关键词： 黄曲霉毒素B1   农产品   纳米体系   预防   吸附   光催化  

摘要： 农作物真菌病害是影响农作物稳产增产的重要因素,病原真菌产生的真菌毒素造成了世界范围内的粮食和农产品的巨大损失,极大阻碍了农业的绿色可持续发展,成为全球粮食安全的重大威胁。黄曲霉毒素是一类主要由曲霉属真菌(Aspergillus sp.)产生的以双呋喃环香豆素为骨架的真菌毒素,包含B、G和M族等十余种毒性化合物,其中黄曲霉毒素B1(Aflatoxin B1,AFB1)具有强烈的致癌性、致畸性、致突变性和急性肝毒性,是在农产品中存在最广泛、危害最严重的真菌毒素之一。因此,关于AFB1预防和脱除技术的研究已成为食品安全和农业领域的研究热点。近年来,纳米技术由于其在尺寸定制、功能化修饰和理化稳定性等方面的优势在农业领域中的研究发展迅速,在农药控释、土壤修复和病原物治理等方面显示出巨大的应用潜力,也为真菌毒素预防和脱除提供了新的策略。据此,本文设计并构建了三种功能化的纳米体系,分别用于农产品中AFB1的绿色防治,吸附脱除和光催化降解。研究内容和结果如下:(1)以Tween-80为表面活性剂,通过高压均质化技术制备了一系列基于不同比例美国薄荷和栉叶蒿精油的纳米乳剂,并通过动态光散射、扫描电镜和高速离心法对它们的形态、尺寸和稳定性进行了表征。所制备的纳米乳剂(命名为MNEO 1-5)对高毒性菌株Aspergillus flavus CF-79具有显著的生长抑制作用,并降低高温和潮湿储存环境下花生中AFB1的积累量,其中,美国薄荷精油含量最高的纳米乳剂(MNEO-1)活性最为突出(IC50=4.70 mg g–1)。通过气相色谱-质谱检测证明百里酚是美国薄荷精油中的主要成分(92.3%),进一步验证了百里酚对*** CF-79具有显著的生长抑制效果(IC50=14.5 mg L–1),并引发菌丝体中活性氧的积累和细胞膜损伤。利用高通量转录组测序筛选百里酚处理下*** CF-79中的差异表达基因,根据富集分析揭示了百里酚能通过调控多种代谢途径增强菌丝细胞的三羧酸循环,并诱导ROS积累,从而导致细胞死亡;同时,百里酚可能通过下调黄曲霉毒素生物合成通路中炔诺酮单加氧酶等酶活性以减少AFB1的产生和积累。以药(食)用植物精油开发的防控剂型可能是解决农产品保存过程真菌毒素污染问题的最安全有效的策略。(2)通过溶剂水热法合成了具有多孔结构和优异分散性的金属有机框架(MOF)材料MIL-101(Fe),研究其作为吸附剂对AFB1的去除能力。对不同条件下MIL-101(Fe)对AFB1的吸附性能开展了试验,并结合吸附热力学、吸附等温线模型和吸附动力学模型对吸附过程进行解析。结果表明:MIL-101(Fe)吸附剂稳定性强,而且与已经报道的其他吸附剂相比,MIL-101(Fe)对AFB1表现出更加优越的负载能力(30.58 mg g–1)。同时,利用分子对接和计算化学手段建立了AFB1分子与MIL-101(Fe)配体之间的相互作用模型。此外,通过表面疏水性修饰制备了TMCS-MIL-101(Fe),改善了材料在疏水相中的分散性,进而实现了对花生油中AFB1的有效去除。这项工作为农产品中AFB1的去除提供了一种简单有效的途径。(3)我们设计了一类基于MOF材料的具有多种组合模式(SS型,SL型和LS型)的Fe3O4@Ui O-66磁性纳米体系用于AFB1的脱除。得益于Ui O-66的多孔结构和Fe3O4的光催化增强效应,复合体系实现了对AFB1的高效吸附和光催化降解(90%以上)。此外,SL-和LS-Fe3O4@Ui O-66催化剂在外部磁场的作用下具有极高的回收率,并且在三次循环后仍保持80%以上的脱除能力。电子顺磁共振波谱检测表明,在光催化过程中产生了大量的羟基自由基,致使AFB1结构中C8=C9双键被破坏,从而降低其毒性。为了进一步考察光催化脱毒的可靠性,利用UPLC-Q-TOF-MS/MS技术对11种产物进行了分析,并通过核磁共振技术确定了其中7种主要产物的结构,随后根据AFB1及其光催化产物的结构特征,提出了可能的光催化反应机理,同时,利用LO-2细胞系评估了7种主要产物的细胞毒性。研究表明:具有吸附效应和光催化协同作用的Fe3O4@Ui O-66体系是一种AFB1脱除的可靠手段,为开发具有磁性回收能力的新型真菌毒素光催化剂开辟了新的途径。本文研究将为农产品中AFB1的防治提供参考,为开发绿色、高效的新型真菌毒素防控技术提供理论支撑,对于农业的可持续发展具有重要的现实意义。

关键词： 中药提取物   黄连素   多囊卵巢综合征   半乳糖凝集素-3   胰岛素抵抗  

摘要： 目的:观察黄连素对多囊卵巢综合征(PCOS)合并胰岛素抵抗(IR)的不孕症女性血清半乳糖凝集素-3(Galectin-3,Gal-3)及炎症因子和IVF助孕结局的影响,探讨Gal-3与PCOS发生的相关性以及黄连素改善PCOS-IR的可能作用机制,为黄连素在PCOS治疗中的应用及生殖领域的研究提供理论支持和临床依据。方法:将符合纳入标准的90例行IVF治疗的PCOS-IR患者随机分为黄连素组(治疗组45例)和二甲双胍组(对照组45例),在实施IVF治疗前,分别给予口服黄连素和二甲双胍治疗3个月。干预结束后,所有患者均采用拮抗剂方案超促排卵。检测干预前后的月经第3日血清性激素水平、血糖、胰岛素、血脂等相关指标;另取剩余部分血清送检,采用ELISA方法测定Gal-3、TNF-α和IL-6水平;计算患者的BMI值、HOMA-IR指数;于HCG日抽血测定性激素水平;统计患者Gn用量及使用天数、获卵数;计算受精率、优胚率、新鲜周期取消率等,随访比较两组的临床妊娠、早期流产情况,并将性激素水平、血糖、胰岛素、血脂指标与Gal-3含量进行相关性分析,应用SPSS26.0软件分析研究数据。结果:1.血清性激素水平:经药物治疗,两组患者月经第3日血清LH水平均得到有效改善(P<0.05),黄连素在改善第3日血清T水平方面疗效显著(P<0.01)。***及血糖、血脂指标:两组患者治疗后BMI、空腹葡萄糖、OGTT2h PG、总胆固醇、甘油三脂、低密度脂蛋白胆固醇水平显著下降(P<0.05),黄连素组治疗后空腹胰岛素、OGTT2h INS、HOMA-IR指数均有明显改善(P<0.05)。***-3、TNF-α和IL-6:两组药物均可显著改善患者血清Gal-3、TNF-α和IL-6水平(P<0.05),且黄连素改善IL-6的效果明显优于二甲双胍(P<0.05)。***指标:两组间获卵数、受精率、新鲜周期取消率、临床妊娠率及早期流产率无统计学差异;二甲双胍组Gn用量更少,黄连素组患者的优胚率高于二甲双胍组。相关性分析:Gal-3水平与BMI、FPG、CHOL、TG、LDL-C、IL-6、TNF-α、HOMA-IR、OGTT2h INS指标成正相关(P<0.05)。其中BMI、FPG、CHOL、TG、LDL-C、IL-6、TNF-α指标与其关系更为密切;进行多重线性回归分析发现,Gal-3受TNF-α、BMI影响明显。结论:1.黄连素可以降低PCOS-IR患者的BMI、血糖、胰岛素、血脂水平,帮助患者减重、提高胰岛素敏感性,且改善胰岛素及HOMA-IR表现更佳,能够有效纠正代谢紊乱,改善IR状态。2.黄连素对PCOS-IR患者的血清LH、T水平有明显改善,尤其是降低T水平方面,较二甲双胍更具优势,能够有效提高卵子质量和优胚率,改善IVF助孕结局。3.黄连素与二甲双胍均可降低PCOS-IR血清Gal-3水平及相关炎症因子指标,缓解慢性炎症,从而达到改善IR状态的目的。

关键词： 黄曲霉素B1   适配体   DNA智能水凝胶   可视化检测   Capture-SELEX   杂色曲霉素  

摘要： 真菌毒素中毒性最强的黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1,AFB1）遍布于粮食生产、贮藏、运输和加工等各个环节,其污染已经成为全球亟待解决的问题。因此,对AFB1进行现场化检测和防控显得尤为重要。AFB1分子量低,无免疫原性,现场化免疫检测的抗体制备繁琐且批次间差异性大。作为新型识别元件的适配体其功能类似于抗体但明显优于抗体,具有制备方便、稳定性好、无批次间差异等特点。基于适配体构建的DNA智能水凝胶检测传感器,不仅具有水凝胶疏松多孔的特性,还具有特异性识别、高精度组装、易降解、成本效益高、便携和稳定等特点。然而AFB1前体物质杂色曲霉素（Sterigmatocystin,ST）作为AFB1前置防控不可或缺的一部分,它的危害也不容忽视,但其适配体却鲜有报道。因此,本研究基于现有的AFB1适配体构建了靶标响应DNA智能水凝胶检测传感器,并以ST为靶标,采用改进型Capture-SELEX技术,筛选获得一条高亲和力、高特异性的适配体H Seq02,并借助圆二色谱和分子模拟对接等技术研究了H Seq02和ST的结合机制,以期为黄曲霉毒素B1进行现场化检测和防控提供参考。具体内容如下:***1响应DNA智能水凝胶检测传感器:以DNA智能水凝胶为基底,AFB1适配体为交联剂和识别元件,结合双重信号放大策略,构建了该传感器。当AFB1存在时,会竞争性与其适配体结合,导致水凝胶裂解,辣根过氧化物酶（HRP）被释放,而外切酶Exo I的引入则实现了AFB1的循环,促使水凝胶裂解的更彻底,释放更多的HRP,HRP催化TMB显色,最终以颜色和吸光值的变化,实现AFB1可视化定量检测。结果表明,AFB1浓度在0-500 n M区间内,溶液吸光值的变化与AFB1的浓度具有良好的线性关系,检出限为4.93 n M（S/N=3）。该传感器可以应用于花生油样品中AFB1的检测,检测结果与UPLC-HRMS检测结果基本一致。***适配体Capture-SELEX筛选:以链霉亲和素磁珠为文库固定载体,通过链霉亲和素和生物素的反应,将生物素标记的引物固定在链霉亲和素磁珠上;再通过碱基互补配对,将文库间接地固定到链霉亲和素磁珠上。参考ST半抗原的制备方法,将ST分子活化,增加其水溶性,制备高浓度靶标溶液,并将文库固定的磁珠投入其中孵育,使得对ST具有亲和力的ss DNA从磁珠表面解离进入溶液中,借助磁分离获得PCR模板进行扩增、长短链法制备单链,随后进入下一轮循环。在循环筛选过程中,通过减小文库投入量、降低靶标浓度、缩减正筛选时间、引入负筛选和反筛选等逐渐增强筛选的压力,并借助QPCR荧光扩增曲线对筛选进程进行监控,最终经过16轮的筛选,获得ST的富集文库。3.测序及分析:首先对测序结果进行同源性和相似性分析,初步选定8条适配体候选序列。采用逆向思维,通过构建适配体亲和柱（Aptamer affinity column,AAC）,直接考察适配体的亲和性和特异性,结果显示适配体H Seq02的亲和性能最好,对20 ng ST的回收率可达99.2%;借助17种真菌毒素对基于H Seq02的AAC和市售的抗体亲和柱（Immunoaffinity column,IAC）特异性进行考察,结果表明AAC对除ST之外的16种毒素回收率均低于5%,而IAC对AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、OTA和ST的回收率均高于90%,说明AAC的特异性较IAC好;2.3 nmol H Seq02构建的AAC容量可达82.4 ng。分子对接结果显示H Seq02与ST主要通过氢键结合,结合位点为H Seq02上的DA-29、DT-30、DT3-40碱基和ST分子上的羰基、羟基、甲氧基,而ST与AFT的分子结构差别主要在羰基、羟基上,这也印证了H Seq02对ST特异性识别较好的原因。

关键词： 铜绿假单胞菌   黄曲霉毒素B1   降解产物   毒性研究   异源表达  

摘要： 黄曲霉毒素（Aflatoxins,AFs）是黄曲霉和寄生曲霉等菌株产生的次生代谢产物,其中黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1,AFB1）的毒性最强,分布最为广泛。AFB1不仅严重威胁粮食和饲料的安全性和经济性,也会对人类和动物的健康造成极大的危害,所以研究霉变粮食中AFB1的脱毒机制具有重要的意义。生物法因具有高效、绿色、安全、处理条件温和等特点而成为目前AFB1脱毒的研究热点。然而,关于霉变基质中AFB1的降解,以及重组降解酶的应用方面的报道还比较少。本试验选择铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）作为生物法降解霉变玉米中AFB1的菌株,优化霉变玉米中AFB1的降解条件,初步探究其降解机理及降解产物的毒性,在明确该生物法可行性的基础上挖掘鉴定降解酶基因,对降解酶基因进行克隆表达,并将得到的重组蛋白应用于霉变玉米中AFB1的降解。（1）铜绿假单胞菌发酵上清液降解霉变玉米中AFB1的试验条件优化。以AFB1的降解率为评价指标,通过单因素和响应面试验确定各影响因素的最佳参数。优化后的最佳条件为:料液比25 g/100 m L,温度63℃,p H 11.0,降解时间51.50 h,此条件下验证AFB1的降解率可达到99.67%。（2）AFB1降解产物结构的研究。以紫外可见分光光度法、薄层色谱法和荧光法为基础手段,结果显示降解后的样品在365 nm处的紫外吸收降低,在薄层色谱上的荧光斑点显著变小,荧光强度显著降低,但仍保留荧光特性,推测可能是部分降解产物的内酯环发生断裂。通过UPLC-Q-TOF技术获得降解产物的二级质谱碎片信息并进行分析,鉴定出四个主要的降解产物分别为P1(C17H16O6)、P2(C16H14O5)、P3(C17H14O5)和P4(C16H10O6),并推测降解产物主要是由于AFB1母体结构中基团上的羟基化、还原和脱甲基形成的。（3）AFB1降解产物安全性研究。通过T.E.S.T软件初步预测降解产物的毒性,结果表明AFB1降解产物的毒性整体低于AFB1;采用Ames和CCK-8试验分别对AFB1降解产物的致突变性和细胞毒性分析,结果表明未处理的AFB1显示很强的致突变阳性和很强的细胞毒性,降解72 h后的降解产物呈致突变阴性,细胞毒性明显降低,当AFB1初始浓度为2.5μg/m L,细胞存活率提高了39.55%。（4）采用质谱挖掘鉴定降解酶,并对降解酶基因进行克隆表达。在明确铜绿假单胞菌发酵上清液降解AFB1可行性的基础上,对发酵上清液中的活性蛋白采用非变性电泳法分离纯化,将得到的四个蛋白条带切胶回收蛋白,测得其对AFB1的降解能力均大于55%,并采用质谱对四个蛋白条带进行鉴定。选择降解效果较好的降解酶——过氧化氢酶进行基因克隆和原核表达,将过氧化氢酶基因与表达载体p ET32a经Eco RⅠ和HindⅢ双酶切,体外连接后构建重组原核表达载体,然后将重组载体p ET32a-Kat A转化大肠杆菌BL21中,通过添加诱导剂IPTG成功诱导表达得到重组过氧化氢酶。（5）重组过氧化氢酶诱导表达条件优化及降解活性验证。通过改变诱导温度、IPTG浓度、OD值、摇床转速和装液量优化重组过氧化氢酶的表达条件,优化出的最优诱导条件为在37℃、200 r/min的条件下培养至菌液OD600达到0.8左右时,加入浓度为0.2m M的IPTG,温度21℃,转速为60 r/min,装液量50 m L,诱导15 h。经镍柱纯化得到电泳级的重组蛋白,该重组蛋白对霉变玉米中AFB1的降解率为52.81%。

关键词： 黄曲霉毒素B1   郝克氏青霉   生物降解   鉴定  

摘要： 黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1,AFB1）是真菌毒素中的一种,多存在于谷物中,被世界卫生组织认定为Ⅰ级致癌物,对人类健康和经济发展存在巨大威胁。AFB1高效经济的脱去已成为研究人员广泛关注的问题,生物降解AFB1因其具有低成本、高效率和良好的安全性而被重点关注。本研究调查分析了我国部分地区稻谷、小麦、玉米及其制品中真菌毒素和重金属的污染现状,筛选出了可高效降解AFB1的菌株并进行鉴定,优化其生长条件,初步探究其降解机理及特性。具体研究结果如下:通过检测我国部分地区稻谷、小麦、玉米及其制品中真菌毒素和重金属的含量,统计分析真菌毒素污染现状。结果表明,稻谷及其制品中真菌毒素检出率由高到低依次为ZEN>AFB1>AFB2>AFG1>DON>AFG2;小麦及其制品中AFB1和DON毒素都呈现高阳性率,但超标率维持在较低水平;玉米及其制品中ZEN检出率高达100.00%,超标率为4.44%。稻谷和米粉及其制品中重金属检出率由高到低依次为镉>铅>汞,超标率由高到低依次为铅>镉>汞。通过与AFB1共培养筛选可高效降解AFB1的菌株。结果表明,从62株菌株中筛选出11株可降解AFB1的菌株,其中MD1与AFB1共培养72 h后对AFB1的降解率高达99.2%,经形态学和ITS r DNA基因鉴定,确定菌株MD1为郝克氏青霉（Penicillium herquei）。通过对郝克氏青霉MD1降解AFB1的条件进行优化,提高郝克氏青霉MD1降解AFB1的降解率。结果表明,单因素实验显示接种量为2%,转速为160 r/min,培养基初始p H为7,培养时间为72 h,培养温度为28℃时,菌株MD1与AFB1共培养24 h后对AFB1的降解率最高。响应面优化实验显示以培养温度为28℃、培养基初始p H为8、接种量为1%时菌株MD1与AFB1共培养24 h后对AFB1的降解率可达到最大值,优化后测得的AFB1降解率较单因素优化（86.84%）提升了11.73%。通过分离郝克氏青霉MD1菌悬液中的菌体和发酵液,探究其菌悬液、菌体、孢子液、发酵液降解AFB1的有效部位,并将有效部位菌体破碎后作进一步探究。结果表明,培养72 h后的郝克氏青霉MD1菌悬液和未破碎菌体对AFB1降解率分别为98.15%和28.20%,菌体破碎后对AFB1的降解效果更好,培养24 h后对AFB1的降解率为55.40%。

关键词： 黄曲霉毒素B1   玉米赤霉烯酮   产酶溶杆菌SR02   生物降解   降解特性  

摘要： 黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1,AFB1）作为毒性最强的生物毒素之一,可在人或动物体内蓄积,具有致畸、致癌及致突变等危害;玉米赤霉烯酮（Zearalenone,ZEN）是一种污染广泛的霉菌毒素,广泛分布在玉米、小麦以及一些农副产品中,具有类雌激素作用,两种毒素严重危及人类的健康安全。目前关于这两种毒素的脱毒方法主要包括物理法、化学法和生物法,生物法脱毒具有高效、绿色、安全等特点,是目前真菌毒素去除的主要方法。本文筛选得到一株对黄曲霉具有拮抗活性菌株并能高效降解AFB1和ZEN,对其进行分子鉴定、形态学分析以及胞外水解酶活性测试;研究其生长特性以及对AFB1和ZEN的降解活性,分别对其降解组分进行定位,探究温度、p H、金属离子、蛋白酶K对其稳定性的影响,分析降解产物可能的结构以及对降解途径的推导。主要试验结果如下: （1）从福建省闽侯县溪源江旁苋菜根际土壤中分离筛选得到一株具有拮抗黄曲霉活性的菌株且拮抗活性物质来源于胞外,同时发酵液对被黄曲霉感染花生具有保护作用;经16S r DNA测序分析该菌株为产酶溶杆菌,将其命名为产酶溶杆菌SR02;观察在6种培养基中的菌落均表面湿润有光泽。菌株在LA培养基上能够产生胞外葡聚糖酶、几丁质酶、蛋白酶和纤维素酶。菌株SR02对5μg/m L AFB1的去除率72h达94.02%,溶杆菌对AFB1的降解未见报道。 （2）产酶溶杆菌SR02发酵上清液、菌体、胞内组分对AFB1降解率分别为91.35%,15.45%,9.71%;同时上清液对AFB1的降解性能不受蛋白酶K及高温的影响,且主要活性成分小于3 k Da,证明上清液中起主要降解作用的活性物质并非酶或蛋白,可能是氧化小分子物质。随后研究发酵上清液降解AFB1的最适反应条件;3%甲醇开始抑制菌株SR02在LB培养基中的生长;5μg/m L AFB1对菌株的生长没有影响;10 m M Ca2+、Mg2+、Cu2+、Fe2+、Zn2+、Mn2+能够不同程度的抑制SR02发酵上清对AFB1的降解性能;p H在5.0～9.0范围内有良好的降解作用,降解率随p H值的增加而增加,在p H 9.0时降解率最高（92.41%）,而在p H 5.0去除率仅为55.19%。50%乙腈可以将少量AFB1降解产物提取出来,HPLC检测出3个差异峰;LC-MS检测到降解产物的质子化加合物[M+H]+分别为:m/z 186.13、m/z 301.00、m/z 330.24;因降解产物含量较低,在实验室条件下未能对其进行分离鉴定。在胞外组分检测到H2O2、·OH、·O2-的产生,其中·O2-的产生由还原型辅酶Ⅰ或Ⅱ所致。·OH、·O2-能够不同程度的降解AFB1,因此推测AFB1的降解可能是由于胞外产生的·OH、·O2-所导致并推导其可能的降解途径。 （3）产酶溶杆菌SR02能够高效的生物转化ZEN,上清液、细胞、胞内组分对ZEN的降解率分别为7.55%、79.58%和2.95%,细胞起主要的降解作用,灭活的细胞对ZEN失去转化作用;p H为7.0时有最大的转化率;同时菌株适应广范围的转化温度,30℃时转化率为95.71%。HPLC检测到转化产物ZEN-P的产生,且出峰时间较ZEN标准品提前了0.947 min,推测产物极性大于ZEN本身;通过HPLC制备出转化产物ZEN-P,其UV-Vis光谱与ZEN基本一致,LC-MS检测到降解产物的质子化加合物[M+H]+为:m/z 320.47,与目前报道的α-ZOL,β-ZOL的UV-Vis光谱和质子化加合物[M+H]+基本一致,通过HPLC比较了ZEN-P与α-ZOL的出峰时间与UV-Vis光谱,确定了产酶溶杆菌SR02将ZEN转化为α-ZOL。 本文首次报道溶杆菌能够高效降解AFB1和ZEN,对其降解特性以及活性成分定位的研究为今后AFB1和ZEN的脱毒提供理论参考。

关键词： 畜牧学   黄曲霉毒素B1   硒代蛋氨酸   肠屏障   肠道菌群多样性   非靶向代谢组学   氧化损伤  

摘要： 黄曲霉毒素（Aflatoxin, AFT）是曲霉菌、黄曲霉及寄生曲霉所分泌的一种具有毒性的代谢物，其中黄曲霉毒素 B1（Aflatoxin B1, AFB1）毒性最强，长期摄入会导致肝功能、肠功能损害甚至发生癌变。硒是有机体必需的微量元素，具有预防和保护细胞氧化损伤、炎性和免疫反应的功能，也能够调节肠道微生物群组成，改变机体代谢水平和菌群的硒代谢能力。有研究指出硒对霉菌毒素中毒有较好的预防效果。因此，本实通过多种检测方法对兔的形态、紧密连接蛋白、氧化状态、炎性反应和微生物屏障进行探索，研究硒代蛋氨酸（ Selenomethionine ， SeMet）对AFB1诱导的兔肠屏障损伤的潜在保护作用。　　本试验选用 35 日龄的伊拉兔 50 只，随机分为 5 组，分别为对照组、AFB1组（0.3 mg/kg AFB1）、0.2 mg/kg SeMet 组（0.3 mg/kg AFB1+0.2 mg/kg SeMet）、0.4 mg/kg SeMet 组（0.3 mg/kg AFB1+0.4 mg/kg SeMet）和 0.6 mg/kg SeMet 组（0.3 mg/kg AFB1+0.6 mg/kg SeMet）。0.2 mg/kg SeMet 组、0.4 mg/kg SeMet 组和 0.6 mg/kg SeMet 组从实验第 1 天至第 21 天，饲喂不同剂量的SeMet。在试验第 17 天至 21 天，除对照组之外，其余四组均灌喂 0.3 mg/kg 的AFB1。试验周期为 21 天，试验期间记录兔体重和采食量。试验结束，对兔禁食24 h 后，取兔血浆、空肠组织和盲肠内容物。通过 HE、PAS 染色检测空肠组织形态，免疫荧光检测空肠PCNA表达情况，ELISA检测空肠抗氧化能力和炎性因子的表达水平， qRT-PCR 和 WB 检测 Occludin、ZO-1、Nrf2/HO-1、TLR4/MD2/NF-κB在基因和蛋白水平的表达，使用PCR和 LC-MS对盲肠菌群多样性和代谢物进行检测。　　结果：（1）SeMet预处理能显著提高因AFB1暴露引起的生产性能下降，并调节血浆生化指标的变化，其中 0.2 mg/kg SeMet 预处理效果最好。（2）SeMet预处理能够降低 Nrf2 和 HO-1 表达，显著提高 SOD、GSH-Px 和 T-AOC 活力，显著降低ROS和MDA含量，抑制AFB1暴露诱导的兔空肠组织氧化损伤。其中0.4 mg/kg SeMet 预处理效果最好。（3）SeMet 预处理能够显著提高空肠绒毛高度、杯状细胞数量、空肠 PCNA 表达，显著降低 Claudin-1 和 ZO-1 的表达，抑制 AFB1 诱导的兔空肠屏障损伤。其中 0.2 mg/kg 剂量的 SeMet 预处理效果最好。（ 4 ） SeMet 预处理可以调节 AFB1 诱导的肠道菌群紊乱，并显著改变Lucidenic acid M 、 D-erthro-Sphingosine C-20 、 Oxindole 、 17a,20a-Dihydroxycholesterol 和 L-Aspartic Acid 等代谢物的含量（5）SeMet 预处理能够降低血浆和忙肠内容物中 LPS 含量，抑制 TLR4/MD2/NF-κB 信号通路的激活，降低炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6表达，缓解AFB1诱导的兔空肠炎性损伤。其中0.2 mg/kg SeMet 预处理效果最好。　　以上结果表明，SeMet 可以改善 AFB1 诱导的兔生产性能下降和血浆生化指标的变化;调节空肠粘膜肠绒毛高度、隐窝深度和杯状细胞数量，改善 AFB1 引起的空肠形态损伤。同时，SeMet 可通过上调 Nrf2，下调 TLR4/NF-κB 通路，减轻 AFB1 引起的炎症和氧化应激，改变肠组织形态;并且能够调节肠道菌群和代谢物结构，并促进肠道菌群和代谢物的稳态平衡，进而减轻 AFB1 对肠道的毒性作用，从而有效保护肠道健康。

关键词： 粮食安全   黄曲霉毒素B1   降解菌   降解途径   降解酶   降解基因  

摘要： 真菌毒素污染是长期困扰食品安全的严重问题,对人民群众的健康消费造成巨大威胁。近年来由于极端气候的频繁出现,粮食遭受真菌毒素的污染日益严峻。因此,阻控真菌毒素污染并确保粮油食品质量安全是国家的重大且急迫需求。污染粮食的真菌毒素中,黄曲霉毒素危害不容忽视,它是由曲霉属真菌产生的次级代谢产物,具有高毒性和致癌性且化学性质稳定,如何削减其危害是当前研究的热点和难点。目前,黄曲霉毒素理化削减技术研究广泛,并取得了一定的效果,生物削减技术因其绿色高效、专一、无二次污染等优点,已经成为当前研究的热点。生物法降解黄曲霉毒素的研究中存在降解微生物和降解酶资源不足,降解机制难以解析等问题。本研究首先从受真菌毒素污染的谷物中筛选获得一种既可高效吸附又可快速降解黄曲霉毒素的季也蒙毕赤酵母（Meyerozyma guilliermondii）,采用本文研发的一种同位素示踪与核磁鉴定相结合的方法,找到降解产物并鉴定了其结构。然后通过产物定位法实现了菌株对黄曲霉毒素吸附和降解作用的解耦。最后通过生物信息学和化学分析相结合的方法挖掘并验证了季也蒙毕赤酵母细胞中AFB1关键降解酶基因,完成对降解机制的解析。在以上研究基础上,通过高毒花生粕发酵实验检验了该菌株在复杂基质中脱除黄曲霉毒素污染的潜力。具体研究结果如下:（1）采用富集培养和单菌筛选首次获得一株新的对黄曲霉毒素具有稳定脱毒作用的季也蒙毕赤酵母以安徽省阜南县和山东省潍坊市648份受真菌毒素污染的玉米和稻谷为样品,以AFB1为唯一碳源,通过富集培养,筛选到3种可稳定脱除黄曲霉毒素的菌株。经分子鉴定和形态学分析,确定三种菌分别为季也蒙毕赤酵母、红串红球菌（Rhodococcus erythropolis）和霍氏肠杆菌（Enterobacter hormaechei）,分别对其编号为AF01、AF02和AF03。对三种菌脱除AFB1特性初步分析可得,三种菌株以单菌形式接种至毒素管中可分别脱除85.90%、97.60%和71.00%AFB1,其中AF01菌株对AFB1兼具吸附和降解作用。这是首次报道季也蒙毕赤酵母具有吸附和降解AFB1功能。（2）采用同位素示踪与核磁共振相结合方法快速锁定并确定季也蒙毕赤酵母降解AFB1产物结构,解析该菌株对AFB1吸附和降解的耦合问题,揭示该菌株对AFB1新的降解途径为解耦所筛选季也蒙毕赤酵母（AF01）对AFB1的吸附和降解作用,揭示AF01菌株对AFB1降解途径,本文使用了同位素示踪与核磁共振等多种波谱学技术相结合的方法。首先,基于本文开发的一种时间梯度取样结合同位素示踪质谱分析方法,快速准确锁定了所筛选季也蒙毕赤酵母对AFB1的降解产物。然后,为准确判断AF01菌株降解AFB1这一新降解途径中降解产物结构,对降解产物进行了大量制备和纯化,获得纯度超过90%的降解产物。最后,通过核磁共振技术、高效液相色谱分离手性化合物技术和紫外吸收光谱扫描技术分别确定降解产物的平面结构、空间构型及与标准品的吻合情况。结果表明,降解产物的组成为黄曲霉毒醇（AFL）和黄曲霉毒醇-差向异构体（epi-AFL）,其中AFL占绝大部分。基于上述研究结果,采用产物定位法成功解析AF01菌株各组分对AFB1作用类型。结果表明该菌株发酵上清液对AFB1为吸附作用,胞内裂解液对AFB1为降解作用,活细胞对AFB1主要为降解作用,而灭活细胞则具有吸附作用。本文揭示的季也蒙毕赤酵母降解AFB1途径为首次报道。（3）采用生物信息学分析结合降解产物结构逆向推论发现一种新的AFB1降解酶及其关键编码基因为揭示所筛选的一种季也蒙毕赤酵母（AF01）对AFB1降解机制,本文通过生物信息学分析和降解产物化学结构逆推相结合的方法筛选降解酶及其编码基因。对AF01菌株进行了全基因组测序,然后根据数据库比对、蛋白功能注释和体外实验发现并验证了降解酶关键基因MG2-4。结果表明,该基因所编码的蛋白质由313个氨基酸组成,归属于醛酮还原酶（AKR）家族。该AKR家族降解酶在添加辅酶NADPH下可显著提高AFB1降解效率,且反应条件温和,在37℃下可降解90%以上AFB1。作为首次报道的可降解AFB1的微生物AKR家族蛋白,为AFB1的生物降解提供了新的酶和基因资源。（4）采用水溶液中脱毒和花生粕固态发酵脱毒实验验证所筛选季也蒙毕赤酵母具有显著的脱毒应用潜力为检验季也蒙毕赤酵母（AF01）在实际生产中的应用潜力,本文分别在水溶液和复杂物料（花生粕）中进行脱毒实验。在水溶液的脱毒实验中,使用AF01菌株全菌发酵液及其不同组分与AFB1进行反应。实验结果表明AF01菌株全菌发酵液72 h对AFB1脱除率可达95.55%,包括降解作用和吸附作用,其中吸附作用属于不易解吸的强吸附;发酵上清液对AFB1吸附作用可达71.73%;胞内裂解液对AFB

关键词： 食物过敏   黄曲霉毒素B1   Balb/c小鼠   肠道菌群   KU812细胞  

摘要： 随着社会发展和生产力水平的提高,但是食品的生物性安全问题仍时有发生,每年造成巨大的经济损失并存在极大健康隐患。人们通过摄食受污染的植物性食物（谷物）或动物性食物（肉、奶和蛋）摄入真菌毒素,而对人体健康带来危害。食物过敏是一些特殊人群暴露于某些含有过敏原的食物后所免疫系统的异常反应,其发生率也在逐年上升,严重影响患者的健康与生活质量。鸡蛋、牛奶及花生等食物含有主要的食物过敏原,同时也容易被真菌毒素污染,2种食品安全风险因子都具有免疫毒性,也在这些食物上具有重合性。因此,食品真菌毒素污染对食物过敏发生的影响值得进一步研究,有助于进一步科学评估食物过敏的风险因素。本论文分别从整体动物模型和体外细胞实验研究黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1,AFB1）暴露对卵白蛋白（Ovalbumin,OVA）致敏小鼠主要免疫指标的影响。根据致敏小鼠血清中特异性抗体、肥大细胞蛋白酶、脾细胞分泌细胞因子及空肠中食物过敏相关基因表达等多个理化指标,评估AFB1暴露对OVA致敏小鼠产生的影响;并通过对小鼠肠道切片影响的观察及其肠道内容物菌群的分析,评估AFB1暴露对OVA致敏小鼠的肠道黏膜免疫及肠道菌群的影响。通过构建OVA激发KU812细胞脱颗粒模型,评估AFB1暴露对OVA激发KU812细胞脱颗粒的影响,进一步从细胞水平阐述AFB1暴露对食物过敏的影响。论文研究主要方法、内容和结果如下:（1）采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测OVA致敏小鼠血清中特异性抗体Ig E、Ig G、Ig G1及Ig G2a的含量及其肥大细胞蛋白酶的水平;采用ELISA商用试剂盒检测OVA致敏小鼠脾脏上清液中IL-4、IL-5、IL-13及IFN-γ的水平;采用实时荧光定量PCR（Q-PCR）检测相关基因表达;流式细胞术检测Th1/Th2/Treg细胞的数量。结果表明,OVA致敏小鼠血清中特异性Ig E、m MCP-1水平及Th2细胞产生的细胞因子（IL-4、IL-5及IL-13）水平显著升高,OVA致敏模型构建成功。低剂量AFB1使OVA致敏小鼠的特异性Ig E水平、IL-4及IL-13水平显著提升,分别提升68%、41%及75%;中剂量AFB1使OVA致敏小鼠的m MCP-1和IL-13的水平显著提升;中剂量AFB1使OVA致敏小鼠的m MCP-1和IL-5的水平显著提升,分别提高107%和22%;持续高剂量AFB1对各项过敏指标没有显著改变。在4组AFB1暴露的致敏小鼠体内,与Th1相关细胞因子（IFN-γ）的水平均有所下降,但无统计学意义。这些结果也Q-PCR和流式细胞分析得到进一步验证。（2）通过HE染色法对OVA致敏及其AFB1暴露的BALB/c小鼠空肠组织空肠进行病理分析,并利用Illumina Mi Seq高通量测序平台对不同实验组小鼠盲肠内容物中的细菌16S r RNA V3—V4区的扩增子进行PCR扩增,然后采用生物信息学手段分析AFB1暴露对OVA致敏小鼠的肠道菌群的结构、多样性及差异物种的影响。结果表明,OVA会导致小鼠肠道绒毛断裂以及肠腺体间距明显增宽;高剂量和持续高剂量AFB1暴露对OVA致敏小鼠肠道屏障造成的损伤更严重。OTUs聚类分析（物种累积曲线、RANK分析、花瓣图）结果显示,各组小鼠的OTUs数目范围为514～521,OTUs数目共有率为94.6%,AFB1对小鼠肠道菌群OTUs数目和均匀度影响较小。Alpha多样性分析表明,AFB1暴露并未对小鼠肠道菌群的多样性和丰富度产生较大影响。Beta多样性分析表明,AFB1使OVA致敏小鼠肠道菌群的结构发生重大变化,OVA组与中/高剂量AFB1暴露组小鼠肠道菌群间Beta多样性距离有显著性差异。在门水平上,OVA致敏小鼠肠道厚壁菌门相对丰度显著下降,拟杆菌门和变形菌门相对丰度显著上升。AFB1使OVA致敏小鼠肠道厚壁菌门相对丰度下降,拟杆菌门和变形菌门相对丰度上升,并以高剂量AFB1影响最为显著。（3）采用ELISA法检测AFB1对其释放生物活性介质β-氨基己糖苷酶（β-HEX）与组胺,以及细胞因子（IL-4、IL-6及IL-1β）释放量的影响;然后,采用Q-PCR分析对IL-4和IL-6的m RNA表达水平的影响。结果表明,AFB1对OVA刺激KU812细胞脱颗粒释放β-HEX和组胺的影响较小,但能够促进其分泌细胞因子IL-4、IL-6以及IL-1β,释放量分别提高59%、30%及84%。同时,IL-4和IL-6的m RNA基因的表达水平也被提高,分别提高60%和23%。综上所述,从整体动物模型、肠道菌群分析结果及体外细胞实验结果都证明AFB1暴露会加重OVA致敏性。

关键词： 核酸适配体   纳米材料   比色法   层析试纸条   黄曲霉素B1  

摘要： 真菌毒素由于存在污染广、危害大、防控难、含量低、污染基质复杂等特点,已成为制约我国粮油食品产业发展的重要瓶颈。目前一线粮库入库大多采用的真菌毒素快速检测方法是层析试纸条检测技术,所用的检测设备和试纸条主要靠进口,而且进口的层析试纸条价格昂贵,检测误差较大,样品前期处理时间过长,已经不能满足我国粮食进仓检测需求。因此加快粮食中真菌毒素快速检测关键技术研究已成为保障我国粮食安全的迫切需求。本研究以粮食安全中具有代表性的黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1,AFB1）为研究对象,通过合成颜色信号稳定且强的纳米复合材料作为信号放大元件,同时将适配体作为识别分子代替抗体应进行靶标识别,制备了实验操作简单,信号响应快,结果可视化等特点的适配体比色传感器以及横向流动试纸条检测系统,实现对真菌毒素高灵敏的快速检测,同时扩大了检测范围,降低实验成本。具体研究结果如下:1胶体金适配体比色法检测玉米中的黄曲霉毒素B1以不同尺寸和形貌的金纳米颗粒会呈现出不同的颜色,并且在外界环境因素的作用下,金纳米颗粒之间发生相互作用,从而造成其尺寸和溶液颜色发生变化以及共振峰发生移动为依据,本章将胶体金与核酸适配体通过静电结合作为信号探针,建立了胶体金适配体比色法检测玉米中的AFB1。当溶液中含有AFB1,根据AFB1核酸适配体可以与靶标分子高特异性结合,导致适配体从胶体金表面脱落,从而使裸露在氯化钠中的胶体金溶液聚集,从而产生颜色和吸光度的变化,以此达到对AFB1的可视化快速检测。通过对实验条件的优化,得出该方法的检出限（Limits of Detection,LOD）为0.5ng/m L,且在0.5～50 ng/m L范围内呈现良好的线性关系。通过对加标样品进行检测,得出该方法的加标回收率为90.3%～94.8%,相对标准偏差为7.3%～12.2%。2基于胶体金的适配体层析试纸条检测玉米中的AFB1根据前一章所得到的实验结果,我们可以证明该实验所选用的适配体序列对AFB1有较高的亲和力。为了提高AFB1的检测准确度和灵敏度,基于传统抗原抗体的胶体金免疫层析试纸条的基础上,通过对已有的核酸适配体进行生物素修饰并代替抗体作为试纸条的识别分子,巯基修饰的互补链共价结合金纳米颗粒作为识别探针,同时将链霉亲和素作为试纸条的检测线,利用链霉亲和素与生物素的高亲和力捕获偶联物。最后肉眼观察条带颜色并使用胶体金免疫层析仪扫描以实现对AFB1的定量检测。对影响实验结果的条件进行优化后,得出适配体试纸条法LOD为0.5 ng/m L,检测范围(IC10～IC90)为0.5～200 ng/m L。使用该方法对玉米样品中的AFB1加标回收率为97.3%～120%,相对标准偏差为2.3%～8.3%。3基于花状MoS2@Au复合纳米材料的适配体试纸条检测玉米中的AFB1为了进一步提高检测的灵敏度,使试纸条显色效果更加明显。在前一章胶体金适配体试纸条的基础上,本章通过合成颜色信号稳定且强的纳米复合材料Mo S2@Au代替单独的胶体金颗粒与巯基修饰的互补链共价结合作为试纸条的信号探针。根据花状的二硫化钼具有较大的比表面积,将胶体金附着在其表面的可以提高Au NPs的利用率,同时将生物素修饰的适配体代替传统试纸条中选用的抗体作为靶标识别分子,将链霉亲和素作为试纸条的检测线捕获生物素复合物。通过肉眼观察条带颜色并使用胶体金免疫层析仪扫描以达到快速、准确、定量检测AFB1的目的。通过对关键因素的优化,得出基于花状Mo S2@Au复合纳米材料的适配体试纸条LOD为0.3 ng/m L,检测范围为0.2～200 ng/m L,且该方法在1～50 ng/m L范围内具有良好的线性关系。试纸条对玉米样品的加标回收率为99.4～109.4%,相对标准偏差为3.2%～10.1%。