关键词：
中药
肿瘤干细胞
K562细胞
生物学特性
表型
摘要：
恶性肿瘤一直是世界性医学难题,其治疗之难难于上青天。化疗作为肿瘤治疗的主要方法已经遭遇瓶颈而难以有所突破[1,2]。靶向治疗已发展成为近年来的重要的治疗手段,但肿瘤发生发展的多环节、多基因和多靶点,使得靶向治疗在针对肿瘤发病机制上如同面临敌众我寡的局面而具有局限性。绝大多数肿瘤治疗至今未见突破性进展。原因主要在于肿瘤存在肿瘤干细胞(cancer stem cells,CSC)。从天然资源中开发新药是抗白血病药物研究的一个热点,近年国际国内对肿瘤的治疗方法采取了温阳疗法治疗肿瘤。三阳血傣源于傣族贝叶经和中药结合,是云南省新开发的治疗肿瘤特色药物,主要含的肉桂成分具有对人的多种肿瘤细胞杀伤作用的能力。大回阳饮是云南省已故著名温阳大家“吴附子”吴佩衡先生创制的名方,该方所含的附子具有逆转肿瘤细胞多药耐药的作用。观察云南特色有效的三阳血傣和大回阳饮中温阳药物对白血病细胞及其干细胞的诱导驯化作用,以此改变恶性细胞的阴阳状态,将其从静止封闭的阴态提升至激活开放的阳态。明确温阳中药有效成分对白血病及其干细胞生物特性的影响程度,为白血病尤其是白血病干细胞治疗久攻不下寻求突破的新途径。要研究结果如下:对三阳血傣中的肉桂所含桂皮醛和大回阳饮所含附子里的新乌头碱有效成分提取并纯化。体外吸收模型的已成功建立:Caco-2细胞单层细胞培养21天,细胞达到汇合分化,用上皮电阻仪测量细胞单层的跨膜电阻TEER。测试细胞的完整性。进行电子显微镜拍照。(1)桂皮醛具有药理活性桂皮醛对K562细胞的无细胞毒的浓度范围为50μg/ml-75μg/ml,与对照组(只加入DMSO组)相比,能抑制K562细胞生长,且呈浓度、时间依赖性(P<0.05),作用时间为72小时,抑制效果明显。流式细胞仪检测白血病细胞的细胞周期状态,测定G1/S期细胞所占比例。实验结果显示,50μM桂皮醛作用K562细胞,S期比例上升了 4.32%;75μM桂皮醛作用K562细胞,S期比例上升了 11.73%。流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)分析白血病细胞株K562的CD34+CD38-等抗原变化。细胞分化抗原检测结果提示桂皮醛使K562细胞向髓系,红系分化,但同时能诱导K562中的干细胞比例降低。FCM通过Annexin V/PI染色法测定细胞凋亡变化,桂皮醛作用K562细胞72h后凋亡率明显增加,50μM桂皮醛作用K562细胞72小时,细胞凋亡率为1.979%;75μM桂皮醛作用K562细胞72小时,细胞凋亡率为5.690%,提示桂皮醛可能部分通过诱导细胞凋亡的途径来抑制细胞增殖。甲基纤维素细胞体外克隆形成细胞培养法观察白血病细胞株K562集落形成情况,自我更新和增殖能力。桂皮醛能够明显抑制K562细胞的克隆形成,50 μM、75 μM桂皮醛组集落形成率分别为(1.25±0.13)%、(2.70±0.36)%,加药组与对照组相比有统计学意义(P<0.05)。实验证明三阳血傣中的肉桂所含的桂皮醛能够改变白血病细胞的生物学特性。(2)新乌头碱具有药理活性新乌头碱对K562细胞的无细胞毒的浓度范围为25μg/ml-50μg/ml,作用时间为72小时,抑制效果明显。与对照组相比,能抑制K562细胞生长,且呈浓度、时间依赖性(P<0.05),作用时间为72小时,抑制效果明显。流式细胞仪检测白血病细胞的细胞周期状态,测定G1/S期细胞所占比例。实验结果显示,25μM新乌头碱作用K562细胞,S期的比例上升了 4.40%,50μM新乌头碱作用K562细胞,S期比例上升了 17.88%。FCM分析白血病细胞株K562的CD34+38-等抗原变化。细胞分化抗原检测结果提示新乌头碱使K562细胞向巨核系分化,但同时能诱导K562中的干细胞比例降低。流式细胞术通过Annexin V/PI染色法测定细胞凋亡变化,新乌头碱作用K562细胞72h后凋亡率明显增加,提示桂皮醛可能部分通过诱导细胞凋亡的途径来抑制细胞增殖。甲基纤维素细胞体外克隆形成细胞培养法观察白血病细胞株K562集落形成情况,自我更新和增殖能力。新乌头碱能够明显抑制K562细胞的克隆形成,25 μM、50 μM新乌头碱组集落形成率分别为(1.72±0.18)%、(1.91±0.13)%,加药组与对照组相比差别有统计学意义(P<0.05)。实验证明大回阳饮中的附子所含的新乌头碱能够改变白血病细胞的生物学特性。
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