关键词：
黄曲霉毒素B1
赭曲霉毒素A
生物脱毒
降解酶
藤黄单胞菌
摘要：
真菌毒素是由霉菌在生长代谢过程中产生的一类有毒次级代谢产物。其污染范围广泛,常见于各种粮食及食品饲料中。在造成巨大经济损失的同时也给人类和动物的健康造成极大的危害。采取相关的防治措施及脱毒方法显得尤为重要。生物脱毒法以其绿色环保、特异性强、成本低,对食品的营养与风味影响小等特点受到了广泛关注。近年来,关于黄曲霉毒素B1（AFB1）和赭曲霉毒素A（OTA）的生物脱毒研究,大部分为吸附或降解菌株的筛选,脱毒菌种主要针对单个毒素,对复合污染的多毒素降解鲜见报道,并且对于高效降解酶的发掘较少。大部分的解毒菌株难以被批准用于农业生产,此外生物解毒酶的脱毒效果仍有待提高,并且食品、饲料等往往会污染多种毒素。因此,筛选多功能降解菌株及其降解机制的研究显得尤为重要。本研究以具有AFB1和OTA双降解功能的藤黄单胞菌CW574为研究对象,筛选并在体外表达了氧化酶HPPD和酰胺水解酶AMD3,并围绕这两种与真菌毒素降解相关的酶展开研究,以期为AFB1和OTA复合污染的生物降解提供一种有效的新方法。主要研究结果如下:
1.藤黄单胞菌CW574降解AFB1的主要活性物质是分泌在细胞外的非蛋白物质,降解OTA的主要活性物质是胞内解毒酶。两者是菌株CW574具有AFB1和OTA双降解功能的主要物质基础,从不同的降解物质及分布来看,菌株CW574对两类毒素具有不同的降解机制。
2.藤黄单胞菌CW574中发现并表达的氧化酶HPPD本身仅具有微弱的AFB1降解作用,但Mg2+对其降解活性有显著提高,并且氧化酶HPPD在菌株CW574体内参与了酪氨酸代谢途径中的下游产物尿黑酸等;生成了多个对AFB1具有高效降解活性的小分子化合物,这些化合物主要分泌于菌株培养后的无细胞上清中。因此,氧化酶HPPD是介导AFB1降解关键活性物质合成的关键酶。
3.通过文献调研和比较基因组学分析,筛选出了菌株CW574中降解OTA的高效解毒酶AMD3,经序列同源性分析该解毒酶为酰胺水解酶,与实验室前期发现的酰胺水解酶ADH3和ADH1相似度约为50-65%;将AMD3与本实验室ADH3和ADH1进行了对比研究。成功将AMD3,ADH1和ADH3在大肠杆菌中完成了原核异源表达。经换算,原核表达发酵菌液中AMD3,ADH1和ADH3的蛋白产量分别为12.32 mg/L,8.3 mg/L,4.36 mg/L,经亲和层析纯化,纯化后的蛋白得率分别为23.44%,41.16%,39.61%。以蛋白浓度为1μg/mL的r AMD3处理OTA,在9 min内可将50μg/L的OTA完全降解;同样条件下,rADH1需要10 min,但rADH3只需要80 s。酶动力学常数检测结果显示,原核表达的r AMD3催化效率（Kcat/Km）为463.47 s-1·mM-1,rADH1的为271.56 s-1·mM-1,已有报道的rADH3催化效率（Kcat/Km）为303937.85 s-1·mM-1。此外,解毒酶r AMD3的最适催化温度为40℃,最适pH为7,在pH 6-8条件下保存120 h后仍能保留75%的活性;解毒酶rADH1的最适温度为70℃,最适pH为8。100F氨基酸点突变后,AMD3完全失去催化活性,179D,181S,184Y,230D,321Y的突变会使活性分别减弱75.12%,11.55%,5.37%,31.62%,76.15%。三个降解酶的优缺点对比分析发现,ADH3催化效率最高,ADH1具有较高的温度耐受性,AMD3在原核表达中的可溶性最好,且pH稳定性最佳。这些结果为后续的酶分子改造提供了相关参考。
4.酰胺水解酶AMD3,ADH1和ADH3三个解毒酶在原核表达过程中都存在表达后可溶性蛋白含量较低,且包涵体蛋白复性后无OTA降解活性的问题。因此,研究三个水解酶的分泌型表达,并验证其分泌型表达产物OTA降解能力对于该类解毒酶后续的产业化应用具有重要意义。利用毕赤酵母GS115对三种酰胺水解酶蛋白进行条件优化和分泌表达,三种蛋白在发酵液中的产量分别为79.52 mg/L,53.5 mg/L,89.16 mg/L;以透析脱盐和强阴离子柱纯化后,纯化蛋白的得率分别为21.62%,24.23%,13.15%。以蛋白浓度为1μg/mL的AMD3处理OTA,在9 min内可将50μg/L的OTA完全降解;同样条件下,ADH1需要14 min,而rADH3需要24 min。酶动力学常数检测结果显示,以毕赤酵母分泌表达所获得的AMD3催化效率（Kcat/Km）为371.99 s-1·mM-1,ADH1的为123.21 s-1·mM-1,ADH3的为124.95 s-1·mM-1。以上结果显示,虽然ADH3原核表达后活性很高,但可溶性蛋白产量太低,使用毕赤酵母分泌表达获得的蛋白降解活性又大
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