关键词： AFB1   肾脏   线粒体自噬   氧化应激   细胞凋亡  

摘要： 黄曲霉毒素B1（AFB1）属于剧毒污染物,进入机体后会蓄积于肾脏,造成肾脏损伤。氧化应激是AFB1致肾脏损伤的病理基础,并可引发线粒体损伤,而受损的线粒体可触发细胞凋亡,加剧肾脏损伤。PINK1/Parkin介导的线粒体自噬参与肾脏组织细胞内受损线粒体的清除,在维持肾脏功能方面发挥重要作用,但其在AFB1致肾脏损伤中是否被激活及在其中发挥的作用尚无定论。因此,本研究提出“PINK1/Parkin介导的线粒体自噬参与保护AFB1致肾脏损伤”的理论假说,拟开展以下两方面的研究:（1）AFB1毒性试验:将40只野生型（WT）C57BL/6雄性小鼠分为对照组（CG,0 mg/kg ***1）、低剂量组（LG,0.5 mg/kg ***1）、中剂量组（MG,0.75 mg/kg ***1）和高剂量组（HG,1 mg/kg ***1）,暴露于AFB1 28 d,检测小鼠生长发育状况、肾脏结构和功能、氧化与抗氧化水平、线粒体结构和功能、细胞凋亡水平及线粒体自噬关键因子的表达,旨在明确AFB1对小鼠肾脏损伤和线粒体自噬的影响,并筛选Parkin基因敲除（Parkin-/-）干预试验所用的AFB1适宜剂量。（2）Parkin-/-干预试验:将20只WT C57BL/6雄性小鼠和20只Parkin-/-C57BL/6雄性小鼠分为WT对照组（WCG,0 mg/kg ***1）、WT中毒组（WAG,1 mg/kg ***1）、Parkin-/-对照组（PCG,0 mg/kg ***1）和Parkin-/-中毒组（PAG,1 mg/kg ***1）,暴露于AFB1 28 d,检测小鼠生长发育状况、肾脏结构和功能、氧化与抗氧化水平、线粒体结构和功能、细胞凋亡水平及线粒体自噬关键因子的表达,旨在探明PINK1/Parkin介导的线粒体自噬在AFB1致小鼠肾脏损伤中的作用。试验结果如下:（1）AFB1毒性试验结果1)与CG相比,MG和HG小鼠体重和肾脏系数显著降低;肾脏显微和超微结构显著受损;血清BUN和CREA含量显著升高,表明AFB1可导致小鼠肾脏结构和功能损伤。2)与CG相比,各AFB1处理组小鼠肾脏ROS含量显著升高,SOD活性显著降低,表明AFB1可诱导小鼠肾脏氧化应激。3)与CG相比,MG和HG小鼠肾脏线粒体结构显著受损;MMP水平和ATP含量显著降低,表明AFB1可诱导小鼠肾脏线粒体结构和功能损伤。4)与CG相比,MG和HG小鼠肾脏Bax蛋白表达显著上调,Bcl-2蛋白表达显著下调,表明AFB1可引发小鼠肾脏细胞凋亡。5)与CG相比,MG和HG小鼠肾脏PINK1、Parkin和LC3基因及蛋白表达显著升高,p62基因及蛋白表达显著降低,表明AFB1可激活小鼠肾脏PINK1/Parkin介导的线粒体自噬。综上所述,以肾脏损伤显著,且线粒体自噬强度最高的剂量点,即1 mg/kg,作为Parkin-/-干预试验所用的AFB1剂量。（2）Parkin-/-干预试验结果1)与WAG相比,PAG小鼠肾脏PINK1和LC3基因及蛋白表达降低,p62基因及蛋白表达升高,表明Parkin-/-可抑制AFB1诱导的小鼠肾脏PINK1/Parkin介导的线粒体自噬。2)与WAG相比,PAG小鼠体重和肾脏系数降低;肾脏显微和超微结构损伤加重;血清BUN和CREA含量升高,表明Parkin-/-可加剧AFB1诱导的小鼠肾脏结构和功能损伤。3)与WAG相比,PAG小鼠肾脏ROS和MDA含量升高,GSH-Px和SOD活性降低,表明Parkin-/-可加剧AFB1诱导的小鼠肾脏氧化应激。4)与WAG相比,PAG小鼠肾脏线粒体结构损伤加剧;MMP水平和ATP含量降低,表明Parkin-/-可加剧AFB1诱导的小鼠肾脏线粒体结构和功能损伤。5)TUNEL染色显示,与WAG相比,PAG小鼠肾脏细胞凋亡加剧;肾脏Bax蛋白表达和Caspase-3活性上调,Bcl-2蛋白表达下调,表明Parkin-/-可加剧AFB1诱导的小鼠肾脏细胞凋亡。结论:AFB1暴露可激活肾脏PINK1/Parkin介导的线粒体自噬;PINK1/Parkin介导的线粒体自噬在AFB1致肾脏损伤中起保护作用,且其保护作用与缓解氧化应激、线粒体损伤及细胞凋亡有关。

关键词： 猪繁殖与呼吸综合征病毒   类NADC-30 PRRSV   中药提取物   抗病毒效果  

摘要： 猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS),是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的一种具有高度传染性和致死性的传染病,主要引起母猪繁殖障碍和不同年龄猪的呼吸系统疾病。疫苗免疫是当前预防该病的主要手段,但病毒持续变异导致疫苗的临床防控效果差异很大。近年来类NADC-30 PRRSV的流行给疫苗免疫带来更大的挑战。中药在PRRSV防控中一直发挥着重要作用,为系统分析中药抗类NADC-30 PRRSV的效果,本文对北京生泰尔公司生产的板蓝根颗粒、银黄可溶性粉和黄芪多糖粉从体内和体外两个方面研究其抗类NADC-30 PRRSV活性,获得研究结果如下: (1)中药体外抗类NADC-30 PRRSV活性检测。 经CCK-8法测得板蓝根颗粒、银黄可溶性粉和黄芪多糖粉处理细胞的最大安全浓度分别为16 mg/m L、1 mg/m L和8 mg/m L。采用实时荧光定量PCR和Western Blot分别检测药物处理感染类NADC-30 PRRSV的Marc-145细胞后PRRSV ORF7的转录水平和PRRSV N蛋白的表达水平,发现上述药物浓度分别达到2 mg/m L、0.25 mg/m L和0.5 mg/m L时能够抑制病毒的增殖,且呈现剂量依赖性的特点。以上述药物的最大安全浓度为试验浓度,在类NADC-30 PRRSV感染Marc-145细胞之前给药对PRRSV ORF7转录的抑制率分别为68%、86%和38%;感染之后给药抑制率分别为74%、40%和55%。 (2)中药体内抗类NADC-30 PRRSV效果。 板蓝根颗粒、黄芪多糖粉和银黄可溶性粉分别按1 g/kg·d、0.2 g/kg·d和0.2 g/kg·d联合给药可抑制类NADC-30 PRRSV在仔猪体内的增殖,减轻仔猪感染类NADC-30PRRSV后的临床症状和病理损伤,降低病毒血症。给药组仔猪PRRSV血液病毒载量显著低于攻毒对照组(P<0.01);其中在仔猪感染类NADC-30 PRRSV前7天给药组的仔猪血清PRRSV抗体水平低于攻毒对照组(P<0.05)。 (3)临床生产中评价中药抗类NADC-30 PRRSV效果。 在母猪产前10～14 d添加板蓝根颗粒、黄芪多糖粉和银黄可溶性粉后,出生仔猪的均重、窝重、健仔率、21 d断奶仔猪的均重和窝重、日增重都有一定的提升;母猪和14～21 d仔猪PRRSV抗体水平下降趋势更加明显,仔猪腹泻率降低,抗病能力明显提升。 综上所述,板蓝根颗粒、黄芪多糖粉和银黄可溶性粉在体内外具有较好的抗PRRSV效果;体内联合应用除具有抗PRRSV感染的作用外,还能够增强母猪的繁殖性能。为系统分析板蓝根颗粒、黄芪多糖粉和银黄可溶性粉抗类NADC-30 PRRSV效果提供了数据支撑,为疫苗免疫+中药防控等综合性防控方案的建立提供参考。

关键词： 溃疡性结肠炎   中药制剂   白细胞介素   肠道菌群   免疫球蛋白  

摘要： 随着世界各国人民生活水平的提高,溃疡性结肠炎在人和宠物身上的发病率与死亡率也随之提高,已经被世界卫生组织列为一项重要的公共卫生问题。以往治疗该病的手段主要集中在一下几种:药物治疗、手术切除、营养制剂和生物制剂。但由于溃疡性结肠炎病因的不明确性,症状的复杂多变性,以上治疗手段皆会对患者造成一定的负面影响,严重时会引起其他的并发症,因此越来越多的人开始探寻中药制剂治疗溃疡性结肠炎的新方法。中药制剂治疗病因复杂的疾病具有独特的疗效,其副作用可控、疗效经过千百年的验证,多味药材相组合可以减弱药物毒性的同时,增强君药对疾病的治疗效果。本试验以中兽医理论为基础,研究多种药材相组合对溃疡性结肠炎模型小鼠的治疗效果,力求筛选出效果较好的药味组合,为研究治疗溃疡性结肠炎特效药方作出贡献。试验一:遵循药物配伍禁忌拟定3个中药组方。为了探寻清肠调血组方、健脾祛湿组方、调肝理脾组方对葡聚糖硫酸钠诱导的溃疡性结肠炎小鼠的治疗效果。试验将雌性C57BL/6小鼠(6～8周龄,18～20 g)66只,随机分成11组,每组6只。空白对照组(K组)、模型组(S组)、清肠高剂量组(A组)、清肠中剂量组(B组)、清肠低剂量组(C组)、健脾高剂量组(D组)、健脾中剂量组(E组)、健脾低剂量组(F组)、调肝高剂量组(G组)、调肝中剂量组(H组)、调肝低剂量组(I组)。第一周各组适应性饲养,第二周除空白对照组外,每组3%葡聚糖硫酸钠水溶液自由饮水持续7d,建立急性溃疡性结肠炎模型,第三周更换正常饮水,空白对照组和模型组生理盐水灌胃,药物组分别给予不同浓度灌胃,观察记录小鼠临床表现,采集全血分离血清,检测血清中免疫球蛋白G(Ig G),免疫球蛋白A(Ig A),白细胞介素-8(IL-8),白细胞介素-10(IL-10),二胺氧化酶(Diamine oxidase,DAO),D-乳酸的质量浓度变化,同时制作小鼠结肠病理切片。结果表明:模型组相较于空白对照组中D-乳酸、白细胞介素-8(IL-8)、免疫球蛋白G(Ig G)、免疫球蛋白A(Ig A)、二胺氧化酶(DAO)的质量浓度极显著增高(P<0.01),白细胞介素-10(IL-10)质量浓度极显著降低(P<0.01),给药后清肠调血组方、健脾祛湿组方、调肝理脾组方9组小鼠均有不同程度的炎症缓解,D-乳酸、IL-8、Ig G、Ig A、DAO质量浓度均有不同程度下降,IL-10质量浓度上升。说明清肠调血组方、健脾祛湿组方、调肝理脾组方对DSS诱导的溃疡性结肠炎有良好的治疗作用。试验二:探寻拟定的3个中药组方对溃疡性结肠炎小鼠肠道内微生物群落的影响。溃疡性结肠炎的发生往往伴随着结肠肠道菌群丰度和结构的改变,因此利用16Sr RNA扩增子测序技术对小鼠结肠内容物中菌群的分布进行分析。结果表明:经过3个中药组方制剂的干预后,溃疡性结肠炎模型小鼠结肠菌群结构得到恢复,可增加部分有益菌如Patescibacteria(P<0.05)、Muribaculaceae(P<0.05)、Lactobacillus(P<0.05)、Prevotellaceae UCG001(P<0.05)的丰度,减少部分有害菌如Verrucomicrobiota(P<0.05)、Desulfobacterota(P<0.05)、Lachnospiraceae NK4A136group(P<0.05)、Campilobacterota(P<0.05)、Actinobacteriota(P<0.05)、Bacteroidaceae(P<0.05)、Tannerellaceae(P<0.05)的丰度。

关键词： 腐植酸   文献计量学   非水电导滴定   黄曲霉毒素B1   生物膜  

摘要： 腐植酸(Humic acids,HAs)是一类富含酚羟基与羧基等活性基团的高分子化合物,具有极好的修复肠道损伤和治疗肠道疾病的功能。遗憾的是,HAs的作用机制尚不清楚。本文从HAs分子结构和性质出发,通过以下工作探究其作用机制:(1)采用文献计量学法,对HAs领域的文献进行系统评价。对1980-2020年发表的9145篇文献的特征进行深入分析后发现,与HAs相关的文献发表数量增长迅速,中国发表数量最多(3109篇),其次是美国(1949篇)和德国(679篇)。具体而言,中国科学院的文献数量最多(647篇),是最具生产力的机构,同时也是机构合作网络的中心。与HAs相关的研究主要集中在环境领域,HAs在处理重金属和有机污染物方面的应用及其机理是环境领域的重要研究课题。HAs可以降低多种有机污染物的毒性,或通过光降解和吸附作用消除污染物,分子中的羧基和酚羟基是其发挥作用的关键基团。此外,HAs还可用于处理重金属污染物。HAs对重金属具有吸附作用,从而降低了重金属在环境中的迁移率和毒性。另外,HAs在传统医学领域被用作止泻药物;在养殖业被用作饲料添加剂促进畜禽生长速率和健康;在农业中,HAs可以通过改善土壤和提高肥料利用率来提高作物生长和质量;还可用于碳固存以适应气候变化。然而,文献计量分析表明HAs的分子结构仍然不清楚,从而限制了机制的阐明和进一步的应用。这些发现强调了HAs与环境之间的相互作用,并提供了关键的见解,这不仅支持HAs在环境领域应用中的进一步开发,也为HAs在其他领域中的研究和应用提供新的思路。(2)目前定量测定HAs分子中酸性基团的方法或操作复杂,或检测难度高,或测量结果不准确。因此该部分建立了一种可快速、准确测定HAs中酚羟基和羧基含量的方法——非水电导滴定法(NACT)。通过优化HAs样品的p H值、滴定液浓度和氮气流速,确定了最佳滴定条件为:样品p H值为4,滴定剂浓度为0.05mol/L,氮气流速为80 m L/min。NACT测定的对羟基苯甲酸的酚羟基含量为758.82±111.76 cmol/kg,羧基含量为744.44±51.11 cmol/kg。对羟基苯甲酸中酚羟基和羧基的理论含量均为723.96 cmol/kg,表明该方法可以准确定量对羟基苯甲酸中的羧基和酚羟基。使用NACT测定的HAs标准品中酚羟基和羧基含量与传统方法(醋酸钙法)测定结果无显著差异,这表明NACT可快速、准确地测定HAs中酚羟基和羧基的含量。此外,利用NACT对全国8个省/自治区的29个HAs样品进行了酸性基团的含量测定,选择酸性基团含量最高的一种HAs进行后续试验。(3)黄曲霉毒素B1(AFB1)是黄曲霉和寄生曲霉等菌种产生的次级代谢产物,是目前公认的毒性最强的天然有机污染物,具有极强致癌性,广泛存在于食品中。通过上述研究我们得知,HAs具有吸附有机污染物的潜力,分子中的羧基和酚羟基是其发挥作用的关键基团。因此,该部分工作选择酸性基团含量较高的S6号HAs样品,并就其对AFB1攻毒小鼠的作用效果进行了深入研究。结果显示,HAs减轻了AFB1诱导的肝细胞肿胀和炎性细胞浸润。HAs还恢复了受AFB1干扰的肝脏中各种酶的水平。HAs通过增强小鼠的免疫功能,显著减轻AFB1引起的氧化应激和炎症反应。HAs通过增加小肠长度和绒毛高度来修复被AFB1损害的肠道屏障功能。此外,HAs重建了肠道微生物组,增加了Desulfovibrio、Odoribacter和Alistipes的相对丰度。体外和体内试验都表明HAs可以通过吸附作用有效地去除AFB1。综上,HAs可以通过增强肠道屏障功能、调节肠道微生物群和吸附作用来减轻AFB1诱导的肝损伤。(4)肠道微生物组与炎症性肠病(Inflammatory bowel disease,IBD)高度相关。从Web of Science Core Collection数据库中共提取了2000-2020年与这两个术语相关的3890篇文献,从文献计量学角度对关联性进行了研究。自2008年以来,与该领域相关的文献数量迅速增加。美国和哈佛大学分别是发表文献数量最多的国家和机构。《Inflammatory Bowel Diseases》是最多产的期刊,共刊发了211篇文献。该领域最有影响力的期刊是《Gut》,引用次数为13359次。共被引分析显示,IBD相关主题中关注度最高的是“gut microbiota”、“metagenomics”、“bacterial community”、“fecal microbiota transplantation”、“probiotics”和“colitis-associated colorectal cancer”。关键词聚类和关键词突发分析显示,肠道菌群、宏基因组学和粪便菌群移

关键词： 黄曲霉   黄曲霉毒素B1   高通量测序   根际及果壳微生物   群落组成  

摘要： 黄曲霉菌是一种腐生性病原菌,侵染范围非常广,通过土壤侵染花生,潜伏至采收后发病,在花生和玉米等农作物发生尤为严重。并且在侵染后可产生有毒的次级代谢产物黄曲霉毒素,黄曲霉菌侵染是导致花生黄曲霉毒素污染的主要元凶。黄曲霉毒素毒性大、致癌力强,对我国花生安全生产造成严重威胁。其中,花生荚壳是花生抵御黄曲霉菌侵染的第一道防线。然而,花生根际及果壳微生物群落组成与黄曲霉菌关系不明确。因此,本试验选择抗黄曲霉花生品种中花6号、天府18以及敏感品种鄂花6号,解析花生不同生育期(苗期、开花期、成熟期)抗性品种以及敏感品种根际及果壳微生物差异;采用qPCR技术解析抗、感品种间黄曲霉产毒菌关键基因丰度差异以及HPLC-MS/MS测定抗感品种间黄曲霉毒素含量差异。本试验主要结果如下:1、测定了苗期、开花期及成熟期花生根际及果壳微生物的α多样性、β多样性和微生物群落组成。发现微生物群落间的多样性和丰富度会因花生品种、花生生育期及花生采土部位等因素产生差异。α多样性结果表明,在成熟期抗性品种(天府18及中花6号)果壳中微生物Shannon指数显著高于鄂花6号;β多样性结果表明,PCOA发现苗期不同品种间根际微生物群落结构无显著性差异;花期中花6号与鄂花6号根际以及果壳周围微生物群落结构逐步分离;成熟期中花6号与鄂花6号根际以及果壳周围微生物群落结构显著分离。在花期和成熟期抗性品种中门水平中Acidobacteriota,Myxococcota,Gemmatimonadota 及 Planctomycetota 的相对丰度显著增加。进一步LEfSe分析发现,根际和果壳中抗性品种显著富集Pseudomonas,Pantoea,Lysobacter,Stenotrophomonas,Paenibacillus及Bacillus明显富集。抗性品种与敏感品种在花期和成熟期的微生物群落结构存在巨大差异,初步推测以上6种菌可通过一定的作用机制抵抗黄曲霉侵染及产毒。2、通过LEfSe分析从抗黄曲霉品种中筛选出6株优势菌株,并测定了 6种菌株在成熟期花生果壳和根际的相对丰度。发现Lysobacter在抗性品种中的相对丰度显著高于敏感品种,结合在花生成熟期果壳中抗感品种在黄曲霉菌产毒存在显著差异的结果,发现黄曲霉菌的产毒量会因Lysobacter的相对丰度变化而变化,成负相关关系。表明Lysobacter在抗性品种中富集,对侵染花生的黄曲霉菌存在抵抗作用。3、利用qPCR方法测定了成熟期花生中黄曲霉产毒关键基因F-omt基因的拷贝数,发现F-omt基因的拷贝数因采样部位和花生品种等因素而产生差异的结果。花生成熟期果壳中敏感品种鄂花6号中黄曲霉菌产毒关键基因F-omt基因拷贝数为抗性品种(中花6号和天府18)的1.45～1.70倍,花生成熟期果壳中敏感品种鄂花6号中黄曲霉菌产毒关键基因F-omt基因拷贝数为抗性品种(中花6号和天府18)的1.17～1.93倍。这些结果表明:黄曲霉菌产生黄曲霉毒素与花生抗性存在一定联系,推测花生自身产生特殊化学部分招募有益微生物抵抗黄曲霉菌的侵染及产毒。4、构建了花生果仁和果壳中黄曲霉毒素B1快速检测方法。在0.01～0.1 mg/kg范围内,果壳样品中黄曲霉毒素B1的平均回收率为73.41%～106.69%,相对标准偏差(RSD)为3.52%～8.71%;果仁样品中黄曲霉毒素B1的平均回收率为70.25%～89.65%,RSD为3.38%～5.56%。进一步样品检测发现,果仁和果壳样品中黄曲霉毒素B1均未检出。表明花生黄曲霉产毒量均很低。

关键词： 芩连秦皮汤   犬细菌性腹泻   Toll样受体4(TLR4)   核因子κB(NF-κB)  

摘要： 犬细菌性腹泻作为犬类(Canis lupus familiaris)常见的由病原菌引起的腹泻性疾病，临床常使用抗生素治疗，增加了耐药菌出现的几率。芩连秦皮汤在幼儿细菌性腹泻治疗中具有良好的疗效，本研究拟明确芩连秦皮汤在犬细菌性腹泻中的治疗效果。首先使用半仿生酶提取法提取芩连秦皮汤有效成分，以打孔法检测提取物的体外抑菌效果，利用Cell Counting Kit-8 (CCK-8)检测中药提取物的细胞毒性；进一步以大肠杆菌(Escherichia coli)感染犬肠上皮细胞，利用q RT-PCR、Western blot和ELISA方法检测提取物对Toll样受体4 (Toll-like receptor 4, TLR4)、核因子κB (nuclear factorκB, NF-κB)、白细胞介素1β(interleukin 1β, IL1β)、IL6、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)、B淋巴细胞瘤-2 (B cell lymphoma-2, Bcl2)和Bcl2相关蛋白X (Bcl2-associated X, Bax)基因及蛋白水平的影响，使用TUNEL法检测细胞凋亡；最后，使用观察法明确提取物对犬细菌性腹泻的临床治疗效果。体外实验结果显示，中药提取物能够有效抑制大肠杆菌生长，在一定浓度范围和作用时间内无细胞毒性；在大肠杆菌感染的犬肠上皮细胞中，中药提取物能够显著抑制TLR4、NF-κB、IL1β和IL6基因表达，降低TLR4蛋白表达和NF-κB磷酸化水平，减少IL1β和IL6分泌水平；同时降低PCNA蛋白表达和Bcl2/Bax水平，降低细胞凋亡率。在体实验结果显示，中药提取物对犬细菌性腹泻有效，虽然单独治疗的时间长于头孢曲松钠，但是其与头孢曲松钠的中西药联合治疗使止泻时间明显缩短。上述结果提示，中药提取物可能通过抑制炎性因子的表达和分泌来抑制大肠杆菌引发的炎性反应和细胞凋亡，从而发挥对犬细菌性腹泻的治疗作用，并减少临床治疗过程中的抗生素使用。本研究为芩连秦皮汤在犬细菌性腹泻临床治疗中的应用提供基础资料。

关键词： AFB1   基因挖掘   脱毒酶   基因表达   毕赤酵母   降解产物   毒性分析  

摘要： 黄曲霉毒素（AFT）是由曲霉属真菌在高温高湿条件下产生的一类致癌性真菌毒素,广泛分布于自然界。其中黄曲霉毒素B1（AFB1）被认为是最常见和最有害的AFT,对哺乳动物和家禽有致癌性、DNA突变、免疫毒性和肝毒性等毒性作用。花生、玉米、棉花和辣椒等不同农作物在生长、存储和加工时极易受到AFB1的污染,并通过食品和农副产品对人类和动物的健康带来严重威胁,并且给世界经济造成了数十亿美元的损失。目前已经报道了多种去除AFB1的策略,大致可以分为物理法、化学法和生物法。生物法因其温和的降解条件,对农作物营养价值的影响最小,被认为是最具有潜力的解毒方法。本研究基于Pac Bio测序平台,对实验室早期筛选的AFB1高效降解菌土曲霉（Aspergillus terrus）HNGD-TM15进行全基因组测序和组装,系统分析挖掘其降解AFB1的基因,并在大肠杆菌和毕赤酵母中实现异源表达,扩展黄曲霉毒素微生物降解资源库。并且探究重组菌对AFB1的降解机理,以及降解产物的肝毒性和致突变作用。具体研究总结如下:1.首先,对实验室前期筛选得到的AFB1降解菌土曲霉HNGD-TM15进行了三代全基因组测序,得到了该菌株的编码基因及蛋白序列,并对其基因与常用数据库进行BLAST比对和注释。全基因测序结果显示:该菌株总基因大小34.39 Mbp,总长度为24,983,996 bp,序列GC含量为52.23%。此外,利用BLASTp方法与报道过的AFB1降解酶基因进行比对,以及基因功能注释筛选,共得到5个AFB1降解酶基因。2.对挖掘得到的所有基因进行扩增、载体构建以及在大肠杆菌中表达和纯化,对纯化的酶液进行AFB1降解功能验证。通过提取土曲霉RNA,反转录得到的c DNA为模板,PCR扩增得到了所有候选基因,并对基因进行回收和纯化。纯化后的基因浓度分别为87.0、84.2、98.2、107.3和93.1 ng/μL,提取p ET-28a载体的质粒浓度为179.3 ng/μL。以p ET-28a为表达载体,通过同源重组的方式将5个候选基因与p ET-28a连接,经过质粒PCR、双酶切、测序等方式验证,成功构建表达载体。将构建好的带有候选基因的质粒分别转入大肠杆菌BL21中进行蛋白表达,经过IPTG诱导,成功表达四个候选基因。其中重组FET3、DDP3、和Cpo P酶为包涵体表达,分子量大小分别为65、36和36 k Da。重组Frs A酶为可溶性表达,分子量大小为32 k Da。重组Frs A酶为可溶性表达,分子量大小为32 k Da。将纯化的重组蛋白与AFB1混合,FET3、DDP3、Frs A和Cpo P对AFB1的降解率分别为8.6%、55.18%、20.58%和11.6%,在介质存在的情况下,FET3的降解率也只有21.45%。3.将验证得到的降解酶基因DDP3在毕赤酵母中异源表达,并命名为ATADE。首先将ATADE基因序列进行密码子优化,优化后序列GC含量由53.93%降至41%,密码子适应指数（CAI）由0.68升至0.94。采取同源重组技术,选择p PIC9K-6His作为异源表达ATADE的真核表达载体,将优化的ATADE基因与所选载体相连,得到了重组表达载体p PIC9K-His-ATADE,将构建好的重组质粒电转化入毕赤酵母GS115,构建成重组菌GS115（p PIC9K-His-ATADE）。由于p PIC9K-His是分泌表达载体,对发酵上清液进行分离纯化,得到了目的蛋白,经SDS-PAGE电泳条带显示,分子量大小为36 k Da,并且酶活检测结果表明重组蛋白具有AFB1降解酶的活性。此外,对重组菌GS115的小型摇瓶发酵条件经优化,小型摇瓶发酵条件经优化得到的最佳诱导条件为:接种量为2.5%,保持甲醇浓度为4%,在30℃的诱导温度下诱导72 h。通过不同p H以及温度下重组ATADE对AFB1的降解发现,该酶对p H敏感,且在碱性条件下降解率更高。此外,在温度30℃～40℃时更适合AFB1降解。4.对降解酶的降解产物进行检测,得到降解产物的结构以及推测降解路径,并通过斑马鱼实验和Ames实验证明降解产物的毒性和致突变性作用。通过UPLC-MS检测,根据测定的母体离子和碎片质量,以及AFB1的标准分子量,我们确定了AFB1和四个可能的降解产物,这些组分的m/z分别为299.0914(C17H14O5)、343.0812(C18H14O7)、287.0914(C16H14O5)、375.1074(C19H18O8)。根据产物的二级质谱碎片图谱及相关文献,得到了降解产物的分子结构,通过对产物的结构推测降解产物的生成途径,主要是内酯环断裂以及呋喃环的取代反应。此外,通过斑马鱼实验和Ames实验对降解产物的肝毒性和致突变性进行评估。结果表明,

关键词： 黄曲霉毒素B1   黄曲霉毒素M1   膳食暴露   风险评估   疾病负担   伤残调整寿命年  

摘要： 研究目的黄曲霉毒素(Aflatoxin,AF)是黄曲霉和寄生曲霉等某些菌株产生的有毒次级代谢产物,可污染多种农产品,威胁食品安全。AF毒性的大小随结构或种类的不同存在较大的差异,其中黄曲霉毒素B1(Aflatoxin B1,AFB1)的毒性最大,致癌性最强,其次为黄曲霉毒素M1(Aflatoxin M1,AFM1)。研究发现长期AF暴露会增加肝癌发生风险,特别是对于患有慢性乙型肝炎的人群,严重影响人体健康。山东省作为农业大省,农产品中AF的污染水平对维持人群健康至关重要。因此,本研究通过分析山东省主要食品中AFB1和AFM1污染状况,结合居民食品消费量计算山东省居民膳食暴露于AFB1和AFM1导致的健康风险,以及评估采取AF防控措施降低疾病负担的效果,为食品安全部门采取风险管理措施提供科学依据。研究方法本研究从山东省16个地级市采集玉米及其制品270份、小麦及其制品1015份、大米103份、花生及其制品166份、其他熟制坚果466份、花生油80份、玉米油125份、其他植物油(除花生油和玉米油)209份、调味品216份、婴幼儿谷类辅助食品89份和乳及乳制品645份,共计3384份。对采集的样本采用免疫亲和层析-高效液相色谱法进行检测。通过点评估法对山东省食品中AFB1和AFM1进行膳食暴露风险评估;通过肝癌发病风险法、暴露限值法(margin of exposure,MOE)和危险指数法(hazard index,HI)评估山东省居民膳食暴露于AFB1和AFM1导致的致癌风险和非致癌风险;通过儿童发育迟缓的风险评估了解AFM1暴露对儿童年龄别身高Z评分(height-for-age z-score,HAZ)的影响;通过伤残调整寿命年(disability adjusted life year,DALY)评价AFB1和AFM1防控措施降低疾病负担的效果。研究结果1.山东省主要食品中AFB1总阳性率为6.50%(178/2739),总不合格率为0.95%(26/2739)。花生油中AFB1污染水平最高,AFB1样本阳性率为26.25%(21/80),含量均值为9.33μg/kg,最大值为274.00μg/kg,其中散装花生油中AFB1的污染水平远高于预包装花生油,差异具有统计学意义(P<0.05)。农村居民AFB1总暴露量高于城市居民。2～6岁年龄组人群通过食用花生油暴露于AFB1导致的健康风险最高,其MOE值小于10000,一般人群和消费人群肝癌发病风险分别为0.0846例和0.3512例/10万人。严格执行限量标准后,在食用花生油的一般人群和消费人群中,由于AFB1暴露导致的肝癌疾病负担分别降低3928和18600;针对AFB1采取的不同防控措施每年可减少的DALYs 为 232-20580。2.山东省乳及乳制品中AFM1总阳性率为4.03%(26/645),总不合格率为0。婴幼儿配方奶粉中AFM1污染水平最高,其样本阳性率为11.51%(16/139),最大值为0.19μg/kg。2～3岁年龄组暴露于AFM1产生的致癌风险最高,肝癌发病风险为0.0025例/10万人。2～3岁消费人群通过食用液态乳和婴幼儿配方奶粉可能会导致非致癌风险以及发育迟缓风险。AFM1防控措施有助于每年减少的DALYs为6.21-11.58。研究结论1.山东省花生油中AFB1污染水平最高,散装花生油中AFB1污染水平高于预包装花生油。乳及乳制品中婴幼儿配方奶粉的AFM1污染水平最高,冬季乳制品中AFM1浓度高于其他季节。2.农村居民的AFB1总暴露量高于城市居民;2～6岁年龄组儿童暴露于AFB1导致的健康风险最高;2～3岁年龄组儿童通过食用液态乳和婴幼儿配方奶粉暴露于AFM1可能会导致非致癌风险;儿童早期接触AFM1可能与发育迟缓有关。应对2～6岁年龄组的儿童予以重点关注。***1防控措施以及严格执行限量标准可以有效降低人群的肝癌疾病负担;AFM1防控措施对于降低人群的肝癌疾病负担影响较小。