关键词： 普鲁士蓝   黄曲霉毒素B1   多模检测   光催化   降解  

摘要： 食品真菌毒素的污染导致的食品安全问题引发了广泛关注。联合国粮农组织统计,每年真菌毒素污染导致约10亿公吨粮食损失,严重影响世界经济发展。此外,真菌毒素对人和动物造成遗传毒性、突变、畸形和致癌等不良影响。因此,我们迫切需要高效、新型的检测/降解手段解决真菌毒素污染这一食品安全问题。针对此问题,本文成功制备了性能优异的普鲁士蓝纳米立方体(PBNCs)、磁普鲁士蓝纳米复合材料(MNPs@PBNPs)和普鲁士蓝纳米花(PBNFs)。分别使用PBNCs和MNPs@PBNPs实现了对典型真菌毒素黄曲霉毒素B1(AFB1)的多模检测,克服了传统检测AFB1方法的诸多缺陷,例如操作复杂、特异性差、检测灵敏度低、信号单一、易出现假阳/假阴信号等;首次使用DNA介导合成的多功能PBNFs成功地实现了光催化降解AFB1,这种方法可以弥补传统降解手段的不足,例如降解产物有毒、破坏食品原有的营养风味,以及降解效率低。具体研究内容如下: (1)普鲁士蓝纳米材料的制备与表征 以水热、原位生长和DNA介导的方式分别制备了PBNCs,MNPs@PBNPs和PBNFs。通过水热法成功合成了尺寸为33.73 nm的方形PBNCs。以MNPs为基底,原位生长成功制备MNPs@PBNPs的复合纳米颗粒。我们首次证明了DNA能够以序列依赖的方式调节PBNPs的形态,C30/T30可以介导形成花状结构(PBNFs),而G10和A30可以介导形成立方体堆叠结构。详细的机制研究表明,碱基质子化是影响DNA控制PBNFs形态演变的关键因素。研究发现,通过调节p H、前体浓度、DNA浓度和DNA长度,可以系统地和预测性地控制PBNFs的形态。 (2)PBNFs与大尺寸普鲁士蓝纳米立方体(BPBNCs)的多功能性质比较 通过比较发现,DNA介导合成的PBNFs在光热性能、过氧化物酶模拟活性、光芬顿催化性能和光散射性能等方面均优于BPBNCs,这些性能分别提高了1.2、3.78、1.58和1.93倍。重要的是,二嵌段DNA介导的PBNFs具有优异的生物识别能力。 (3)基于胺与PBNCs相互作用构建改良纳米酶联免疫吸附法检测AFB1 这项工作系统研究了不同胺对PBNCs结构和性能的影响,发现在PBNCs-胺体系中,p Kb值较小的胺能破坏PBNCs的结构,导致PBNCs消光系数和光热效应的衰减。而p Kb值大的胺不能影响PBNCs的结构和性能,但能被PBNCs催化氧化。鉴于乙二胺(EDA)对PBNCs具有很强的破坏性,而邻苯二胺(OPD)则容易被PBNCs催化生成具有荧光和比色信号的氧化态OPD,因此,本研究选择EDA和OPD作为信号调节因子,以PBNCs为底物构建了双模改良ELISA用于检测AFB1。该策略采用乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA·2Na)作为氨基结合剂,负载在标记有AFB1适配体的二氧化硅纳米颗粒上形成检测探针。可以通过调节EDA/OPD的浓度来响应AFB1的浓度,从而实现光热-比色或比色-荧光信号的读取。光热和比色信号可以进行便携式/可视化即时检测,而荧光信号可以进行准确检测。该荧光检测的检出限为94 fg/m L,比AFB1检测试剂盒低319倍。 (4)原位生长PBNPs介导的多模纳米酶联免疫吸附法检测AFB1的研究 这项工作开发了一种新型多模式(光热/比色/荧光)纳米酶联免疫吸附技术,利用MNPs表面原位生成PBNPs,实现了AFB1的高灵敏检测及便携可视化。简单来说,我们以MNPs为载体修饰了链霉亲和素-生物素连接的AFB1适配体,同时Cy5修饰的短链DNA与AFB1适配体互补配对固定在MNPs上,导致Cy5的荧光被淬灭。当AFB1存在时,MNPs、AFB1抗体及AFB1在微孔板上形成夹心结构。加入HCl和亚铁氰化钾后,PBNPs在MNPs原位生长,由于PBNPs具有优异的光热效应和过氧化物活性,因此可产生光热和比色信号;同时,随着原位生长,Cy5荧光信号得以恢复,进而实现超灵敏荧光检测。光热和比色信号可用于便携式/可视即时检测,而荧光信号则可用于精确测定。荧光信号的检测限为0.54 fg/m L,分别比光热和比色分析低6333倍和28倍。 (5)光催化PBNFs降解AFB1的研究 这项工作开发了一种利用808 nm激光器产生的近红外光(NIR)催化PBNFs对AFB1进行降解的新方法。结果表明,4小时内,PBNFs可以实现对AFB1的近100%降解。其中,PBNFs对AFB1的吸附能力可以忽略不计,其光催化能力在AFB1降解过程中起主导作用。经过降解条件的优化分析,我们发现双氧水浓度、PBNFs浓度和光照强度的增加都可以提高光催化降解速率。随后,进行了活性基团捕获实验和AFB1降解产物质谱分析,推断出PBNFs光催化降解AFB1的机理。经过细

关键词： 微嗜酸寡养单胞菌A2   黄曲霉毒素B1   生物降解   小鼠   鹌鹑  

摘要： 黄曲霉毒素是一类由曲霉属真菌产生的双呋喃环类毒素,其分布广,检出率高,对人或动物的机体造成严重伤害,其中以黄曲霉毒素B(AFB)的毒性最强,属于一类高致癌物质。生物降解法是目前饲料中最有应用前景的黄曲霉毒素去毒方法,但微生物或者酶去毒机理研究不够深入、在机体中安全性不够清晰,限制了其在生产中的应用。寻找安全、高效的微生物是去除AFB的有效途径。本论文围绕黑水虻肠源性微嗜酸寡养单胞菌A2降解AFB的作用机制、安全性和有效性开展了系统的研究。(1)微嗜酸寡养单胞菌A2降解黄曲霉毒素B特性与机制分析研究A2菌培养液降解AFB活性成分存在部位,以及降解AFB的影响因素。结果表明,A2菌降解AFB的活性成分主要位于发酵液上清;在p H 8～9时,上清液中AFB的降解效率最高;在20～70℃温度范围内,AFB的降解率逐渐增加,40℃后增加缓慢;48h以内随着反应时间的延长,降解率逐渐增加,24 h达到87%,24h以后降解率增加缓慢;AFB浓度在100～1000 ng/m L,随着浓度增大降解率减少,1000 ng/m L降解率为65%;Zn显著抑制了A2菌上清液对AFB的降解,而Cu、Mn、Mg、Ca和Fe对AFB降解率影响较小。采用液相色谱-串联质谱鉴定A2菌降解AFB产物的结构式。结果显示,在保留时间为8.9min时,鉴定出一种新生化合物,通过化合物碎片离子推断出新生化合物是在母体呋喃环上脱去-C=O和香豆素环上脱去-CH3生成的。为了更进一步探寻活性物质,对A2菌进行二代和三代测序,以目前已知的黄曲霉毒素降解酶基因为目标序列,在A2菌基因组中进行Blastp比对,寻找降解酶,并通过分子对接模拟探寻酶作用AFB的关键氨基酸位点。结果表明,A2基因组中的漆酶ALc对AFB降解发挥作用,降解机制为:微嗜酸寡养单胞菌A2编码的漆酶ALc通过四个氨基酸位点对AFB进行作用,生成母体呋喃环上脱去-C=O和香豆素环上脱去-CH3的产物,降低了AFB的毒性作用。(2)微嗜酸寡养单胞菌A2对AFB诱导下黑水虻幼虫的影响研究A2菌对AFB诱导下的自然幼虫和除菌幼虫生存率、体长、干重、幼虫转化率等生长指标的影响,和对虫沙中AFB含量的影响。结果显示,A2菌显著提高了AFB诱导的幼虫生长性能和降解AFB的能力。(3)微嗜酸寡养单胞菌A2对小鼠安全性分析每天给小鼠灌胃0.2m L/10g体重剂量的A2菌液,试验14天。结果显示:A2组小鼠的常规指标(生长性能、血常规、血清生化指标)、肝脏和肾脏组织的抗氧化指标(总抗氧化活力、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶和丙二醛)、肝脏(IL-β和TNF-α)和脾脏(CD3、CD4、CD8及CD4/CD8)的免疫指标以及肝脏组织病理学切片均与对照组间无显著差异。说明A2菌对小鼠是低毒甚至是无害的。(4)微嗜酸寡养单胞菌A2对采食AFB污染日粮鹌鹑的影响添加不同剂量(1kg/T和2kg/T)的A2菌剂,试验30天,采集样品进行检测。结果显示,A2菌改善了AFB对鹌鹑的料蛋比、肝脏和脾脏指数、血清生化指标(ALP、ALT、TG和CREA)、肝脏和肾脏组织抗氧化指标(总抗氧化活力、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶和丙二醛)、肝脏(TNF-α和IL-β)和脾脏组织指标(CD3、CD4、CD8及CD4/CD8)、肝脏大体形态学和组织病理学的影响,缓解了对鹌鹑盲肠微生物菌群造成的破坏,且随着A2菌添加浓度增加,改善效果越明显。本论文揭示了微嗜酸寡养单胞菌A2产生的漆酶ALC通过四个氨基酸作用位点,将AFB转化为呋喃环脱去-C=O和香豆素环上脱去-CH3的产物,降低了AFB毒性。A2菌对AFB诱导的黑水虻幼虫生长起到促进作用、去除AFB起到协同作用,对采食AFB的鹌鹑有一定的保护效果,对小鼠无毒害作用。本论文的研究为A2菌微生物制剂的开发与应用提供理论支持。

关键词： 沸石   氧化石墨烯   金属离子   黄曲霉毒素B1   复合改性  

摘要： 黄曲霉毒素是由黄曲霉和寄生曲霉产生的有毒代谢产物,它可通过食物链进入动物体和人体内,具有蓄积毒性,尤其是肝脏蓄积毒性。长期食用含有黄曲霉毒素的食物,会引起肝损伤和肝癌等疾病。黄曲霉毒素B(AFB)是黄曲霉毒素中最强的一种,对其吸附方法和吸附性能的研究有重要的意义。本文用改进的Hummers法制备氧化石墨烯(GO),选取不同的金属离子(Ca、Cu、Fe和Zn)作为配位阳离子,制备了氧化石墨烯/金属离子复合改性沸石,筛选出对AFB吸附量最大的氧化石墨烯/钙离子复合改性沸石(GO-Ca-Z),改变GO和Ca的投入量制备出不同比例的GO-Ca-Z(2:1、1:1和1:2),对其进行结构表征及吸附性能的研究。结果表明:GO-Ca-Z具有更大的比表面积、总孔体积及丰富的官能团,有利于吸附性能提高;GO-Ca-Z(2:1)在浓度为2 mg/m L、AFB初始浓度为0.5 mg/L、吸附温度为25℃时吸附量最高为0.243 mg/g;在不同AFB初始浓度下,吸附反应均在360 min时达到吸附平衡,并且吸附量均随着AFB初始浓度的增加而增加,随吸附反应温度升高而减小,说明升高温度不利于反应进行。用NaOH溶液改性天然沸石,通过响应面实验优化制备条件,再对其进行结构表征与吸附性能研究。结果表明:最优制备条件为Na OH浓度4.96M、反应温度114.8℃、反应时间5.28 h;Na OH改性沸石孔道结构更加明显,呈现出类似于珊瑚礁状的结构,这是由于Na OH溶液脱除了沸石表面的硅,同时去除了原本附着在沸石内部的结合水和杂质,增大了比表面积和总孔体积;在最优Na OH改性天然沸石浓度为2 mg/m L、AFB初始浓度为0.5 mg/L、吸附温度为25℃时,吸附量达到0.187 mg/g;在不同AFB初始浓度下,吸附反应均在720 min时达到吸附平衡,并且吸附量随着AFB初始浓度的增加而增加,随吸附反应温度的升高而增大,说明升高温度有利于反应进行。将以上两种复合材料吸附AFB的数据进行了拟合,GO-Ca-Z(2:1、1:1和1:2)和最优条件Na OH改性天然沸石的吸附过程均符合动力学模型中的准二级动力学模型,表明以化学吸附为主;在等温模型中更符合Freundlich模型,表明是多层吸附。该论文有图25幅,表24个,参考文献87篇。

关键词： 中药制剂   糖尿病肾病   网络药理学   HK-2   肾小管间质纤维化  

摘要： 目的:本研究旨在基于网络药理学联合体外细胞实验探讨益气活血中药制剂大株红景天注射液干预TGF-β1诱导的近端肾小管细胞异常迁移及表型转变的机制研究,以期为HJT治疗TIF的临床应用提供新的思路和途径。方法:一、网络药理学的方法分析HJT干预TGF-β1诱导的HK-2细胞的活性成分、通路和靶点。使用中药系统药理学(TCMSP)数据库筛选从文献中获得的HJT活性成分,并使用Chemmapper、SEA和Swiss靶标预测数据库筛选活性成分的靶点。随后用过Cytoscape3.7.2软件建立“HJT活性成分-靶点”网络。此外,从GEO数据库中查找TIF相关芯片,获得TIF疾病相关靶点。用火山图对差异基因可视化。再通过Jvenn工具对HJT活性化合物调控的基因和TIF的差异基因进行了取交集得出交叉靶点。将得到的基因靶点输入STRING在线平台进行蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络的建立,通过京都基因和基因组百科全书(KEGG)分析确定信号通路和关键靶点。二、体外细胞实验以HK-2细胞为研究对象,用CCK-8法检测HJT对细胞的毒性并筛选合适浓度。使用实时荧光定量PCR检测TGF-β1和HJT对关键基因表达的影响并确定TGF-β1实验浓度。使用Western Blot法进一步验证HJT对关键基因SPHK1表达的影响。通过伤口愈合实验和transwell实验检测HK-2细胞迁移情况,通过免疫荧光实验检测HK-2细胞中Vimentin和Cytokeratin-18的表达情况。结果:一、网络药理学分析结果表明,HJT中有36个活性化合物,其中主要核心成分包括对香豆素酸和没食子酸乙酯等。HJT活性成分共含有1044个预测靶点,通过构建韦恩图得到与TIF的差异基因的重叠基因功能79个。通过构建PPI网络,筛选得到了共25个核心基因。KEGG通路分析发现在HJT对TIF的治疗中,代谢途径是其最重要的通路,25个核心基因中的GAD1、SPHK1、P4HA2、AKR1B1和PTGES在代谢途径中富集。二、在体外诱导的细胞模型实验中,我们验证了TGF-β1对HK-2细胞中AKR1B1、GAD1、P4HA2、SPHK1和PTGES表达的影响,与GEO芯片中趋势相符,且HJT可以显著恢复TGF-β1诱导的HK-2细胞中SPHK1的表达。伤口愈合实验和transwell实验结果表明HJT抑制了TGF-β1诱导的HK-2细胞的异常迁移;免疫荧光实验结果发现TGF-β1上调了Vimentin的表达而下调Cytokeratin-18的表达。相反,在HJT干预后Vimentin和Cytokeratin-18的表达被逆转。结论:本研究全面阐述了益气活血中药制剂HJT抗TIF的活性化合物、潜在靶点和分子机制。HJT可能是通过靶向SPHK1逆转TGF-β1引起的异常迁移及表型转变治疗TIF。

关键词： 乌鳢   α-硫辛酸   黄曲霉毒素B1   肝损伤   Nrf2信号通路  

摘要： 黄曲霉毒素B1（AFB1）是一种毒性和致癌性最强的黄曲霉毒素（AF）,其在肝脏中代谢产生的有毒物质可引起肝脏结构损伤及功能障碍。水产饲料中植物蛋白的大量应用、全球气候多变及饲料加工或贮存不当均导致水产饲料及其原料极易被AFB1污染,进而严重威胁水生动物的肝脏健康。然而,关于AFB1诱导鱼类肝损伤的作用机制尚无定论,缺乏系统性研究。α-硫辛酸（α-LA）是一种条件性必需营养素,具有抗氧化、抗炎及保护肝脏等作用,并且能够有效的缓解霉菌毒素对畜禽动物的毒性作用。但α-LA对AFB1诱导鱼类肝损伤的保护作用及其分子机制尚不明确。因此,本研究以乌鳢为试验对象,使用RNA-Seq等技术探究AFB1诱导乌鳢肝损伤的潜在分子机制。此外,运用营养干预手段,以α-LA为功能性饲料添加剂,通过体内和体外试验,利用免疫学、细胞生物学、分子生物学及营养学等方法,揭示α-LA缓解AFB1诱导乌鳢肝损伤的作用机制。主要研究结果和结论如下:（1）基于转录组学揭示AFB1诱导乌鳢肝损伤的潜在机制为评估AFB1对乌鳢的毒性作用及其诱导肝损伤的潜在机制,在基础饲料中添加不同浓度的AFB1（0、50、100、200和400 ppb）,进行为期56 d的养殖试验。结果表明,高浓度的AFB1（200和400 ppb）显著抑制了乌鳢的生长性能、饲料利用及免疫能力（P<0.05）;200和400 ppb的AFB1显著提高了血清中AST、ALT、ALP、LDH及AFB1蓄积水平（P<0.05）;并且,肝脏组织病理学和超微结构观察结果表明,AFB1（100、200和400 ppb）破坏了肝组织结构,导致肝细胞空泡化及坏死,肝细胞内线粒体肿胀、空泡化及内质网肿胀。综上所述,AFB1能够造成乌鳢肝脏损伤;且200 ppb的AFB1是诱导肝损伤模型的最佳浓度,并进行转录组测序。肝脏转录组学分析结果显示,共鉴定出1307个DEGs,48条显著富集的信号通路;其中细胞色素P450的异种生物代谢、内质网中的蛋白加工、谷胱甘肽代谢和PI3K-Akt信号通路与饲料中AFB1诱导的乌鳢肝损伤密切相关。（2）AFB1通过CYP450s/ROS/ERS途径诱导乌鳢肝损伤在试验一的基础上,进一步验证了AFB1诱导乌鳢肝损伤的作用机制。结果表明,饲料中AFB1促进乌鳢肝脏I相代谢酶cyp1a、cyp1b及cyp3a表达（P<0.05）;抑制了II相代谢酶GST的活性及基因表达水平;提高了乌鳢肝脏ROS、MDA及8-OHd G水平,降低了GSH-Px、SOD及CAT的酶活性及基因表达水平（P<0.05）。此外,AFB1显著上调了乌鳢肝脏内质网应激相关基因（grp78、ire1及jnk等）及炎症基因（nf-κb、il-1β及il-8等）表达水平（P<0.05）;同时,AFB1显著提高了乌鳢肝脏TUNEL染色阳性细胞数量,并上调了促凋亡基因（cas-3、cyt-c及bax等）的表达水平（P<0.05）,但抑制了bcl-2和iκbα的表达水平（P<0.05）。综上所述,饲料中AFB1能够促进乌鳢肝脏I相代谢反应（CYP450s）,抑制II相代谢反应,导致AFB1的有毒代谢产物蓄积;此外,其I相代谢的副产物ROS能够导致肝脏氧化损伤,并激活ERS通路,进而诱导细胞凋亡和炎症反应,造成肝脏损伤。由此可见,AFB1可通过CYP450s/ROS/ERS途径诱导乌鳢肝脏损伤。（3）α-LA对乌鳢生长性能、抗氧化能力及抗病力的影响本节试验为探究α-LA对乌鳢生长性能、抗氧化能力及抗病力的影响,在基础饲料中添加0、300、600、900、1200及1500 ppm的α-LA,进行为期56 d的养殖试验。结果表明,α-LA能够提高乌鳢FBW、WG、SGR及PER,并降低FCR（P<0.05）;其还能够降低血清中AST和ALT活性（P<0.05）;提高头肾、脾脏及肝脏中GST、GSH-Px和SOD等抗氧化酶活性及相关基因表达水平（gst、gsh-px、gr等）(P<0.05);此外,α-LA显著提高乌鳢的血清免疫指标（C3、C4、Ig M等）(P<0.05),促进il-10及tgf-β等抗炎基因的表达（P<0.05）,提高乌鳢攻毒后的存活率,但抑制il-1β、il-8及tnf-α等促炎基因的表达（P<0.05）;并且以上各指标分别在600或900 ppm组出现极值。综上所述,饲料中添加α-LA可有效提高乌鳢的生长性能、免疫力及抗氧化、抗炎和抗病能力,并保护肝脏健康;且乌鳢配合饲料中α-LA的最佳添加水平为600～900 ppm。（4）α-LA对AFB1诱导乌鳢肝损伤的保护作用本试验在试验一、二及三的基础上,以基础饲料为对照组,并分别在200 ppb AFB1饲料中添加0、600及900 ppm的α-LA,分别命名为CON、AFB

关键词： 硒代蛋氨酸   黄曲霉毒素B1   肾脏损伤   氧化应激   细胞凋亡  

摘要： 真菌毒素又被称为霉菌毒素,是一种低分子量(～700Da)的次级代谢产物,主要由曲霉属、青霉菌属、镰刀菌属、麦角菌属和链霉菌属产生,对动物机体具有严重的毒副作用。黄曲霉毒素B1(Aflatoxin B1,AFB1)主要由黄曲霉和寄生曲霉等菌株在一定条件下产生的小分子次级代谢产物,是黄曲霉毒素中含量最高、毒性和致癌性最强的毒素,其性质稳定,难以降解,污染范围广。因此,在生产、加工、储存等过程中,AFB1很难从饲料成分中完全去除,动物和人食入后可引起慢性中毒、生殖障碍、免疫系统抑制和癌症等疾病。硒作为动物机体中维持细胞正常生长发育的必要微量元素,具有抗氧化,抗凋亡以及增强机体免疫力的功能。越来越多的证据表明,硒对预防霉菌毒素中毒有明显的拮抗作用,因此,本试验选取硒代蛋氨酸(Selenomethionine,SeMet)为有机硒源,探究对AFB1诱导的兔肾脏损伤的影响,并通过设置不同剂量的SeMet来探索最佳保护浓度,可为SeMet对AFB1致兔肾损伤的保护作用提供参考,为畜牧养殖行业中AFB1的防控和治疗提供新思路。 (1)SeMet对AFB1诱导的兔肾功能及组织形态结构变化的影响 本试验选取35日龄体重相近雌雄各半的伊拉肉兔50只,随机分为5组,每组10只。分别分为对照组(橄榄油)、AFB1处理组(0.3 mg/kg AFB1)、0.2mg/kg Se+AFB1处理组(0.2 mg/kg SeMet+0.3 mg/kg AFB1)、0.4 mg/kg Se+AFB1处理组(0.4 mg/kg SeMet+0.3 mg/kg AFB1)、0.6 mg/kg Se+AFB1处理组(0.6 mg/kg SeMet+0.3 mg/kg AFB1)。其中对照组和AFB1处理组饲喂基础日粮,0.2 mg/kg Se+AFB1处理组、0.4 mg/kg Se+AFB1处理组、0.6 mg/kg Se+AFB1处理组分别用不同剂量的SeMet基础日粮饲喂21 d。将AFB1溶于橄榄油中,在第17 d时,对AFB1处理组、0.2 mg/kg Se+AFB1处理组、0.4 mg/kg Se+AFB1处理组、0.6 mg/kg Se+AFB1处理组家兔进行灌胃处理,连续灌胃5d,对照组灌胃相同剂量的橄榄油,整个试验期间家兔自由获得食物和饮水。试验结束后,采集样本。通过计算肾脏系数;检测家兔的血清中尿素氮(Urea Nitrogen,BUN)、尿酸(Uric Acid,UA)和肌酐(Creatinine,Crea)的含量以及尿蛋白浓度的测定观察各组件肾功能的变化;通过HE染色观察肾脏形态结构变化,PAS染色观察肾糖原的积累状况;免疫组织化学检测肾脏组织PCNA表达量的变化。结果表明,与对照组相比,AFB1处理组导致家兔肾脏组织形态结构发生改变,血清中BUN、UA、CREA的含量显著上升,尿蛋白浓度显著上升,对肾脏造成严重的病理损伤,在基础日粮中添加SeMet可显著改善AFB1诱导的肾脏组织形态学变化及肾功能的下降,其中添加0.2 mg/kg SeMet的改善效果最为显著。 (2)SeMet调控Nrf2/Keap1/NQO1通路缓解AFB1诱导的兔肾脏氧化损伤 通过测定兔肾脏组织丙二醛(MDA)的水平和DHE染色确定肾脏组织中活性氧(Reactive oxygen species,ROS)的含量;同时,测定肾脏组织中与抗氧化相关的酶如:总抗氧化能力(T-AOC)的水平、谷胱甘肽过氧化物酶(GSHPx)的活性和超氧化物歧化酶(SOD)的活性变化;通过q RT-PCR和Western Blot的方法检测SeMet对AFB1诱导的Nrf2/Keap1/NQO1信号通路中相关基因的m RNA和蛋白的表达水平。结果发现,与对照组相比,SeMet能改善AFB1诱导的家兔肾脏内T-AOC和SOD、GSH-Px活力降低,减少肾脏内MDA和ROS含量。基础日粮中添加SeMet能够提高Nrf2和下游基因NQO1和HO-1的表达含量,抑制Keap1的表达含量,缓解AFB1诱导的肾脏氧化损伤,0.2mg/kg SeMet的添加量效果要优于其它组添加量。这一结果进一步证实了SeMet对AFB1诱导的兔肾脏氧化应激的缓解作用。 (3)SeMet缓解AFB1诱导的兔肾脏细胞凋亡的作用 通过TUNEL染色法检测肾脏组织中凋亡的阳性细胞的数量,并通过q RTPCR和Western Blot的方法检测SeMet对AFB1诱导的兔肾脏组织中与细胞凋亡相关基因的m RNA和蛋白的表达水平的变化。结果发现,经过AFB1处理后的肾脏组织中凋亡的阳性细胞数量显著上升,基础日粮中添加SeMet能够降低肾脏组织的凋亡阳性细胞数量,同时能够上调PI3K、AKT、p-AKT、Bcl-2等抑制细胞凋

关键词： 太赫兹   超材料   强耦合   生物传感   Aβ16-22多肽   环偶极子   地沟油   黄曲霉毒素B1  

摘要： 超材料具有能灵活调控电磁波以实现其它材料不具备的独特电磁特性,并且它在众多领域具有潜在的应用前景,受到了科研人员的广泛关注。超材料传感器通常是通过等离子体共振效应实现强局域场,以有效提高传感信号,实现对表面介电环境高敏感检测。超材料传感与传统传感相比具有响应快、灵敏度高、无标记、实时监测和测量简单等诸多优势。石墨烯是由sp2杂化的碳原子组成的二维材料,能很好地吸附生物分子,在生物传感方面表现出非凡的潜力。本文基于强耦合的拉比分裂原理设计了一款金属-石墨烯杂化超材料,另外还利用环偶极子共振原理设计了两款超材料共振微结构,并分别对这两种共振机理进行研究。同时还使用标准光刻工艺制备出这三款超材料微结构,并结合太赫兹时域光谱系统作生物传感器件,分别检测了Aβ16-22多肽、地沟油、黄曲霉毒素B1。文章具体研究内容如下:首先,我们结合模拟软件设计了一款由金属光栅与表面石墨烯组成的杂化超材料。该超材料在太赫兹波的激励下,表面的石墨烯能激发出表面等离子体共振,金属光栅能形成异常光学透射效应,这两种共振模式在石墨烯掺杂与金属光栅参数匹配时会发生强耦合,形成一种新的共振模式——拉比分裂。我们从实验上制备出了该杂化超材料,将其应用于Aβ16-22多肽的聚集过程检测。不同聚集状态的Aβ16-22多肽会引起该超材料表面的石墨烯掺杂状态的不同,进而引起石墨烯费米能的变化,这些变化会灵敏地反映在杂化超材料的拉比分裂透射谱上。我们利用分子动力学模拟,提出了π-π键堆叠来解释Aβ16-22多肽聚集过程中石墨烯的费米能级的变化,并通过拉曼光谱验证了我们理论的正确性。其次,我们基于环偶极子共振原理,设计并制备了一款镜像对称的方形双开口环结构环偶极子超材料传感器,该传感器在1.436 THz处产生Q值为16.8的透射谐振谷。对谐振频率处结构表面电流分析表明,该结构能在抑制电偶极子和磁偶极子的同时迅速增强环偶极子。其作为生物传感器,在分析物厚度饱和时灵敏度高达348.8 GHz/RIU,可以灵敏感测表面介电环境微小变化。并从实验上测量了不同的油样,实验结果验证了其对标准食用油和劣质地沟油的良好分辨性,表明该器件在食品安全监测等方面潜在的应用前景。最后,我们同样基于环偶极子共振理论设计了一款镜像对称的双半圆环形高灵敏超材料传感器,其在1.33 THz处形成一个Q值高达26.6的尖锐透射谷。在饱和厚度分析物下折射率灵敏度高达337.5 GHz/RIU。实验中,我们利用该超材料器件检测出了不同浓度的黄曲霉毒素B1,表明其可以在太赫兹领域实现高灵敏的无标记检测,更加丰富了太赫兹超材料传感器件。

关键词： 赭曲霉毒素A   黄曲霉毒素B1   适配体   DNA纳米结构   荧光分析方法   纸基分析方法  

摘要： 在我国传统饮食文化中,人们的主要食物是粮谷类食品,它们容易受到真菌毒素的污染。其中,赭曲霉毒素A（OTA）和黄曲霉毒素B1（AFB1）都是毒性较强且常见的食品污染物,对人类和动物健康有严重威胁。因此,建立能够快速、准确检测OTA及AFB1的分析方法具有重要的现实意义。本课题基于可特异性识别靶标的核酸适配体、荧光共振能量转移（FRET）作用、DNA纳米结构设计和磁分离技术,利用荧光和纸基分析方法,构建了简单、灵敏度高、特异性强的DNA荧光传感器,用于OTA及AFB1的检测研究。具体研究内容如下:1.基于适配体的特异性识别作用和FAM与BHQ1之间FRET作用,构建了用于简单、快速检测食品中OTA的均相荧光传感器。利用NUPACK软件模拟了OTA适配体与其互补DNA的结合情况,并通过实验研究了OTA和互补DNA对OTA适配体的竞争结合情况。依据软件模拟和实验结果,选择最佳互补DNA为c DNA1-BHQ1。对影响传感器性能的其他实验条件进行优化,选择最优结合方式为OTA适配体与OTA先孵育30 min再加入c DNA1-BHQ1孵育30 min、最优孵育时间为60 min、最佳c DNA与Apt用量比为1:1、最优反应体系的p H值为7.4。在最优检测条件下,传感器检测OTA的线性范围为0.5-100 ng/m L,检出限（LOD）为0.13 ng/m L。该传感器用于检测玉米粉和葡萄酒样品中的OTA,平均回收率分别为100.0%-102.0%和98.0%-102.2%。纸基传感器制备工艺简单、便于携带、易于小型化。为了达到方便、快速检测OTA的目的,在制备的均相荧光传感器基础上,使用纸张作为传感器基底,构建了简单、低成本、易于长期保存的纸基荧光传感器用于检测食品中的OTA。在最佳检测条件下,传感器检测OTA的线性范围为10-2000 ng/m L,LOD为1.2 ng/m L。该传感器成功用于检测米粉和绿豆粉样品中的OTA,其平均回收率分别为89.2%-111.0%和89.0%-103.0%。2.设计了简单的“二维”DNA纳米结构,构建了X型DNA荧光传感器,利用快速磁分离技术,实现对AFB1的高效检测。X型DNA纳米结构由DNA1、DNA2和四条FAM-Apt组成。其中DNA1和DNA2构成了X型DNA纳米结构的骨架部分,四条FAM-Apt分别部分互补在该结构的两端。将X型DNA荧光传感器与常规型DNA双链荧光传感器进行比较,发现X型DNA荧光传感器能够实现信号放大,节约磁珠用量降低检测成本,降低LOD,提高AFB1的检测范围。通过优化实验参数,确定了最佳磁珠（MBs）用量为1.5μL,AFB1最佳孵育时间为40 min。在最佳检测条件下,传感器检测AFB1的线性范围为0.05-100 ng/m L,LOD为0.009 ng/m L。对红茶和玉米粉样品进行了加标检测,AFB1的平均回收率为92.6%-107.3%和92.1%-104.4%。3.本章设计了稳定的“二维”DNA纳米结构,构建了音叉型DNA（TF-DNA）荧光传感器,利用快速磁分离技术,实现对OTA和AFB1的同时检测。其中DNA1和DNA2构成了TF-DNA纳米结构的骨架部分,FAM-Apt和ROX-Apt分别部分互补在该结构的两端。对实验条件进行优化,确定了最佳MBs用量为3μL,最佳DNA1为DNA1-51,最佳DNA2为DNA2-45,毒素的最佳孵育时间为60 min。在最佳检测条件下,所制备的TF-DNA荧光传感器,检测OTA的浓度范围为0.05-100 ng/m L,LOD为0.015 ng/m L;检测AFB1的浓度范围为0.1-100 ng/m L,LOD为0.045 ng/m L。该传感器对OTA和AFB1均具有高度特异性。对红茶和小麦粉样品进行加标测试,OTA和AFB1的平均回收率分别为94.1%-106.7%和92.8%-110.6%。

关键词： 中药制剂技术   课程思政   教学改革  

摘要： 笔者以课程思政为引领,对高职高专《中药制剂技术》课程项目教学法的构建进行初步探讨总结,从而促进知识传授、能力培养与社会主义核心价值观的有机融合,使课程思政教育过程变得生动起来,潜移默化地影响学生,实现立德树人的人才培养目标。

关键词： 近红外光谱分析技术   图像处理技术   显微高光谱技术   定性分析   定量分析   多温度混合模型   异物检测   微生物检测  

摘要： 双黄连口服液（Shuanghuanglian Oral Liquid,SHL）是我国传统的中成药药品,主要用于治疗普通感冒、流行性感冒、呼吸道感染引起的肺炎、咽炎等疾病,此外,还有解热、抗菌、抗病毒等功效。SHL的质量控制是保证其临床疗效的关键,在生产过程中容易出现SHL的成分含量不达标、混入生产过程中的异物、或微生物超标等问题。本文主要从SHL的含量、异物和微生物限度方面对SHL进行检查。SHL的含量检测多采用色谱法进行检测,具有普遍、准确的优点。但整个检测过程步骤较为繁琐,所用时间较长,无法做到大量抽检。光谱法可以做到对样品进行快速的检查,但受到的影响因素较多难以保证稳健性,在现有技术的基础上对光谱检测技术进行改善和优化十分重要。SHL在生产过程中由于生产环境等影响,可能会出现部分不属于口服液的可见异物,如铝屑、橡胶屑、毛发等。当前市场上对于口服液的检测多使用人工灯检法,人工灯检法具有检测时间长、成本高等缺点,也有部分研究人员开发了基于机器视觉技术的灯检机。SHL作为被检测个体具有颜色深、异物难以鉴别区分等特点,本文提出了一种基于图像处理技术的SHL异物检测系统,可以对SHL中的可见异物进行有效检出。药典规定SHL的微生物检测中不得检出大肠杆菌,传统的大肠杆菌检出方法检测时间较长,检测步骤繁琐。本文利用一种新的细菌检测技术——显微高光谱技术,针对在检测过程中可能出现的几种常见细菌和大肠杆菌的活性进行了鉴别,探索了显微高光谱技术用于检测SHL中微生物的可能性。 综上所述,本文针对SHL中的大类成分的含量——总黄酮（Total Flavones,TF）和可溶性固含量（Soluble Solids Content,SSC）、常见异物（铝屑橡胶屑等）和大肠杆菌的检测三个方面,使用光谱和图像处理技术对其进行检测,主要研究内容如下: 1、基于光谱技术的双黄连口服液大类含量检测 （1）紫外可见光谱和近红外光谱数据融合技术用于双黄连口服液中大类成分含量检测 提出了一种利用紫外可见光谱（Ultraviolet-Visible,UV-Vis）和近红外光谱（Near Infrared,NIR）数据融合的方法来进行SHL的大类成分含量检测。首先采集68例SHL口服液的紫外-可见和近红外光谱数据。然后,采用一阶导数(First Derivation,1stD)、标准正态变量变换（Standard Normal Variate,SNV）和竞争自适应重加权算法（Competitive Adapative Reweighted Sampling,CARS）对光谱数据进行预处理。最后,采用偏最小二乘法（Partial Least Squares,PLS）建立模型,分别利用低、中数据融合对总黄酮和可溶性固形物含量进行定量分析。并与传统的UV-Vis模型和NIR模型进行了比较。对于SSC,两种传统模型的预测均方根误差（Root Mean Square Error Of The Prediction,RMSEP）分别为0.32101和1.67711。中层数据融合的最佳结果为0.31815。对于TF,两种传统模型的RMSEP分别为1.45066和1.69259。中级数据融合方法的最佳结果为0.82692。实验结果表明,与传统的UV-Vis模型和NIR模型相比,结合UV-Vis与NIR的数据融合模型可以为SHL口服液质量控制提供一种快速有效的工具。数据融合策略可以显著提高TF模型的预测能力。 （2）温度对近红外光谱双黄连口服液质量分析模型影响的初步探究 光谱技术的成分含量定量分析模型的预测能力容易受到外界环境温度的影响。为了降低温度对SHL含量检测的影响,本研究提出了一种多温度校正的方法来降低不同温度带来的模型差异。采集了不同温度下的SHL的近红外光谱,以TF和SSC为质量评价指标进行定量分析。通过组合预处理方法选择了SNV作为最佳的预处理方式,通过对不同温度下的近红外模型进行交叉验证发现,在单一模型下,相应温度的数据可以得到较好的预测结果,但不同温度下的数据进行验证,预测结果均会受到影响。可见温度的变化对近红外光谱的检测结果具有很大影响。进而通过建立温度复合模型,将温度作为一种噪音进行校正,研究结果表明,对于SSC复合模型来说,一阶求导的光谱数据结果最佳,预测决定系数（Determination Coefficient,R2）为0.9733,RMSEP为1.7698,而对于TF模型经过多元散射校正（Multiplicative Scatter Correction,MSC）校正之后的预测结果最好,预测R2为0.8591,RMSEP为0.0055。说明复合模型可以降低温度对数据的影响,提高近红外模型对光谱含量检测的鲁棒性,进而在实际检测过程中适当放宽光谱