传算法（Genetic Algorithm,GA）对粗选后的特征变量进行二次特征细选,并按照权重高低进行排序组合。采用支持向量回归（Support Vector Regression,SVR）建立不同特征变量组合的定量模型以实现小麦含水率的快速检测。研究结果显示,相比较于CARS-SVR模型,CARS-GA-SVR模型对小麦含水率测定有着更好的检测性能。其中,特征变量组合为6维时,CARS-GA-SVR模型的检测效果最佳,其预测均方根误差为0.4047%,决定系数为0.9756和预测偏差为6.3234。

关键词： 免疫层析法   快速检测   改良上转换纳米粒子   玉米赤霉烯酮   黄曲霉毒素B1  

摘要： 黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1,AFB1）是毒性最大、致癌性最强的真菌毒素,被世界卫生组织癌症研究机构列为Ⅰ类致癌物,会诱使人和动物发生严重的肝损伤,甚至导致肝癌和死亡。玉米赤霉烯酮（Zearalenone,ZEN）是一种具有雌激素活性、污染范围广的真菌毒素,可对人和动物表现出强烈的生殖毒性。AFB1和ZEN主要存在于农作物及其制品中,二者的混合污染可导致显著的协同效应和增效效应,使毒性大幅增加。免疫层析技术（Immunochromatographic assay,ICA）因具有检测快速,生产成本低,操作简单,结果直观等优点,被广泛地应用于单种或多种真菌毒素的现场定量检测。本研究通过掺杂镧系稀土离子制备两种改良的上转换纳米粒子（Up-conversion nanoparticles,UCNPs）,并将其作为标记物构建检测ZEN的免疫层析试纸条。比较两种UCNPs-ICA的检测灵敏度,选择Lu-UCNPs作为标记物构建双重检测试纸条,以实现对谷物样品中AFB1和ZEN的同时检测。主要研究结果如下:1、基于La掺杂UCNPs的免疫层析法快速检测ZEN本研究采用热分解法合成La掺杂的UCNPs,优化其离子掺杂比例,并应用于免疫层析检测ZEN。结果表明,20%La掺杂的UCNPs具有最佳的形态结构和荧光性能,将其记为La-UCNPs。经聚丙烯酸（Polyacrylic acid,PAA）对La-UCNPs表面进行羧基修饰后,将其与ZEN单克隆抗体偶联制备免疫探针,建立一种新型的谷物中ZEN荧光免疫层析检测方法。优化PAA用量、抗体标记量、检测时间和荧光免疫探针浓度,确定最佳条件分别为2.0 m L、20μg、10 min和8 mg/m L。在最佳检测条件下,La-UCNPs-ICA对ZEN标准品溶液的检出限（Limit of detection,LOD）为0.25 ng/m L,变异系数（Coefficient of variation,CV）小于8.67%,线性相关系数R=0.9944。此外,特异性试验结果表明,制备的试纸条对ZEN具有高度特异性。该方法对小麦和玉米中ZEN的LOD均为0.5μg/kg,加标回收率分别为87.65%～99.26%和84.12%～95.12%,对应的CV为1.289%～7.143%和4.033%～9.013%。与胶体金试纸条和高效液相色谱（High-performance liquid chromatography,HPLC）相比,La-UCNPs-ICA具有更好的灵敏度和基质耐受性,且三种方法在天然谷物样品检测中表现出高度的一致性。2、基于Lu掺杂UCNPs的免疫层析法快速检测ZEN采用热分解法合成了不同Lu掺杂比例的UCNPs,通过扫描电镜、X射线衍射仪、能量色散光谱、傅里叶红外光谱和荧光光谱仪对其进行表征。结果发现,30%Lu掺杂的UCNPs表现出最佳的粒子特性和荧光性能,将其记为Lu-UCNPs并作为标记物用于后续试纸条的开发。对试纸条检测条件进行优化,确定最佳抗体标记量、T线抗原浓度、荧光探针浓度和样品稀释液分别为10μg、0.8 mg/m L、10 mg/m L和PBST稀释液。最佳检测条件下,Lu-UCNPs-ICA对ZEN标准品溶液的LOD为0.1 ng/m L,在0～100 ng/m L范围内具有良好的线性关系（R=0.9946）,且与其他真菌毒素无交叉反应。该方法对玉米和小麦中ZEN的LOD均为0.16μg/kg,加标回收率分别为82.11～100.76%和79.64～98.51%。此外,Lu-UCNPs-ICA、胶体金试纸条和HPLC对天然谷物样品的检测结果一致。因此,这种新型Lu-UCNPs-ICA可用于定量监测谷物样品中ZEN的痕量残留。3、基于改良UCNPs免疫层析竞争法同时检测AFB1和ZEN的应用研究通过比较La-UCNPs和Lu-UCNPs的荧光性能及其构建的免疫层析方法检测灵敏度,确定效果更优的Lu-UCNPs作为后续试纸条的标记物,并将其记为IUCNPs（Improved UCNPs）。基于IUCNPs构建检测AFB1的单通道检测条带,优化后的抗体标记量和荧光探针浓度分别为20μg和8 mg/m L,其对ZEN标准品溶液的LOD为0.1 ng/m L。在优化的单通道检测条件基础上,进一步构建一种基于IUCNPs的新型双重检测试纸条,可在10 min内实现对AFB1和ZEN的同时检测,其LOD分别为0.025和0.1 ng/m L,校准曲线的R分别为0.9931和0.9982。将试纸条于室温下储存在避光干燥环境中保存2个月,条带T1/C和T2/C值的平均相对强度分别为98.24%和99.65%。此外,试纸条检测阴性和阳性样品的批内和批间变异系数均小于10%。

关键词： 黄曲霉毒素B1   适配体   信号放大   比色法   花生  

摘要： 黄曲霉毒素B1（Aflatxion B1,AFB1）是毒性最强的真菌毒素之一,具有强致癌性及肝脏毒性,在低浓度时对人体仍有很大的伤害,因此开发高灵敏检测AFB1的分析方法十分重要。比色检测方法检测AFB1操作简单可用于现场检测等优点,但普通比色方法灵敏度不够。本文所设计的传感方法将适配体（Aptamer）作为识别元件,以核酸等温扩增技术提高检测灵敏度,设计了三种不同的比色检测方法检测花生中的AFB1。具体内容如下: 1、基于双循环催化发夹自组装的适配体传感器比色检测AFB1。为了解决传统比色方法灵敏度不高的问题,本方法利用Aptamer对AFB1的特异性识别,构建一种基于双循环催化发夹自组装的适配体传感器,放大检测花生中的痕量AFB1。当AFB1存在时,AFB1会与Aptamer特异性结合,引发链T从Aptamer-T的双链复合物释放出来,从而引发第一个催化发夹自组装反应（Catalytic Hairpin Assembly,CHA）,第一个CHA循环的产物可以作为第二个CHA循环的引发链,并暴露出包被在发夹茎部区域的富G序列,该序列在氯化血红素（hemin）和K+存在下形成hemin/G四链体DNA酶,催化生色底物四甲基联苯胺（TMB）产生颜色变化。该方法在AFB1浓度为50 p M-1100 p M范围内具有良好的线性关系,检出限为13.49 p M。用于花生中AFB1的加标回收率在95.28%-104.50%范围内。 2、杂交链式反应结合催化发夹自组装的级联放大方法用于比色检测AFB1。为了进一步提高检测方法的灵敏度,提出了一种基于杂交链式反应（Hybridization Chain Reaction,HCR）结合催化发夹自组装的级联信号放大方法,在前一章基础上以Y型G-四链体作为信号输出,用于灵敏、准确地检测AFB1。通过AFB1与其Aptamer的特异性结合,释放出与Aptamer互补的引发链,进而启动HCR反应,HCR产物暴露出的粘性末端能够引发下游的催化发夹自组装反应,生成Y型DNA复合物,该产物三个端点的粘性末端形成三条完整的G-四链体序列,进而与hemin结合形成的DNA酶输出比色信号。该方法在AFB1浓度为10 p M-1 n M范围内吸光度值与浓度对数之间具有良好的线性关系,本方法的检出限为4.26 p M。用于花生样品中的加标回收率在94.43%-113.32%之间。 3、基于熵驱动催化反应及催化发夹自组装的传感技术用于比色检测AFB1。为了解决传感器设计复杂的问题,本方法基于以及熵驱动催化反应（Entropy-Driven Catalysis,EDC）及CHA策略的比色传感技术,在上一章的基础上减少了发夹的引入并以两条直链共同引发CHA反应,构建了更为简单的比色传感器检测痕量AFB1,实现了对花生样品中的AFB1的高灵敏检测。AFB1与Aptamer结合释放出被Aptamer锁定的引发链T,释放出的T通过链置换反应置换出DNA2,形成DNA1-T-DNA3三链复合物。然后,DNA4与DNA1-T-DNA3复合物结合释放出DNA1和T。再次释放的T参与下一轮EDC循环,而DNA1、DNA2可以作为两条触发链引发相同的CHA反应,暴露出包被在发夹H2的富G序列。该传感器在AFB1浓度为1 p M-10 n M范围内,AFB1的浓度对数与吸光度值具有较好的线性关系,所得检出限为0.47 p M,与前一章方法比较降低了约一个数量级。AFB1在花生中的加标回收率为91.3%-108.46%,表明该AFB1检测方法可以应用于花生实际样品之中。

关键词： 黄曲霉毒素B1   T-2毒素   玉米赤霉烯酮   完全抗原   间接竞争ELISA   胶体金试纸条  

摘要： 真菌毒素是真菌产生的有毒次级代谢产物,具有致畸、致癌和致突变作用,可对动物造成严重损害,并且可通过污染谷物或动物源性食品进入食物链,最终导致人类的健康问题。我国真菌毒素的污染状况十分严重,每年因被真菌毒素污染而被弃去的饲料高达20%左右,造成了严重的经济损失。许多国际组织和机构已对主要真菌毒素制订了严格的监管指南。基于上述情况,针对真菌毒素的检测已成为食品安全领域的研究重点。现有的真菌毒素检测方法包括化学分析法、仪器分析法和免疫分析法等,其中,免疫分析法因具有操作简便、用时较短、灵敏准确、特异性高的优点,近年来在真菌毒素检测领域发展迅速。为了开发适用于临床现场检测的免疫分析方法,监测真菌毒素污染,确保农产品和食品安全,研究人员建立了真菌毒素免疫检测方法。 本课题以黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1,AFB1）、T-2毒素和玉米赤霉烯酮（Zearalenone,ZEA）这3种在农产品中常见且危害大的真菌毒素为检测对象,将它们分别与牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin,BSA）、卵清白蛋白（Ovalbumin,OVA）进行偶联,制备了完全抗原AFB1-BSA、AFB1-OVA、T-2-BSA、T-2-OVA、ZEA-BSA和ZEA-OVA,以灵敏度高且特异性强的单克隆抗体为识别元件,基于间接竞争酶联免疫吸附测定（Indirect competitive enzyme linked immunosorbent assay,ic-ELISA）和免疫层析原理,建立了以上3种真菌毒素的免疫学检测方法。主要研究内容和结果如下: 1、将AFB1、T-2和ZEA分别与载体蛋白偶联制备完全抗原。首先通过与羧甲基羟胺半盐酸盐反应将活性基团引入AFB1和ZEA,合成肟化物（AFB1O和ZEAO）,然后采用碳二亚胺法将AFB1O和ZEAO分别与BSA、OVA进行偶联。T-2则采用N,N’-羰基二咪唑（N,N’-carbonyldiimidazole,CDI）一步法合成T-2-BSA和T-2-OVA。用紫外扫描和间接ELISA法验证了完全抗原合成成功,并测定了完全抗原的蛋白浓度。 2、复苏实验室现有的杂交瘤细胞株,培养至对数生长期后注射至Bal b/c小鼠腹腔,采集腹水纯化,得到单克隆抗体后进行效价和特异性检测。抗AFB1单克隆抗体效价为2.56×10～4,抗T-2单克隆抗体效价为8.19×10～5,抗ZEA单克隆抗体效价为2.56×10～4,以上3种单抗具有高度特异性。基于以上得到的完全抗原和单克隆抗体,通过对包被抗原种类、一抗工作浓度、抗原稀释液成分、竞争孵育时间等条件进行优化,分别建立了检测玉米中AFB1、T-2和ZEA的间接竞争ELISA方法。AFB1的检测限为0.0273 ng/m L,线性范围为0.047-0.588 ng/m L,加标回收率在104%-110%,变异系数小于15%;T-2的检测限为0.183 ng/m L,线性范围为0.288-7.493ng/m L,加标回收率在107.3%-108.3%,变异系数小于15%;ZEA的检测限为1.09ng/m L,线性范围为2.319-69.533 ng/m L,加标回收率在97.9%-112.3%,变异系数小于15%。以上结果均达到国标要求。 3、基于免疫层析原理,对各组分进行摸索优化,建立了三合一胶体金免疫层析试纸条,用于玉米中AFB1、T-2和ZEA的检测。试纸条对AFB1、T-2和ZEA的检测限分别为4μg/kg、16μg/kg和5μg/kg,使用时不需要仪器,6 min左右即可直接得到结果,该试纸条具有良好的特异性和重复性。

关键词： 金属有机骨架材料   Fe-金属有机凝胶材料   纳米酶   传感平台   黄曲霉毒素B1   多巴胺   敌百虫  

摘要： 食品中真菌毒素、农药残留带来的生物及环境危害不容忽视,因此开发快速灵敏检测真菌毒素、农药残留的分析方法具有重要意义。基于金属有机骨架（MOF）及凝胶（MOG）材料的传感平台具有灵敏、耗时短等优点,被广泛用于食品毒素与农残的检测。本文合成了Fe MOG以及具有纳米酶性质的Mn MOF、Mn-ZIF-67-0.4、TCPP-Cu Co2O4,将其用于构建真菌毒素和农药残留检测的传感平台。本文的研究工作分为以下四个部分:（1）黄曲霉素B1（AFB1）是天然食品中最为常见的一类污染物,其毒性和致癌性也最强。本实验合成了具有类过氧化氢酶性质的金属有机骨架材料Mn MOF纳米酶,经高温炭化后得到Mn MOF-C,通过掺杂铂纳米颗粒得到复合材料Pt NPs@Mn MOF-C,发现其催化能力可进一步增强。将该复合材料作为标记物用于制备AFB1适体传感器,利用适体的高度亲和力与高特异性,使其与AFB1发生特异性结合从电极表面解离下来,导致Pt NPs@Mn MOF-C催化过氧化氢产生的电流信号减小,从而实现食品中AFB1的定量检测。在0.001～100 ng/m L范围内,随着目标物AFB1浓度的增大,响应信号逐渐降低。本实验所构建的适体传感器灵敏度高、耗费时间短,可用于真实大米样品中AFB1的检测,展现出良好的应用前景。（2）采用一锅法制备了双金属有机骨架材料Mn-ZIF-67-0.4,利用其优异的类氧化酶性质构建了比色传感平台用于多巴胺（DA）的检测。在最优条件下响应信号（652 nm处的吸光度差值）与DA浓度具有良好的线性关系,线性范围为0.4-80μmol/L,R2=0.9952,回归方程为ΔA=0.0145 c+0.1303。本实验所构建的DA比色传感平台可用于人血清中DA的检测,具有成本低、耗时短、检测灵敏等特点。（3）利用新型金属有机凝胶Fe MOG构建乙酰胆碱酯酶（ACh E）传感器。Fe MOG具有较好的导电性,通过900℃热处理后得到Fe MOG-N-C,其电阻值可进一步减小。使用Au NPs@Fe MOG-N-C作为基底导电材料将ACh E固定到电极上,ACh E可催化氯化乙酰硫代胆碱（ATCh）水解生成具有还原性的硫代胆碱（TCh）,TCh在0.6 V处具有特征的氧化峰。而农药可抑制ACh E的活性,从而抑制TCh的生成,导致氧化峰电流减小,由此可实现对农药的灵敏检测。（4）利用5,10,15,20-四羧基苯基卟啉（TCPP）对Cu Co2O4进行功能化,得到了具有优异类过氧化物酶性能的TCPP-Cu Co2O4,将其用于敌百虫比色传感平台的构建。在H2O2存在时,TCPP-Cu Co2O4可以将无色3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）氧化为蓝色ox TMB,伴随652 nm处较强的吸收峰出现,而ACh E可将ATCh特异性水解成TCh,TCh具有巯基结构,可以还原ox TMB,使得652 nm处的吸收峰降低。而敌百虫能不可逆抑制ACh E的活性,使得吸收峰恢复,以此构建比色传感平台用于ACh E活性和敌百虫的检测。该方法具有检测快速、成本低廉、操作简单等优点。实验所提出传感平台对敌百虫具有40-4000 ng/m L的宽线性检测范围,线性相关系数为0.9904。此外,当乙酰胆碱酯酶在0.1-5 U/L活度范围内,该平台的响应信号（652 nm处的吸光度差值）与ACh E活度呈现出良好的线性关系。本实验所提出的检测方法可应用于蔬菜中敌百虫的检测,具有良好的应用前景。