关键词： 黄曲霉毒素B1   玉米赤霉烯酮   降解   安全性评价  

摘要： 受生长环境、加工和储藏环境的影响，食品中真菌毒素如黄曲霉毒素B1（AFB1）、玉米赤霉烯酮（ZEN）的含量一直居高不下，大量真菌毒素的残留严重危害动物和人类健康，如何降解食品中的真菌毒素受到了社会的广泛关注。本论文主要研究了臭氧、二氧化氯和微波技术对食品中AFB1和ZEN降解率和最优降解条件，分析降解产物，基于小鼠模型和Ames模型，评价真菌毒素降解前后的毒性和致突变性。具体的实验内容如下： （1）探讨了臭氧降解花生粕中AFB1的降解率、最优降解条件，分析降解产物并对其毒性进行评价。臭氧降解花生粕中的AFB1的最佳条件为：臭氧处理时间12min，花生粕的质量与反应容器的体积之比为5:500g·mL-1，花生粕水分含量15%;在该实验条件下，AFB1的降解率高达85.01%。通过液质联用发现臭氧完全降解AFB1最终产生3个氧化产物，。小鼠试验结果表明，食用经臭氧处理的花生粕组小鼠的血液常规指标、血液生化指标，肝脏、肾脏、胸腺、脾脏的指数和病理切片与空白组小鼠相比无显著差异。Ames试验结果表明，臭氧降解AFB1的产物刺激沙门氏菌组氨酸缺陷菌株，菌株没有发生突变形成菌落，臭氧降解AFB1产物不具有致突变性。 （2）研究了臭氧降解玉米浆中ZEN的降解率、降解产物及降解机制，并对降解产物的毒性进行评价。臭氧降解玉米浆中ZEN的最佳条件为：臭氧处理时间45min，玉米浆与加水量体积之比为20:30mL·mL-1，玉米浆与反应容器体积之比为17:500mL·mL-1;在该实验条件下，ZEN降解率达到92.41%。通过液质联用发现臭氧完全降解ZEN最终产生3个氧化产物。小鼠试验结果表明，食用经臭氧处理的玉米浆组小鼠的血液常规指标、生化指标，肝脏、肾脏、胸腺及脾脏病理切片与空白组小鼠相比无显著差异，没有发生AFB1病变。Ames试验结果表明，臭氧降解ZEN的产物刺激沙门氏菌组氨酸缺陷菌株，菌株没有发生突变形成菌落，臭氧降解ZEN产物不具有致突变性。 （3）研究了二氧化氯降解玉米浆中ZEN的降解率、降解产物及降解机制，并对降解产物的毒性进行评价。二氧化氯降解玉米浆中ZEN的优化最佳工艺条件为，二氧化氯处理时间150min、二氧化氯浓度160μg·mL-1、处理温度30℃时，ZEN降解率达到97.01%。通过液质联用发现二氧化氯完全降解ZEN最终产生2个氧化产物。小鼠试验结果表明，食用经二氧化氯处理的玉米浆组小鼠的血液常规指标、生化指标，肝脏、肾脏、胸腺及脾脏病理切片与空白组小鼠相比无显著差异，没有发生ZEN病变。Ames试验结果表明，二氧化氯降解ZEN产物刺激沙门氏菌组氨酸缺陷菌株，菌株没有发生突变形成菌落，臭氧降解ZEN产物不具有致突变性。 （4）研究了微波降解玉米浆中ZEN的降解率、降解产物及降解机制，并对降解产物的毒性进行评价。微波降解玉米浆中ZEN毒素的最佳工艺条件为，微波处理时间180s、玉米浆与加水量体积之比为10:5mL·mL-1、微波频率550w时，ZEN降解率达到85.05%。通过液质联用发现微波完全降解ZEN最终产生5个氧化产物。小鼠试验结果表明，食用经微波处理的玉米浆组小鼠的血液指标、四种脏器病理切片与食用未经微波处理玉米浆组小鼠相比差异非常显著，没有发生ZEN病变。Ames试验结果表明，臭氧降解ZEN产物刺激沙门氏菌组氨酸缺陷菌株，菌株没有发生突变形成菌落，微波降解ZEN产物不具有致突变性。

关键词： 正清风痛宁   中药制剂   关节炎   药效评价   产品研发   国家科学技术进步奖   科技进步奖   创新   质量  

关键词： 丹参注射液   三联疗法   四联疗法   活动期胃溃疡  

摘要： 目的：了解中药制剂丹参结合三联疗法与四联疗法治疗活动期胃溃疡的临床效果。方法回顾性分析我院2011年12月～2013年12月收治的120例活动性胃溃疡患者的临床资料。结果于治疗后7d内，两组患者临床症状得分无明显变化（P＞0．05），于治疗6周后实验组临床症状得分显著低于对照组（P＜0．05），且患者胃溃疡愈合率明显优于对照组（P＜0．05）。结论中药制剂丹参结合三联疗法与四联疗法在活动期胃溃疡治疗中具有重要的应用价值，值得推广与应用。

关键词： 中药提取物   舒张血管   颈动脉内膜中层增厚   抗炎作用   蛋白表达   免疫组化   动物模型  

摘要： 目的:\n 考察中药提取物舒张血管作用及机制和抗炎作用并考察中药提取物能否降低颈动脉内膜中层增厚。\n 方法:\n 在利用大孔树脂、硅胶色谱柱等方法提取得到各中药提取物的基础上，利用Power Lab血管功能评价系统，以雄性SD大鼠离体大鼠胸主动脉环为考察对象，考察中药提取物的舒张血管作用及机制。并以RAW264.7细胞株为研究对象，利用LPS(100μg/ml)和INF-γ(10U/ml)协同刺激巨噬细胞建立炎症模型，筛选中药是否具有抗炎作用，并应用MTT法考察他们对巨噬细胞活力的影响。综合中药抗炎和舒张血管作用，挑选出3个中药提取物，考察他们对结扎大鼠左侧颈总动脉分支造成的颈动脉内膜中膜增厚是否具有降低作用。利用PCR技术进一步考察颈总动脉细胞中iNOS、VCAM-1、IL-1β、eNOS mRNA的表达情况，并利用免疫组化技术考察中药提取物对iNOS蛋白表达的影响。\n 结果:\n 通过大鼠离体胸主动脉环实验，结果发现苏木70％醇洗脱部位、夏枯草70％醇洗脱部位、鸡血藤50％醇洗脱部位、半枝莲50％醇洗脱部位、芫花70％醇洗脱部位、前胡乙酸乙酯提取物具有较好的舒张血管作用。同时通过巨噬细胞炎症模型发现这几个药物具有不同程度的抗炎作用。用NOS抑制剂(L-NAME)、环氧和酶抑制剂(Indomethacin)孵育血管环，发现L-NAME可以阻断苏木70％醇洗脱部位、夏枯草70％醇洗脱部位、芫花70％醇洗脱部位和半枝莲50％醇洗脱部位这四个药物舒张血管作用，而Indomethacin不能阻断其舒张血管作用，接着用鸟苷酸环化酶的抑制剂(ODQ)预先处理血管环后，中药提取物舒张血管作用被抑制，因此可以推测这几个中药提取物舒张血管作用主要是通过NO-cGMP途径来实现的。SD大鼠左侧颈总动脉结扎术后四周，与模型组相比，给予各组药物干预后，复方高剂量组、苏木70％醇洗脱部位的高剂量组、鸡血藤50％醇洗脱部位的低剂量组能较好的降低大鼠左侧颈总动脉内膜-中膜增厚和管腔面积减小。与模型组相比，辛伐他汀组、复方高、低剂量组、鸡血藤50％醇洗脱部位低剂量组及苏木70％醇洗脱部位高、低剂量组可以降低左侧颈总动脉iNOS mRNA的表达;辛伐他汀组、复方低剂量组、鸡血藤50％醇洗脱部位低剂量组及苏木70％醇洗脱部位低剂量组可以降低左侧颈总动脉VCAM-1mRNA的表达;辛伐他汀组、复方高、低剂量组、鸡血藤50％醇洗脱部位低剂量组可以降低左侧颈总动脉IL-1β mRNA的表达。辛伐他汀组、复方高低剂量组、鸡血藤50％醇洗脱部位低剂量组可以降低血流剪切力引起的左侧颈总动脉iNOS蛋白的表达，提示上述药物具有抗炎作用。\n 结论:\n 1.苏木70％醇洗脱部位、夏枯草70％醇洗脱部位、鸡血藤50％醇洗脱部位、半枝莲50％醇洗脱部位、芫花70％醇洗脱部位、前胡乙酸乙酯提取物具有较好的舒张血管作用，并具有一定的抗炎作用。\n 2.苏木70％醇洗脱部位、夏枯草70％醇洗脱部位、芫花70％醇洗脱部位和半枝莲50％醇洗脱部位舒张血管租用主要是通过NO-cGMP途径来实现的。\n 3.与模型组相比，给予各组药物干预后，复方高剂量组、苏木70％醇洗脱部位的高剂量组、鸡血藤50％醇洗脱部位的低剂量组能较好的降低大鼠左侧颈总动脉内膜-中膜增厚和管腔面积减小，其机制可能与抗炎和舒张血管有关。

关键词： 黄曲霉毒素   酶联免疫吸附法   大曲  

摘要： 主要探讨了酶联免疫法检测大曲中黄曲霉毒素B1的提取条件;分别考察了超声波提取时间、超声波提取功率、甲醇浓度对黄曲霉毒素B1提取效果的影响;用正交设计找出了最佳工艺参数:甲醇浓度为55%(v/v),提取时间为25 min,提取功率为200 W。采用本提取工艺所得黄曲霉毒素B1提取率明显高于国标。本研究可为大曲中黄曲霉毒素B1的检测提供简便、准确、可靠的分析方法。

关键词： PAI-1基因   3T3-L1前体脂肪细胞   中药方剂  

摘要： 目的： 利用MTT及荧光定量PCR技术，以3T3-L1细胞系为工具，研究6种中药复方制剂对人纤溶酶原激活物抑制剂-1（Plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1）基因表达的影响，观察不同浓度方剂制剂PAI-1mRNA的表达情况，了解其影响因素，探讨中药复方制剂在治疗肥胖症中的分子生物学机制。 方法： 1．制备6种不同中药方剂的水溶性提取物(Extracts of Chinese Medical Herbs，ECMH)，体外培养3T3-L1小鼠前体脂肪细胞，分别以不同浓度（0.001、0.01、0.1、1、10）mg/ml的ECMH刺激3T3-L1前体脂肪细胞24h，通过细胞形态学和MTT法判断其对3T3-L1前脂肪细胞增殖的影响，并进行统计学分析，初步筛选出对细胞有影响但损伤较小的最佳药物浓度； 2．采用实时荧光定量PCR(Realtime fluorescence quantitative PCR，RT-PCR)技术分别检测6种ECMH对小鼠3T3-L1前体脂肪细胞分泌因子PAI-1mRNA水平的影响，根据统计分析结果筛选可用于减肥的中药复方制剂。 结果： ***刺激3T3-L1前体脂肪细胞24h后均使细胞发生形态变化，不同浓度ECMH均可不同程度地抑制3T3-L1前体脂肪细胞增殖。除小承气汤外，各方剂ECMH1mg/ml均为抑制率最高的浓度，与正常对照组相比，减肥胶囊、防风通圣散、防己黄芪汤、泽泻汤四方各浓度均具有统计学意义（P≤0.05），除参苓白术散10mg/ml，小承气汤100ug/ml、1ug/ml外（P＞0.05），此两种复方其余各浓度均具有统计学意义（P≤0.05）； ***-PCR技术检测得出，6种中药复方制剂3种不同浓度ECMH对脂肪细胞PAI-1mRNA表达均具有不同程度的促进作用。与正常组相比，防风通圣散、小承气汤、参苓白术散三种复方三种不同浓度均具有统计学意义（P≤0.05），泽泻汤1mg/ml，减肥胶囊10mg/ml、防己黄芪汤10mg/ml不具有统计学意义（P＞0.05），此三方其余各浓度均具有统计学意义（P≤0.05）。 结论： 1、6种中药复方制剂不同浓度均可抑制3T3-L1前脂肪细胞的增殖。 2．6种中药复方制剂均可促进3T3-L1前脂肪细胞PAI-1的表达，通过影响肥胖基因的表达，抑制脂肪细胞的分泌，达到减肥的目的。

关键词： 黄曲霉毒素B1   花生油   酶联免疫法   辐照降解   Ames实验  

摘要： 黄曲霉毒素(Aflatoxin, AFT)是一类由黄曲霉(Aspergillus flavus)和寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)等真菌在一定条件下产生的次级代谢产物,其中以黄曲霉毒素B1的毒性最强,具有致癌、致畸、致突变作用,被国际癌症研究机构赋予“一级致癌物质”称号。AFT污染是影响花生及其制品消费安全和出口贸易的主要原因,寻找一种快速检测技术和去毒方法有较强的实际应用价值。本课题的研究对象为花生油中的黄曲霉毒素B1,寻求建立一种酶联免疫快速检测技术,同时比较用60Co辐照和微波辐照手段对黄曲霉毒素B1的去毒效果,并对处理后的花生油的主要理化指标和降解产物的安全性进行评价。影响AFB1-O合成主要影响因子的单因素实验和正交试验结果表明：在起始质量比匕AFB1/CMO=1:2、反应时间5h、反应温度65℃条件下肟化率最高可达96.7%；影响肟化率的强弱因素依次为：AFB1/CMO起始质量比>反应时间>反应温度。AFB1-BSA(即完全抗原)的最佳合成条件为：AFB1-O/BSA起始摩尔比为30：1,23℃振摇避光反应20h。AFB1-OVA(即包被抗)原最佳合成条件为：交联剂起始摩尔比EDC/NHS=4:1,23℃避光反应12h。用人工合成抗原免疫小鼠而得到抗体,测定多抗血清效价为1：3200;半抑制浓度为/C50=3.25ng/mL;与AFM1的交叉反应率为3.1%,玉米赤酶烯酮、呕吐毒素的交叉反应率均小于0.28%。将得到的抗体适当稀释,用棋盘滴定法测得最适工作浓度为：抗体稀释13000和酶标抗原稀释16000倍。由实验得出黄曲霉毒素B1酶联免疫试剂盒最佳工作条件参数为：抗体包被时间为4℃下包被12h,明胶封闭时间为4℃下封闭12h,抗原抗体特异性反应温育时间为避光反应30min,显色时间为室温下反应10min。加速破坏性实验证明：该试剂盒在4℃条件下至少可以保存30天,ELISA试剂盒与HPLC检测结果相比无显著性差异。样品前处理方法简单有效,经有机溶剂提取,测定结果与国标法相近。黄曲霉毒素B1的降解实验结果证明：随60Co辐照剂量的增大,降解率随之增加；当AFBt的初始含量小于25ppb时,10kGy的辐照剂量可以完全去除花生油中AFB1。微波辐照降解经单因素实验和响应面实验结果可知：各因素对AFB1降解率影响程度依次为：微波作用时间>微波功率>AFB1初始含量,三因素都达到了极显著水平。根据响应面实验分析得出降解AFB1最佳条件参数为：AFB1初始含量为13.72ppb、微波功率803.98W、微波作用时间10.27min,得到AFB1降解率的的预测值为96.0055%。在微波降解AFB1最佳处理条件下,检测花生油主要理化指标酸值、碘值、过氧化值、维生素E和反式脂肪酸均未发生显著变化,符合国家相关标准。经Ames实验可知：添加S9代谢活化系统的阳性对照组(即未降解的AFB1)菌落回复突变数与AFB1剂量间存在显著的剂量-反应关系；而阳性对照组(即未降解的AFB1)只有在加入S9代谢活化系统时,菌落回复突变数与自发回复突变组相比,除5ng剂量组外,差异达到显著(a<0.01)或极显著(b<0.01)。无论是否添加S9代谢活化系统,阳性组(即AFB1微波降解产物)在不同剂量下诱发的菌落回复突变数与自发回复突变组相比,无显著差异(p>0.05)。说明微波辐照降解花生油中AFB1所产生的降解产物毒性完全消失。由此可知：AFB1经微波降解后,其降解产物对TA98、TA100和TA102菌株均不呈现剂量-反应关系,说明微波辐照AFB1的降解产物对组氨酸营养缺陷性鼠伤沙门氏菌无致突变性。

关键词： 中药制剂   复方丹参片   质量鉴定   指纹图谱  

摘要： 目的：⑴考察不同厂家或批号的复方丹参片中丹参素、原儿茶醛、丹酚酸B、二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA的含量，并建立相应的指纹图谱，对复方丹参片的质量进行评价。⑵考察冰片对丹参脂溶性药效成分二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA的促吸收作用以及对这四种有效成分在大鼠血浆，大脑和心脏中组织分布的影响。\n 方法：①以HPLC（高效液相色谱）为分析手段，测定复方丹参片中丹参素、原儿茶醛、丹酚酸B、二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA的含量，并建立相应的指纹图谱。②SD大鼠分组灌胃给药丹参醇提物后，立即灌胃给予或不给予冰片，以HPLC为分析手段，测定给药30min和1h后二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA的血药浓度、大脑和心脏组织中的药物浓度，分析两组间药物浓度的差异。\n 结果：⑴测定了不同厂家或批号的复方丹参片中丹参素、原儿茶醛、丹酚酸B、二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA的含量，研究表明，各个厂家或批号的复方丹参片中丹酚酸B或丹参酮ⅡA的含量均符合《中华人民共和国药典》2010版（一部）的含量限定要求;建立了复方丹参片的HPLC指纹图谱研究方法，研究表明，各批次复方丹参片的指纹图谱相似度均在0.98以上。⑵建立了大鼠血浆，大脑，心脏组织中二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA的药物浓度分析方法，并初步应用于冰片同时对多种丹参脂溶性药效成分促吸收及组织分布的影响研究。研究表明，二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA的口服生物利用度均很低;冰片能够促进大鼠对隐丹参酮的吸收，并提高隐丹参酮在大鼠血液和心脏组织中的药物浓度。\n 结论：①不同厂家或批号的复方丹参片中丹参素、原儿茶醛、丹酚酸B、二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA的含量差异较大，但均符合《中国药典》2010版的含量限定要求;不同厂家或批号的复方丹参片指纹图谱相似度很高。②二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA的口服生物利用度很低;冰片能够促进大鼠对隐丹参酮的吸收;所建立的体内药物分析方法灵敏度不够，实测药物浓度在分析方法的定量限以下，还需进一步优化实验条件和方法来研究冰片对丹参脂溶性成分的促吸收作用。

关键词： 黄曲霉毒素B1   免疫阻抗传感器   纳米复合物   纳米抗体   独特型抗体   噬菌体展示  

摘要： 黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1, AFB1）是由真菌代谢产生的具有强致癌性的剧毒物质，广泛存在于粮食、油料及坚果等食物中。鉴于AFB1的巨大危害，各国普遍加强对AFB1的监管。目前，用于检测AFB1的方法主要包括薄层层析法、高效液相色谱法、酶联免疫吸附法以及电化学传感器等。这些方法存在一定的不足，如灵敏度较低、检测成本较高、耗时长、检测结果可靠性较差以及检测试剂易对人体造成伤害和对生态环境造成污染等。针对上述不足，本研究制备了AFB1非标记免疫阻抗传感器，以期达到灵敏、快速、检测结果更加可靠的目的；同时，本研究将抗独特型纳米抗体应用于AFB1的分子模拟研究中，以期替代AFB1进行免疫学分析，防止AFB1对操作人员造成伤害和对环境造成污染。主要研究内容如下： 1AFB1非标记免疫阻抗传感器的研究 1.1采用电化学恒电流聚合法于玻碳电极表面合成纳米复合物PPy/PPa/rGO。优化了聚合电解质中Py、Pa单体和rGO的最佳浓度，分别为0.26M，0.065M和16μg/mL；最佳的电化学聚合时间为300s。分别通过循环伏安法、电化学阻抗谱、扫描电子显微镜等技术表征了纳米复合物PPy/PPa/rGO，结果表明，以最佳条件合成的纳米复合物PPy/PPa/rGO具有较好的电化学氧化还原活性、电化学稳定性和独特的形貌。 1.2采用EDC/NHS将抗AFB1单克隆抗体共价偶联于电极表面，制备了AFB1免疫阻抗传感器。该传感器不需要对抗原或抗体进行酶标记；检测时间为50min，最低检测限为8fg/mL，线性范围为10fg/mL-10pg/mL；与AFB2、AFG1、AFG2的交叉反应率分别为2%、27%和21%，与呕吐毒素、赭曲霉毒素A无明显交叉反应；对玉米样品的加标回收率为80.0±5.0%-112.0±2.5%。该结果表明，PPy、PPa和rGO三者的协同作用，增强了纳米复合物PPy/PPa/rGO的电化学活性和稳定性，提高了传感器的检测灵敏度；此外，该传感器在阻抗测试中，无需外源氧化还原探针，在PBS中即可进行电化学阻抗谱分析，使检测结果更加可靠。 2独特型纳米抗体应用于AFB1分子模拟的研究 2.1采用抗AFB1单克隆抗体F(ab′)2片段免疫羊驼，提取羊驼淋巴细胞总RNA，通过反转录PCR和巢式PCR构建了AFB1独特型纳米抗体文库。该文库目的基因插入率为90.9%，实际库容量达到1.8×108，文库多样性较好。辅助噬菌体救援后，噬菌体展示文库滴度达到1×1013cfu/mL，可以用于后续的亲和淘选。 2.2分别以抗AFB1单克隆抗体及其F(ab′)2片段为靶标进行固相亲和淘选。在以抗AFB1单克隆抗体全抗体为靶标淘选时，分别采用Gly-HCl (pH2.2)洗脱法和AFB1抗原竞争洗脱法洗脱特异性结合的噬菌体，其中采用Gly-HCl洗脱法的淘选中，第三轮验证结果显示特异性噬菌体的比例达到该轮验证总数的22.9%，而AFB1抗原竞争洗脱法第二轮得到的特异性噬菌体即达到该轮验证总数的27.1%，表明抗原竞争洗脱法在筛选抗独特型噬菌体时具有较高的效率。此外，以抗AFB1单克隆抗体F(ab′)2片段为靶蛋白进行亲和淘选，第二轮验证得到的特异性噬菌体占该轮验证总数的16.7%。多序列比对发现，得到的特异性噬菌体抗体氨基酸序列同源性较高。 2.3将独特型纳米抗体基因克隆至原核表达载体进行诱导表达，经蛋白质复性后得到可溶性抗体蛋白，分别采用竞争ELISA和生物学方法鉴定该抗体的生物学活性。结果表明，m7蛋白不但能与AFB1竞争结合抗AFB1单克隆抗体，还能诱发Balb/c小鼠产生抗AFB1多抗血清，因此，m7属于半抗原抑制型独特型抗体，有望替代AFB1进行免疫学研究。

关键词： 微小染色体维持蛋白7   细胞周期素B1   肝肿瘤   黄曲霉毒素B1   大鼠  

摘要： 目的本研究利用黄曲霉毒素B1（AFB1）诱发大鼠形成肝癌模型，检测诱癌过程中不同时间点肝组织中的微小染色体维持蛋白7（minichromosome maintenance complex component7, MCM7）基因与细胞周期素B（1cyclin B1）基因的mRNA和相关蛋白，动态观察MCM7与cyclinB1基因的表达情况，以探讨MCM7与cyclin B1基因在肝癌发生过程中的变化及意义。 方法1.实验标本：实验组为15只在第70周经病理组织学确认形成肝癌大鼠（来自前期利用AFB1诱发大鼠形成肝癌实验的AFB1组）;对照组为10只未成癌大鼠（来自前期实验的对照组），均为未予以AFB1处理的正常动物。2.标本采集：全部大鼠在诱癌过程中的第10周、30周、50周行肝活检取肝组织，第70周处死取肝组织。切取的肝组织一部分用液氮速冻保存，另一部分用中性福尔马林固定、常规脱水、石蜡包埋。3.标本检测：采用实时荧光定量PCR（RFQ-RT-PCR）、蛋白质免疫印记杂交技术（Westerrn blot）和免疫组化方法分别检测不同时间点大鼠肝组织中MCM7与cyclin B1基因的mRNA和相关蛋白表达水平，动态观察其变化情况，分析基因表达意义。 结果1. MCM7基因的mRNA和蛋白的表达情况基本一致，且随着大鼠肝癌的形成，MCM7mRNA和蛋白的表达水平逐步升高，且以在肝癌形成的第70周表达水平最高。实验组内，第50周蛋白阳性率为26.7%且以弱阳性为主，第70周蛋白阳性率为100%且多为强阳性，第50周、70周分别与其他时间点比较，其表达差异有统计学意义（P <0.05）;对照组中各时间点的表达水平均较低且稳定（P>0.05）;实验组与对照组比较，第50周、70周表达差异有统计学意义（P <0.05）。2. cyclin B1mRNA和蛋白的表达，在实验组第70周肝组织中明显高于其他时间点和对照组（P <0.05），但蛋白表达先于mRNA表达，于肝癌形成前（实验第50周）开始升高。实验组中第50周、70周蛋白阳性率为26.7%、66.7%，第50周、70周蛋白表达均与其他时间点差异显著（P <0.05）;组间比较，第50周、70周表达均差异显著（P <0.05）;而实验组其他时间点及对照组之间比较，差异无统计学意义（P>0.05）。 结论1.在大鼠肝癌形成过程中，MCM7表达无论在mRNA水平还是蛋白水平均呈上升趋势且高于正常组织，提示MCM7与肝癌的发生密切相关，MCM7有可能是参与肝癌发生的关键基因之一。2.在肝癌发生过程中，cyclin B1的mRNA和蛋白的表达均在肝癌组织中表达最高，或许cyclinB1与肝癌的发展相关，cyclin B1可能参与肝癌的形成。