关键词：
电化学生物传感器
DNA walker
DNAzyme
黄曲霉毒素B1
检测
摘要：
黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1,AFB1）主要是由曲霉属中的黄曲霉和寄生曲霉所产生的有毒代谢产物,广泛存在于农产品和食品中,严重威胁着粮食安全和人类健康。由于AFB1具有较强的诱变、致畸、免疫抑制和致癌作用,1993年被世卫组织列为I类致癌物。因此,为减少AFB1带来的危害,开发快速、灵敏、可靠的方法检测食品中的AFB1具有重要意义。
常规AFB1检测方法或耗时长,操作繁琐,或成本较高,或依赖昂贵仪器,而电化学生物传感器由于具有具有响应快速、高效、便于微型化等优势,受到了广泛的关注。本研究基于三足DNA walker构建了高效、灵敏的比率型电化学生物传感器用于食品中AFB1的检测。主要研究内容和结果如下:
（一）构建基于DNAzyme驱动的三足DNA walker的比率型电化学传感器。选择适宜的AFB1适配体（Apt）,并根据适配体设计互补DNA（Complementary DNA,c DNA）,制备对AFB1敏感的双链（A-C）。根据c DNA设计组成三足DNA walker的发夹H1、H2、H3,并在发夹两端加入DNAzyme序列,在NUPACK软件上进行结构分析。设计标记单个核糖核苷碱基键（r A）以及亚甲基蓝（Methylene blue,MB）的轨道链MB-H4,根据MB-H4设计标记二茂铁（Ferrocene,Fc）的直链Fc-S1,通过三足DNA walker实现信号级联放大。对裸玻碳电极镀金,并将MB-H4固定在电极表面,构建电极传感界面,采用方波伏安法对AFB1进行检测,完成该比率型电化学生物传感器构建。NUPACK软件结构分析结果显示,H1与H2、H3结合,理论上可形成稳定的三足DNA walker结构;采用聚丙烯酰胺凝胶验证试验原理的可行性,结果显示,所有的电泳条带均与预期结果一致,说明适配体可与互补链结合,AFB1的存在可触发三足DNA walker的自组装;采用扫描电镜、循环伏安法（Cyclic voltammetry,CV）和电化学阻抗谱（Electrochemical impedance spectroscopy,EIS）对电极进行表征,结果表明金纳米粒子被成功修饰在电极表面,三足DNA walker可对固定在电极表面的MB-H4进行切割,Fc-S1可成功与MB-H4剩余部分结合,CV响应和EIS变化一致,AFB1能被成功检出。以上试验结果证明该传感器构建成功。
（二）基于三足DNA walker的比率型电化学生物传感器反应条件优化。对检测反应体系及电化学条件中的关键因素进行优化,最终确定电化学试验中MB-H4的最适浓度为1.5μmol/L,MB-H4的最适固定时间为4 h;检测反应体系中H1、H2、H3的最适浓度为1μmol/L,镁离子的最适浓度为4 mmol/L,Fc-S1的最适浓度为1.5μmol/L。三足DNA walker的反应时间为60 min,在相同的检测条件下,与构建的单足DNA walker相比,反应时间缩短40 min,且具有更高的信号响应值。
（三）对所构建的电化学生物传感器进行基本性能评估。在最优条件下,从线性范围、检出限（Limit of Detection,LOD）、特异性、稳定性和重复性5个方面进行性能评估,结果如下:
采用构建的比率型电化学生物传感器对一系列不同浓度的AFB1进行检测,从标准曲线可以得出,在0.0001 ng/m L到10 ng/m L的范围内,IFc/IMB值与Log CAFB1呈现出良好的线性关系,线性方程为IFc/IMB=0.54692+0.10479Log CAFB1（R2=0.9923）,通过三倍信噪比得到的LOD为61 fg/m L。在特异性试验中,仅当存在AFB1时,IFc/IMB值较高,呈现阳性结果,而其他非目标毒素及其混合组IFc/IMB值与空白组结果一致,呈阴性结果,说明所构建的比率型电化学生物传感器特异性良好。在重复性试验中,在相同条件下制备的6支电极均表现出较为稳定的信号值,相对标准偏差为2.825%,说明该比率型电化学生物传感器具有良好的重复性。在稳定性试验中,将相同条件下制备的电化学生物传感器于4℃条件下保存0、3、6、9、12、15天,在第12天时IFc/IMB值仍保持在初始值的89.23%,表明该传感器稳定性良好。
（四）基于三足DNA walker的比率型电化学生物传感器的实用性评价。采用该传感器和国家标准（GB5009.22-2016）中高效液相色谱-柱前衍生法（HPLC-PMP）分别检测小麦粉、玉米粉及大豆粉加标样品的回收率。检测结果显示,该传感器检测以上三种加标样品的回收率均在91.2%-118.3%之间,与HPLC-PMP检测结果较为一致,表明该传感器准确度较高,具有一定的实用价值。
欢迎来到三峡大学图书馆！
