关键词：
霉菌毒素
产毒真菌
黄曲霉毒素B1
玉米赤霉烯酮
呕吐毒素
霉变率
多重PCR
摘要：
霉菌毒素能够降低饲料的饲喂价值,影响畜禽的生产性能,对动物组织机能、健康产生不利影响,甚至导致畜禽死亡。黄曲霉毒素B1(AFB1)、玉米赤霉烯酮(ZEN)、呕吐毒素(DON)是被大众广泛研究的三种霉菌毒素,也是污染最为普遍的三种毒素。霉菌毒素可以不同的剂量对动物和人的健康造成不同程度的威胁。因此,对于霉菌毒素以及产毒霉菌的检测显得至关重要。目前常用的霉菌毒素检测方法有薄层层析、液相色谱、免疫化学分析等几种方法,主要基于霉菌毒素的理化性质,无法检出己被产毒真菌污染但尚未产毒的高风险样品。多重PCR检测方法,可在单一泳道反应体系中同时检测多个DNA模板或同一模板的不同区域,具有快捷、高效、低成本等优点,被广泛应用于有害微生物检测。
本课题调研了我省2012年秋季玉米中黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素的污染情况,对三类霉菌毒素与玉米籽粒水分含量、破损率、霉变率之间的相关性进行了分析。以产毒真菌黄曲霉、镰刀菌的基因组DNA为模板,根据AFB1、ZEN、DON三种毒素生物合成中关键基因的序列设计引物,构建了能够从样品中快速灵敏检测潜藏性产毒真菌的多重PCR检测体系。1)课题从我省各地采集了87份玉米样品,利用ELISA试剂盒对各样品中黄曲霉毒素B1(AFB1)、玉米赤霉烯酮(ZEN)、呕吐毒素(DON)的含量进行检测。结果表明,AFB1、***的检出率分别为98.85%、100%、100%; ZEN超标率最高,达到12.64%,DON超标率次之,为6.90%,AFBl超标率最低为3.45%；对三种毒素含量之间的相关性进行分析,结果发现ZEN与DON之间存在着极显著的线性相关性(p=0.0008),相关系数为0.1368。
2)根据国标GB13078-2001规定,对各个样品的水分含量,采用统计方法对各个样品籽粒破损率、霉变率进行检测,所得各项数据与AFB1、ZEN、DON的含量进行相关性分析。结果表明,所有玉米样品中自由水、结合水、总水含量最高值分别为14.06%、5.95%、19.24%,最低值分别为4.79%、1.11%、9.46%,平均含量分别为9.44%、4.02%、13.46%；平均霉变率、残破率分别为5.08%、6.08%,霉变率最严重的样品达到27.20%,残破率最严重的为31.80%；霉变率与ZEN含量呈极显著相关性(P=0.0058),与残破率呈显著相关性(P=0.0354)。
3)本课题分别根据AFB1、ZEN、DON生物合成中的调控基因aflR、PKS13、tri5的序列以及真菌共有的P-Tubulin基因序列设计出四对引物,用于构建快速、灵敏检测饲料用玉米中潜藏性的产毒素真菌的多重PCR反应体系。经过逐步的体系优化,初步建立了一个多重PCR检测方法,可对四个基因进行扩增,扩增的四个片段分别为400bp(aflR)、658bp (tri5)、537bp (β-Tubulin)、192bp (PKS13);从玉米样品中提取到的真菌DNA经多重PCR扩增,目的条带均较为清晰。
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