关键词： 黄曲霉毒素B1   石胆酸   核受体   肝脏损伤   辅助因子  

摘要： 在温度和水分适宜的情况下,霉菌侵染农作物并产生次级代谢产物-霉菌毒素。黄曲霉毒素B1(Aflatoxin B1,AFB1)是曲霉属真菌产生的毒性极强的一种黄曲霉毒素。仔猪采食含有AFB1的饲料会导致器官受损、生长性能下降、甚至引发腹泻和死亡,给生猪产业造成巨大的经济损失。为了减少霉菌毒素对养殖业的危害,许多饲料及饲料原料都会进行脱霉处理。然而,这种处理会导致饲料适口性下降、营养物质含量减少、环境污染、以及脱霉不彻底,残留的霉菌毒素在仔猪体内蓄积仍可导致机体损伤。肝脏是机体主要的解毒器官,能够把有毒物质转化为低毒或无毒物质并随胆汁排出体外。研究表明,补充胆汁酸加速肝脏的代谢解毒过程,增强胆汁对胆管的冲刷,促进肝脏中毒素的排出,从而减轻毒素对机体的损伤。石胆酸(Lithocholic acid,LCA),作为一种重要的胆汁酸,在肝脏纤维化、肠道炎症和肠道吸收方面发挥调控作用。然而,LCA能否缓解AFB1诱导的仔猪肝脏损伤尚不清楚。因此,本研究以新生仔猪为研究对象构建AFB1损伤肝脏模型,探讨LCA对AFB1诱导仔猪肝脏损伤的作用及机制。主要研究结果如下: ***对AFB1诱导仔猪肝脏损伤的影响 本部分旨在明确AFB1诱导仔猪损伤肝脏,为后续机制研究提供基础。首先研究显示AFB1导致肝脏重量显著增加、胆囊内胆汁量减少、血液中中性粒细胞和单核细胞数量显著增多。添加LCA可缓解AFB1诱导的上述指标异常。此外,LCA缓解AFB1诱导的血浆中AFB1含量、AST/ALT/ALP水平显著升高、肝脏内炎性细胞聚集、胶原纤维沉积增多以及细胞死亡数量显著增多。通过RNA-seq进一步探讨LCA对AFB1诱导肝脏损伤的影响,发现AFB1导致肝脏解毒基因的表达显著降低。通过ATAC-seq分析发现AFB1导致全基因组染色质可及性增加,添加LCA逆转了染色质可及性增加。以上研究表明LCA缓解AFB1诱导的肝脏损伤。 ***通过核受体RORγ调控胆汁酸转运体表达缓解AFB1诱导的仔猪肝脏损伤 为了研究AFB1导致仔猪胆囊内胆汁量减少的作用机制,本研究对肠肝循环(血液、肝脏和回肠)部位的胆汁酸水平进行检测,结果显示AFB1处理导致血液和肝脏部位胆汁酸水平显著升高,回肠部位的胆汁酸水平显著降低。进一步研究AFB1导致机体内胆汁酸水平异常的机制,检测发现AFB1导致胆汁酸转运体SLC10A1和ABCB11的表达显著降低、启动子区染色质可及性降低,介导胆汁酸转运的补偿机制MRP3、SLC51A/B和ABCC2基因表达显著升高、启动子区染色质可及性增加。添加LCA缓解了AFB1的上述作用。为了进一步探究AFB1导致胆汁酸转运体表达异常的作用机制,通过ATAC-seq、RNA-seq和Western blot分析发现RORγ可能是调控SLC10A1、ABCB11表达的关键靶点。通过对临床数据分析发现,RORc基因表达与SLC10A1、ABCB11基因表达呈显著正相关。此外,RORγ与SLC10A1、ABCB11、NCOR1/2、SRC-1/3之间存在蛋白互作。通过Ch IP-q PCR和Co-IP检测发现AFB1导致NCOR1/2辅助RORγ抑制SLC10A1、ABCB11基因表达,添加LCA逆转了AFB1的上述作用。以上研究表明LCA通过核受体RORγ调控胆汁酸转运体表达缓解AFB1诱导的仔猪肝脏损伤。 ***对AFB1诱导仔猪肝脏炎症和细胞焦亡的影响 为了进一步探讨LCA对AFB1诱导仔猪肝脏损伤的影响,本研究对RNA-seq分析发现AFB1显著激活炎症反应、IFN-γ和TNF-α信号通路。此外,AFB1导致肝脏中TNF-α和IL-6表达显著升高、调控炎症反应的MAPK信号通路激活。炎症因子能够诱导经典细胞焦亡信号通路激活,通过检测发现AFB1导致NLRP3、ASC、Cleaved Casp1表达显著升高。同时AFB1导致细胞焦亡关键蛋白N GSDMD、炎症因子IL-18、IL-1β和Cleaved IL-1β表达显著升高。添加LCA逆转了AFB1的上述作用。以上研究表明LCA缓解AFB1诱导的仔猪肝脏炎症和细胞焦亡。 4.石胆酸对黄曲霉毒素B1诱导仔猪肝脏纤维化的影响 为了进一步探究细胞焦亡与肝脏纤维化的关系,对Casp1和肝星状细胞活化标记蛋白ACTA2进行共染,结果显示AFB1导致肝脏中ACTA2表达显著升高,Casp1和ACTA2不存在蛋白共定位,表明AFB1诱导肝星状细胞活化,但不发生细胞焦亡。此外,AFB1暴露导致肝脏促纤维化基因的表达显著升高、启动子区域染色质可及性增加,抑纤维化基因表达显著降低。本研究进一步检测分析发现NR1D1可能是调控肝脏纤维化的关键靶点。通过Ch IP-q PCR检测发现AFB1暴露导致NR1D1在COL1A1、

关键词： 黄曲霉毒素B1   间接竞争免疫分析法   双读值   智能手机   内过滤效应  

摘要： 黄曲霉毒素B1（AFB1）是由黄曲霉和寄生曲霉产生的一种真菌毒素,它对动物乃至人体器官都有很强的毒副作用,如肝肾毒性、致癌性、致畸性、免疫毒性和致突变性。AFB1普遍存在于谷物、水果、葡萄酒、坚果、调味品和豆制品等食品中,由于其热稳定性,它不会被正常的工业加工或烹饪破坏。鉴于AFB1的巨大危害性,100多个国家已经立法规定了农产品和食品中AFB1的最高限量,因此开发操作简便、灵敏度高的AFB1检测方法具有重要意义。 本文以基于酶联免疫分析法（ELISA）,结合比色分析法的可视化和荧光分析法的高灵敏性构建了三种免疫分析方法,实现了实际样品中AFB1含量的高灵敏和可视化分析。具体内容如下: 1.间接竞争ELISA（ic-ELISA）检测AFB1 基于抗原抗体的特异性结合,固定在酶标板上的AFB1完全抗原（BSA-AFB1）与样品中游离的AFB1竞相与单克隆抗体（Mc Ab）结合,再通过辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠抗体（HRP-Ig G）催化底物四甲基联苯胺（TMB）产生蓝色作为信号输出,建立了ic-ELISA。进行条件优化后,该方法对AFB1的最低检出限为0.12 ng/m L,检测范围为0.13-0.40 ng/m L,满足我国AFB1检出限的要求。与其他真菌毒素交叉反应率（CR）均<0.03%,特异性良好。玉米样品中的回收率在96.27%-106.53%之间,符合美国分析化学家协会（AOAC）的规定,证明了该方法的准确性和可靠性。 2.基于卤代吲哚酚（HIP）生成的双读数比色免疫分析法检测AFB1 该方法在ic-ELISA的基础上,用碱性磷酸酶标记的山羊抗小鼠抗体（ALP-Ig G）代替HRP-Ig G,在ALP的催化下,磷酸单苯酯（PP）脱磷生成苯酚。碱性条件下,苯酚与2,6-二溴对氯亚胺（DBQC）反应生成肉眼可见的蓝色HIP。此外,这种颜色信号可以通过智能手机转换为数字信号,从而实现对AFB1的定量检测。在最佳条件下,该比色免疫分析方法的肉眼检出限为0.70 ng/m L,智能手机检出限为0.013 ng/m L。实际样品加标的回收率在100.57%-105.49%之间,符合AOAC的规定,表明该方法用于实际样品中AFB1的实时检测是可行的。 3.基于4-氨基安替比林（4-AAP）和石墨烯量子点（GQD）的双模式免疫分析法检测AFB1 该方法依赖于HRP的催化作用,在过氧化氢（H2O2）存在下,HRP将邻苯二酚（CTC）氧化成邻苯二醌（BZQ）,BZQ与4-AAP偶联生成粉红色产物,粉红色产物与GQD之间的内过滤效应导致GQD的荧光猝灭,因此产生的颜色和荧光变化可作为双重信号显示AFB1的含量。在该双模式免疫分析法中,比色模式的检出限为0.016 ng/m L,检测范围为2.75-5.00 ng/m L,荧光模式的检出限为0.103ng/m L,检测范围为3.00-6.00 ng/m L,实际样品加标的回收率在92.85%-102.17%之间,符合AOAC的规定,表明该双模式免疫分析法具有良好的检测适用性。

关键词： 黄曲霉毒素B1   碳点   荧光免疫分析法   比色免疫分析法  

摘要： 黄曲霉毒素是由黄曲霉和寄生曲霉产生的次级代谢物,具有极大的危害。它广泛存在于食品、饲料成分、农产品和各种有机物质中,已分离和鉴定出10多种类型。其中,黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1,AFB1）毒性最大,导致大量食品和农产品污染,给人类生产和健康生活造成巨大损失。由于致突变性、致畸性和致癌性,AFB1被国际癌症研究机构（IARC）列为I类致癌物,严重威胁动物和人类健康。因此开发操作简便、灵敏度高的AFB1检测方法具有重要意义。 碳点（CDs）是一类新型碳纳米材料,具有高水溶性、低成本、低毒、优良的生物相容性等优点,所以本文以CDs作为荧光探针引入免疫检测分析,在建立AFB1的间接竞争酶联免疫检测方法（ic-ELISA）后,在ic-ELISA的基础上结合CDs构建AFB1检测的新型免疫检测方法,具体内容如下: ***1间接竞争ELISA方法的建立 辣根过氧化物酶标记的二抗（HRP-Ig G）催化底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）显色,溶液由无色变成蓝色,用硫酸终止反应后,通过读取450 nm处吸光度值进行分析,实现AFB1定量检测。所构建的ic-ELISA方法线性方程为:Y=221.722X–50.231,R2=0.993,对AFB1的检测范围是0.29～0.61 ng/m L,最低检测限（LOD）为0.45 ng/m L。在玉米中的加标回收率为100.33%～106.87%,变异系数小于5%,符合美国分析化学家协会（AOAC）的标准。 2.基于CDs的荧光免疫分析法检测AFB1 Cu2+可以猝灭的CDs的荧光,而焦磷酸钠（PPi）可以通过螯合Cu2+来恢复CDs的荧光,当碱性磷酸酶标记Ig G（ALP-Ig G）催化PPi的水解释放Cu2+后,CDs的荧光强度又会降低。通过CDs在460 nm处的荧光强度变化实现AFB1定量检测。所构建的荧光免疫分析法线性方程为Y=5.700 X+60.218,R2=0.992,对AFB1的检测范围为0.0625～4 ng/m L,最低检测限（LOD）为0.034 ng/m L。玉米样品加标回收实验中,回收率为97.91%～103.33%,此外,变异系数均小于10%,这些结果符合美国分析化学家协会（AOAC）的标准。 3.基于DAP和CDs的比率荧光和比色双模式免疫分析法检测AFB1 以2,3-二氨基酚嗪（DAP）和碳点（CDs）为基础,建立了AFB1的双模式免疫检测方法。在HRP-Ig G的催化下,邻苯二胺（OPD）被氧化生成具有黄色和强荧光的DAP,溶液由无色变成黄色。同时,DAP的吸收光谱与CDs的荧光发射光谱重叠,导致CDs的荧光被猝灭。利用DAP和CDs的荧光比值以及DAP的吸光度值变化实现AFB1定量检测。所构建的双模式免疫分析法中荧光法的线性方程为Y=-3.233 X+6.129,R2=0.991,LOD为0.013 ng/m L;比色法线性方程为Y=-0.694 X+1.391,R2=0.991,LOD为0.061 ng/m L。两种模式对AFB1的检测范围均为0.75～1.8 ng/m L;玉米样品加标回收实验中,荧光法的回收率为98.75%～104.25%,比色法的回收率为93.63%～104.63%,此外,变异系数均小于5%,这些结果符合美国分析化学家协会（AOAC）的标准。

关键词： 黄曲霉   黄曲霉毒素B1   M2M   转录因子Af Mcm6及AfSreA   DNA损伤  

摘要： 黄曲霉(Aspergillus flavus)广泛污染玉米、花生和小麦等重要农作物,在储藏和加工过程中污染多种食品,其产生的黄曲霉毒素具有强烈的毒性和致癌性,严重威胁食品安全和人类健康。据报道,全球多达28%的原发性肝细胞癌由黄曲霉毒素引起;我国四川、湖北、广东等高温高湿地区种植的玉米,黄曲霉毒素阳性率超过90%,农产品中黄曲霉毒素超标问题已经严重影响我国食品加工行业的产品质量、食用安全性及相关产品的对外出口。目前,对于控制农产品黄曲霉危害及黄曲霉毒素污染尚缺乏令人满意的方法。化学防治仍是目前控制黄曲霉污染的主要策略。因此,开发绿色、高效、高特异性的杀菌剂以防控黄曲霉及黄曲霉毒素污染,对保障食品安全具有重要意义。2-甲基丁酸甲酯(M2M)是国标(GB 2760—1996)规定的食品添加剂,对多种细菌及真菌具有广谱抗菌特性,但对黄曲霉的作用缺乏报道。本研究针对这一问题展开研究,研究M2M对黄曲霉及黄曲霉毒素的抑制作用;探索M2M抑制黄曲霉及黄曲霉毒素的机制。主要研究结果如下: (1)M2M显著抑制黄曲霉生长及黄曲霉毒素B1的产生。 通过生理生化指标分析表明,M2M能够显著抑制黄曲霉的生长、产孢、产毒及菌核形成。其中,M2M对黄曲霉的最小抑制浓度(MIC)为2.0μL/m L,其以剂量依赖性方式抑制黄曲霉的生长发育及产毒。 (2)M2M通过破坏细胞壁、细胞膜、降低ATP水平、诱导ROS积累及DNA损伤进而抑制黄曲霉的生长。 收集用1/2 MIC处理过的黄曲霉菌丝进行转录组分析,结果显示,与对照菌株相比,共有2899个显著差异表达基因(DEGs)(1439个上调,1460个下调)。这些DEGs主要集中在AFB1生物合成、孢子萌发、细胞壁及细胞膜的形成、糖酵解、TCA循环、氧化应激、DNA损伤等生物途径。实时荧光定量PCR(RT-q PCR)结果表明黄曲霉毒素生物合成途径相关基因afl B、afl C、afl H、afl R的转录水平下调,与转录组结果一致,表明M2M通过下调AFB1生物合成途径中afl B、afl C、afl H、afl R基因表达进而抑制AFB1合成。此外,生理生化指标结果表明,M2M破坏了黄曲霉细胞壁和细胞膜的完整性,降低胞内ATP含量,诱导菌丝ROS的积累和DNA损伤,与转录组结果一致。 (3)敲除转录因子AfSreA显著抑制黄曲霉生长及产量。 我们通过同源重组技术构建GATA型锌指转录因子AfSreA(AFLA＿132440)的缺失菌株,并分析其对黄曲霉生长的影响。结果显示,敲除AfSreA显著抑制黄曲霉的生长、黄曲霉毒素B1的合成、菌核的产生及黄曲霉致病性。刚果红试验表明,AfSreA缺失破坏黄曲霉细胞壁完整性,表明敲除AfSreA通过破坏细胞壁完整性抑制黄曲霉生长;RT-q PCR结果显示AfSreA缺失显著抑制了afl B、afl C、afl E、afl H、afl K、afl L、afl R基因的表达水平。表明AfSreA通过抑制AFB1生物合成途径基因表达进而抑制黄曲霉生长及产毒。 (4)敲除转录因子AfMcm6通过下调AfFui1基因表达诱导黄曲霉DNA损伤,进而显著抑制黄曲霉生长和产毒。 我们首先通过同源重组技术构建转录因子AfMcm6(AFLA＿119250)的缺失及回补菌株,证实了该基因缺失能够诱导DNA损伤,同时显著抑制了黄曲霉的生长、产孢及产毒。对AfMcm6缺失前后的菌株进行转录组分析发现,黄曲霉中编码尿嘧啶/尿苷透过酶的同源基因AfFui1(AFLA＿072600)表达水平显著下降。TUNEL染色结果表明,敲除AfFui1仍可诱导黄曲霉DNA损伤,且抑制黄曲霉生长和产毒。因此,我们认为转录因子AfMcm6调控AfFui1参与诱导黄曲霉DNA损伤,从而抑制黄曲霉的生长和产毒。 综上所述,本研究在明确M2M显著抑制黄曲霉及黄曲霉毒素产生的基础上,通过转录组分析结合生理生化指标进一步揭示了M2M抗黄曲霉的作用机理,同时筛选到有效的转录因子,并解析其功能,为开发新型高特异性杀菌剂,以防控黄曲霉污染提供理论依据。

关键词： 猪流感病毒   黄曲霉毒素B1   猪肺泡巨噬细胞   蛋白组学技术   内质网自噬  

摘要： 背景:猪流感病毒（Swine influenza virus,SIV）是目前世界上传播最为广泛的病毒之一,可引起人畜共患病。虽然SIV在通常状态下不易造成死亡,与非洲猪瘟病毒、蓝耳病病毒、伪狂犬病病毒等相比相对温和,但是却有很高的传染性。SIV的复制受到多种因素的影响,包括宿主自身条件、营养状况、饲养条件和气候环境等因素。黄曲霉毒素B1（AFB1）是目前世界范围内最常见、饲料中检测最多的霉菌毒素之一,污染普遍,对人类和动物危害很大。尤其对畜禽健康危害巨大,有研究表明AFB1不但破坏机体的免疫系统,导致抵抗力下降进而易感多种疾病易,而且易造成疫苗免疫失败,进一步加重了感染疾病的风险。我们团队之前的研究表明,低剂量的AFB1暴露促进了HIN1型SIV的复制,然而其机制尚不清楚,需要进一步探索。 目的和意义:本试验立足于我国对养猪生产和猪病防治的重大需求,为突破AFB1污染导致免疫抑制进而增大猪病控制难度的瓶颈问题,应用蛋白质组学、免疫印迹、透射电镜和抑制剂等多种技术和手段从动物体、细胞和分子水平系统地研究AFB1促进SIV复制的作用机制。研究成果将为研究SIV感染的致病机制和防控提供理论基础,对养猪业的健康发展意义重大。 方法:本试验首先体外传代培养猪肺泡巨噬细胞（Porcine Alveolar Macrophages,PAM）系（3D4/21）,建立SIV感染细胞模型,选择不同浓度AFB1处理细胞,利用蛋白质组学平台下的体外同重同位素标记的相对与绝对定量技术（Tandem Mass Tags,TMT）筛选关键差异蛋白和通路。使用免疫印迹技术和特异性激活剂/抑制剂进一步验证并调控AFB1促进SIV复制的上、下游调节通路,从而阐明AFB1促进SIV复制的作用机制。建立SIV感染仔猪模型,进一步验证关键差异表达蛋白和通路变化情况,以及AFB1对SIV复制的促进作用,揭示AFB1促进SIV复制的分子机制。 结果:体外蛋白质组学技术分析显示,在0.04μg/m L AFB1暴露组和对照组有8个显著差异表达的蛋白质,其中有6个蛋白质的表达水平显著上调,有2个蛋白质的表达水平显著下调。之后经过多重筛选和比对,我们发现其中内质网自噬调节因子1（RETREG1）是差异极显著的上调蛋白质,说明AFB1促进SIV复制的同时可能促进PAM内质网发生自噬,随后的WB和透射电镜结果也证实AFB1确实促进了SIV感染的PAM发生内质网自噬。此外,MAPK和RIG-I是AFB1促进SIV复制的关键通路,免疫印迹试验验证了p38 MAPK和RIG-I分别是差异极显著的上调和下调通路因子,说明p38 MAPK和RIG-I参与调节AFB1促进SIV复制。体内试验证实AFB1确实促进SIV在仔猪肺脏复制,加重SIV感染所致肺损伤及其他器官损伤,并上调RETREG1和p38,同时抑制RIG-I。 结论:本研究结果表明,AFB1暴露可能通过抑制RIG-I、激活p38以及RETREG1介导的内质网自噬促进SIV复制,预示了内质网自噬、RIG-I以及p38相关药物对流感的治疗潜力。