关键词： 氨甲酰磷酸合成酶1   黄曲霉毒素B1   互作蛋白   肝癌  

摘要： 氨甲酰磷酸合成酶1是尿素循环的第一个限速酶,在机体解毒氨中起着重要作用,在肝细胞癌中发生了下调。尿素循环的产物血胺在肝癌和肝癌诱发剂黄曲霉毒素B1(AFB1)处理的肝细胞及组织中都出现了下调。但还没有证据说明AFB1参与了肝癌中CPS1表达的调控。本实验首先揭示了 CPS1在小鼠不同组织和人源细胞中的表达情况,发现其主要表达在肝脏中,小肠里面也有少量的表达;然后依据CPS1在不同物种中的进化分析揭示了 CPS1的高度保守性。并证明了 AFB1下调CPS1的表达,且有时间和浓度的依赖性。接着分析了两种CPS1下调的途径:DNA甲基化和Y-boxing binding protein上调,发现它们并未参与AFB1导致的CPS1下调。同时,过表达和干扰CPS1的表达,发现CPS1的干扰抑制了细胞的增殖活性,细胞出现了凋亡,说明CPS1在细胞中非常重要。为了探索CPS1下调的机制,利用内源性免疫共沉淀结合质谱找到了 5个CPS1的互作蛋白(DSP、HSJUP、KRT1、ALB和UBC),并分析了这些互作蛋白与CPS1和AFB1之间的调控关系。接着采用蛋白分子对接及免疫共定位进一步分析了他们的互作关系,发现角蛋白1是最有可能的CPS1的互作蛋白。CPS1和角蛋白都在细胞分化中扮演着重要的角色,他们之间的互作很可能为分析CPS1在肝癌的形成及肝细胞的分化过程中的作用提供新的线索。

关键词： 黄曲霉毒素B1   膜结合蛋白   40S核糖体蛋白A   雌二醇β脱氢酶5  

摘要： 黄曲霉毒素B1(Aflatoxin B1,AFB1)是目前已知霉菌中毒性最强的物质。AFB1不仅能引起急性中毒和慢性中毒,还有致癌、致畸、致突变的三致作用,严重危害人类和各种动物的健康。一直以来关于真菌的产毒机理、毒素的致毒机理已有大量研究,但由于该毒素是小分子化合物,针对该毒素如何被动物细胞吸收的机理研究很少。本研究设计了一种以固相亲和层析技术为基础筛选AFB1结合蛋白的方法,并对筛选出的蛋白进行分析验证。该方法首先制备了AFB1偶联蛋白复合物(AFB1-BSA),然后将AFB1-BSA与小鼠的总蛋白孵育、经非特异性洗涤和特异性洗脱、SDS-PAGE分析、质谱分析鉴定等步骤,一共得到雌二醇β脱氢酶5(Akr1c6)、果糖二磷酸醛缩酶B(ALDOB)、40S核糖体蛋白A(Rpsa)等8个可能的AFB1结合蛋白。在进一步的生物信息学分析后,本研究进一步分析验证Akr1c6和Rpsa蛋白与AFB1的相互作用。其中,Rpsa蛋白是层粘连蛋白、阮病毒、细菌等的膜结合蛋白。随后,本研究成功克隆出rpsa和akr1c6两个基因,将基因分别构建到原核表达载体pET28a上并转化到*** BL21(DE3)宿主菌中,然后通过IPTG诱导蛋白的表达和Ni柱进行纯化。本研究中通过酶联免疫分析法,以AFB1-BSA包被96孔板,分别和纯化的Rpsa和Akr1c6蛋白孵育后,用抗HIS抗体检测,证实了 Rpsa和Akr1c6蛋白与AFB1间确实存在体外结合作用。本研究还通过荧光共定位的方法,我们在细胞水平上观察Rpsa与AFB1是否存在作用关系;结果发现,在HELA细胞中,二者存在共定位现象,即Rpsa蛋白和AFB1存在着基于细胞类型的相互作用。本研究还利用纯化的Rpsa和Akrlc6蛋白对Balb/c小鼠进行皮下多点注射,成功制备了 Rpsa和Akr1c6蛋白的多克隆抗体,为进一步的细胞水平上的蛋白功能研究打下了基础。本研究筛选并验证了两个AFB1的结合蛋白:Rpsa和Akr1c6。目前正进行细胞内它们与AFB1的吸收和分布等相关生物学功能的进一步分析,以期能为AF1如何进入动物细胞的研究打下基础。

关键词： 黄曲霉毒素B1   三维纳米阵列电极   化学修饰电极   免疫传感器   模拟  

摘要： 本文综述了纳米阵列电极以及黄曲霉毒素电化学生物传感分析的国内外研究现状和进展。制备出三维纳米阵列电极（3DNEEs）并对其进行了表征，建立模型对有序3DNEEs的电极过程和动力学参数进行了模拟。构建了基于聚邻苯二胺（PoPD）修饰3DNEEs（PoPD/3DNEEs）的高灵敏度的无标记阻抗型AFB1免疫传感器。 通过正交实验对聚碳酸酯滤膜上金的化学沉积条件进行了优化。采用SEM、EDX和XRD对3DNEEs的形貌和成分进行表征。结果表明3DNEEs为纯金，纳米线直立平行排布。在H2SO4溶液和K3Fe（CN）6/K4Fe（CN）6溶液中对3DNEEs进行表征，3DNEEs的真实面积大于其几何面积，3DNEEs上扩散层发生较大重叠，主要为线性扩散，也存在部分径向扩散。 采用Comsol Multiphysics4.4多物理场模拟软件建立了有序3DNEEs的模型，首次系统地对不同半径、长度及间距的3DNEEs的循环伏安行为和阻抗谱进行了模拟。循环伏安曲线模拟结果表明，在3DNEEs上存在一个临界间距dmin，只有纳米柱间距大于该值时才可能在一定扫速下出现S形曲线。当纳米柱直径为100nm，纳米柱长度从200nm00nm变化时，dmin与纳米柱的表面积具有线性关系，而固定纳米柱的长径比为3:1，直径在50nm00nm变化时，dmin与纳米柱的半径具有线性关系。通过阻抗谱模拟和拟合，计算出电极活性面积、传荷阻抗以及表观速率常数等参数。计算结果与参数设置基本一致。3DNEEs上的阻抗谱在低频区出现一段圆弧，表明纳米柱上的传质过程受阻挡层扩散的影响。 本文制备出梯形和苯胺式两种不同结构的PoPD/3DNEEs，研究了其在传感器组装和检测中不同溶液中的稳定性，结果表明梯形结构PoPD/3DNEEs具有更好的稳定性。本文首次构建了基于PoPD/3DNEEs的电化学免疫传感器对AFB1进行分析。对免疫传感器分子识别膜组装过程中的聚合条件、交联时间和BSA封闭时间，以及传感器的测定体系、pH值、免疫反应时间进行了优化。构建分子识别膜模型并建立等效电路对阻抗谱进行拟合。结果表明本文构建的AFB1免疫传感器具有较宽的工作范围和较低的检测限，工作区间为3.0×10-9～1.0×10-7g/mL，检测限为1.5×10-9g/mL，低于欧盟规定的最低限量标准。与其他研究者构建的无标记阻抗型AFB1免疫传感器相比也具有明显优势。

关键词： 黄曲霉毒素B1   黄曲霉毒素M1   杂色曲霉毒素   高灵敏度   高特异性   单克隆抗体   酶联免疫吸附测定(ELISA)  

摘要： 随着经济的快速发展，生活质量的不断改善，真菌毒素污染等对农产品及食品安全产生的影响已成为近几年以来政府重视、社会关注、世界瞩目的热点问题。其中黄曲霉毒素是威胁农产品及食品安全的毒性最强的一类真菌毒素，黄曲霉毒素及其生物合成前体物杂色曲霉毒素的污染，不仅严重威胁人民的身体健康和生命安全，而且对我国的经济贸易有巨大的负面影响。因此，研究建立准确、灵敏、便捷的黄曲霉毒素和杂色曲霉毒素免疫分析技术势在必行。 抗体是免疫分析的关键核心试剂，靶标免疫分析灵敏度直接取决于其特异性抗体的特性。本课题组前期研制出了居国际领先水平的系列黄曲霉毒素单克隆抗体，其中黄曲霉毒素B1和黄曲霉毒素M1单克隆抗体与国内外抗体同比特异性最高。然而，黄曲霉毒素B1迄今特异性最强的单克隆抗体3G1仍与黄曲霉毒素B2有6.4%的交叉反应，且灵敏度有待大幅度提高;黄曲霉毒素M1迄今特异性最强的单克隆抗体2C9灵敏度仍有待提高。杂色曲霉毒素作为黄曲霉毒素的合成前体物，制备抗杂色曲霉毒素的单克隆抗体，可将其作为一种黄曲霉毒素前体物通用抗体探明黄曲霉毒素发生积累标志分子，从而为风险评估和污染防控提供理论依据，然而，国内外杂色曲霉毒素抗体研制方面鲜有报道。因此，研制同时具备高灵敏度和高特异性的黄曲霉毒素及其前体杂色曲霉毒素单克隆抗体，研发基于该抗体的免疫快速检测技术和产品，对于农产品质量安全风险评估及预警，保障人民的农产品、食品消费安全，促进农业产业的可持续发展，打破贸易技术瓶颈均具有重要的意义。 针对上述黄曲霉毒素及其前体杂色曲霉毒素高灵敏高特异性抗体缺乏的关键性技术难题，本论文的主要研究内容和创新点如下： 1.选育出黄曲霉毒素B1抗体杂交瘤细胞株1B5等，研制出高灵敏高特异性黄曲霉毒素B1单克隆抗体，灵敏度提高了100倍以上。制备高质量抗体的关键是制备高质量的人工抗原，人工抗原制备最关键的是半抗原结构的设计，本研究参考Christian Cervin所述方法，并在此基础上进行改进，合成了一种新的黄曲霉毒素完全抗原AFB2-GA-BSA;同时，按照经典肟化方法合成了AFB1-BSA。AFB2-GA-BSA按传统免疫剂量（50μg/次）免疫小鼠，AFB1-BSA按照加大剂量(150μg/次)免疫小鼠，均通过细胞融合、半固体培养基培养、两步梯度法筛选，最终，利用加大剂量的AFB1-BSA免疫小鼠，选育出了4株性能良好的单克隆细胞株，分别是1F11、2F12、2C7、1B5。采用间接竞争ELISA测定系列抗体的灵敏度，并计算交叉反应率，抗体针对黄曲霉毒素B1反应灵敏度高，与B2，G1，G2的几乎不存在交叉反应。并且以灵敏度和特异性为综合分析点，与国内外同类抗体对比后可以发现，1B5是迄今最好的针对黄曲霉毒素B1的单克隆抗体。以单克隆抗体1B5为基础，研究建立了AFB1间接竞争酶联免疫吸附分析技术（Enzyme-linkedimmunosorbent assay, ELISA）。其中包被抗原AFB2-GA-BSA的浓度为0.0625μg/mL，1B5单克隆抗体稀释度为1:20000。并对封闭试剂、pH值、盐离子浓度等理化参数进行了优化。 2.选育出黄曲霉毒素M1抗体杂交瘤细胞株LM13等，研制出高灵敏高特异性黄曲霉毒素M1单克隆抗体，灵敏度均提高了2倍以上。为获得更高灵敏度，高特异性AFM1抗体，在前期基础上，加大了免疫剂量，延长了免疫周期。通过细胞融合技术，半固体培养基基，两步梯度法筛选最终获得9株抗AFM1单克隆细胞株，分别命名为LM47、LM15、LM16、LM54、LM13、LM32、LM44、LM48、LM46，采用间接竞争ELISA对上述纯化抗体进行灵敏度检测，并计算交叉反应率，结果显示，所得抗体灵敏度均比2C9抗体提高2倍以上，大部分抗体与AFB1，AFB2，AFG1，AFG2交叉反应较低。以灵敏度最高的单克隆抗体LM13为基础，研究建立了AFM1间接竞争ELISA方法。其中包被抗原AFM1-BSA的浓度为0.0625μg/mL，LM13单克隆抗体稀释度为1:120000。并对封闭试剂、pH值、盐离子浓度等理化参数进行了优化。 3.选育出能稳定分泌抗杂色曲霉毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株ST3等，研制出高灵敏高特异性杂色曲霉毒素单克隆抗体。本研究通过打开ST分子结构中双呋喃环的双键与蛋白实现偶联，并将ST人工抗原进行紫外扫描，结果表明其特征吸收峰与BSA和ST的特征吸收峰有明显差异，BSA与ST成功偶联。利用新合成的ST完全抗原免疫小鼠，通过细胞融合、半固体培养基培养、两步梯度法筛选，最终筛选得到3株性能良好的单克隆细胞株，分别是ST3，ST4，ST6。采用间接竞争ELISA测定系列抗体的灵敏度，并计算交叉反应率，灵敏度均很高，且不与AFB

关键词： 中药生物药剂学   生物有效性评价体系   整合药代动力学   “银翘”药对   Drug-drug interaction   ∑PK-PD   化学计量学   生物效应放大   肠吸收屏障  

摘要： 中药复方制剂由于多组分产生的多靶点生物效应特点使其生物有效性难以评价,剂型设计与技术应用更难以进行,建立与中药制剂效应相关的可量化的生物有效性综合评价体系及合适的制剂学技术应用不仅是中药制剂基本科学问题,更是中药现代化研究的关键。 中药制剂生物有效性综合评价体系的建立及制剂学应用存在以下技术瓶颈：①以网络效应形式表达的中药制剂功效所对应的多组分活性成分及其构效与量效关系的复杂性使得与中药制剂生物有效性表达相关的活性成分群难以辨识；②中药制剂多组分体内过程及其相互影响规律难以阐明,综合体系难以构建；③中药活性成分群及伴生物质群理化性质的复杂性使得中药制剂剂型设计、技术选择陷入困窘。如何运用合适的手段快速、正确的辨识活性成分群,打破中药制剂过程质量控制标准不完善的技术瓶颈?如何表征中药制剂生物药剂学的综合评价体系,打破中药制剂剂型改革与技术应用量化标准不完善的技术瓶颈?针对活性成分群整合药代动力学-Integrated AUC氏,如何选择适合的药剂学技术提高Integrated AUC?等等关键问题均有待进一步研究。 因此,本课题以生物药剂学与药代动力学为基础,选择临床配伍最小单位“药对”—“银翘”为研究对象。作者针对活性成分群难以辨识,创新性地提出'Drug-drug interaction结合ΣK-PD相关性辨识‘银翘,药对主要活性成分”及“‘生物效应放大,佐证‘银翘,药对中金银花、连翘主要活性成分”等思路来辨识、佐证“银翘”药对主要活性成分,通过“‘抗病毒效价-IC50’分析研究‘银翘’药对整合药代动力学-Integrated AUC的思路来评价“银翘”药对生物有效性,针对中药制剂剂型设计、技术选择等瓶颈,作者选择简单的药剂学手段—吸收促进剂技术,并通过‘"Integrated AUC研究调控市售‘银翘’制剂抗病毒生物活性”的思路成功应用于市售四种制剂(双黄连口服液、银翘解毒片、复方芩兰口服液、清热解毒口服液),显著提高了制剂的抗病毒疗效。 UHPLC-LTQ-Orbitrap-MS结合UPLC-ESI-MS/MS定性、定量“银翘”药对体内外化学成分的研究结果表明,利用UHPLC-LTQ-Orbitrap-MS,共检测体外化合物35种,包括了酚酸类7种(新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、3,5-二咖啡酰奎宁酸、3,4-二咖啡酰奎宁酸、奎宁酸、咖啡酸),苯乙醇苷5种(异连翘酯苷、连翘酯苷A、连翘酯苷B、连翘酯苷D、连翘酯苷E),黄酮类7种(芦丁、异槲皮苷、金丝桃苷、紫云英苷、木犀草苷、槲皮素、木犀草素),异黄酮类2种(染料木苷、染料木素),木脂素类9种(牛蒡子苷、连翘苷、松脂素-β-D-glucoside、牛蒡子苷元、松脂素、连翘脂素、表松脂酚、表松脂酚-β-D-glucoside、松脂素单甲基醚),皂苷类2种(灰毡毛忍冬皂苷乙、川续断皂苷乙),环烯醚萜类3种(马钱苷、当药苷、Centauroside)。纵观国内外文献及现有对照品信息,创新性的开发了一种UPLC-ESI-MS/MS同时快速定量“银翘”药对26种指标性成分的方法。并利用UHPLC-LTQ-Orbitrap-MS分析了“银翘”药对血中“移行成分”,结合体外分析结果,共检测体内化学成分32种,其中包括29种原形化合物,分别为酚酸类7种(新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、3,5-二咖啡酰奎宁酸、3,4-二咖啡酰奎宁酸、奎宁酸、咖啡酸),苯乙醇苷5种(异连翘酯苷、连翘酯苷A、连翘酯苷B、连翘酯苷D、连翘酯苷E),黄酮类7种(芦丁异槲皮苷、金丝桃苷、紫云英苷、木犀草苷、槲皮素、木犀草素),异黄酮类2种(染料木苷、染料木素),木脂素类7种(连翘苷、松脂素-β-D-glucoside、牛蒡子苷元、松脂素、连翘脂素、表松脂酚、表松脂酚-β-D-glucoside),环烯醚萜类1种(马钱苷)。且通过MetWorks软件及文献的比对,发现3种代谢产物,根据其质谱裂解规律,分别为A1#(松脂酚-o-glucuronide),A2#(表松脂酚-o-glucuronide),A3#(连翘脂素-o-glucuronide)。基于“入血物质才可能为活性成分”,以上29种化合物可作为体内研究对象,并作为指标性成分来代表“银翘”药对,但限于现有对照品缘故,且①松脂素、连翘脂素、表松脂酚在“银翘”提取液中含量甚低；②表松脂酚-β-D-glucoside、松脂素-β-D-glucoside虽为同分异构体,质谱显示其具有相同的裂解规律(相同的母离子、子离子),但UPLC-ESI-MS/MS分析“银翘”药对药代动力学时,发现血中只检测到松脂素-β-D-glucoside,并未见表松脂酚-β-D-glucoside;(③具有类似母核的化合物具有相同的吸收机制,如：苯乙醇苷类,通过研究异连翘酯苷、连翘

关键词： 凡纳滨对虾   黄曲霉毒素B1   生化指标   肝胰腺显微结构  

摘要： 试验设置黄曲霉毒素B1（AFB1）为0μg/kg（对照组）、400μg/kg、800μg/kg、1200μg/kg，1600μg/kg、2000μg/kg6组饲料，饲养初始体重为（0.3±0.02g）的凡纳滨对虾，将对虾随机分配于18个水族箱内（6组，每组3个重复），每个水族箱放养30尾对虾，投饲率为每箱试验虾体重的6%-7%，每14天根据体重的变化调整投喂量。本研究旨在观察饲料中AFB1对凡纳滨对虾生长、体营养成分、血淋巴和肝胰腺生化指标及肝胰腺显微结构的影响。试验周期共8周。试验结果表明：随着饲料中AFB1含量的增加，各试验组全虾粗蛋白量与对照组无显著性差异，1600μg/kg组和2000μg/kg组的全虾粗脂肪量高于其他组。AFB1为1200μg/kg时对虾增重率最低（304.67%），2000μg/kg时增重率显著高于其他组，但成活率最低（58.33%）。随着饲料中AFB1的升高酶活性普遍呈下降趋势。2000μg/kg组肝胰腺中总抗氧化能力（T-AOC）显著下降（P<0.05），1600μg/kg组肝胰腺中谷胱甘肽S转移酶（GST）、超微量ATP酶和超氧化物歧化酶（SOD）活力最低，但血淋巴中GST显著高于其他各组（P<0.05）。与对照组相比饲料中AFB1为1600μg/kg时，凡纳滨对虾血细胞总数（THC）显著降低（P<0.05）。1600μg/kg和2000μg/kg组血淋巴谷丙转氨酶（GPT）和谷草转氨酶（GOT）以及肝胰腺中GOT活性最高，2000μg/kg组肝胰腺GPT显著高于其他各组（P<0.05）。各试验组的肝胰腺谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）活性随着饲料中AFB1的增加逐渐降低，AFB1为2000μg/kg时GSH-PX酶活性最低。各试验组血淋巴中丙二醛（MDA）含量之间无显著性差异（P>0.05）但均显著高于对照组（P<0.05），2000μg/kg组肝胰腺MDA含量与对照组之间无显著性差异（P>0.05），其他试验组MDA含量与对照组相比显著增加（P<0.05）。通过凡纳滨对虾肝胰腺组织病理切片可观察到，摄食高含量AFB1饲料对虾的肝胰腺受损伤程度更高。试验对虾肝胰腺中AFB1的残留量随着饲料中AFB1含量的增加而逐渐增加，其中对虾肝胰腺中AFB1含量最高的是2000μg/kg组（95.49μg/kg），各试验组肌肉中无AFB1残留。由此得出，饲料中AFB1含量越高对凡纳滨对虾非特异性免疫和抗氧化能力的影响越大，AFB1在对虾肝胰腺中残留贮存，在肌肉中未检测出，虾肉可安全食用。

关键词： 花生粕   黄曲霉毒素B1   电子束辐射   降解产物  

摘要： 花生是我国主要的油料作物，产量居于各种油料之首。我国每年用于榨油的花生约有800万吨，榨油后得到花生粕300多万吨。花生粕营养丰富，但花生极易感染真菌，产生黄曲霉毒素，严重限制了花生粕的应用。电子束（EB）加速辐照技术作为一种去除黄曲霉毒素的新方法，具有高效、环保、安全、对降解体系影响小等优点，广泛应用于食品及环境中的杀菌、脱毒与保鲜等。该技术在去除简单体系中黄曲霉毒素的有效性已得到证实，但应用到花生粕中黄曲霉毒素去除的有效性、降解机理、安全性及对花生粕品质的影响等方面仍有待研究。本课题以黄曲霉毒素B1（简称AFB1）为研究对象，研究其在水以及花生粕中的降解行为、降解产物、路径等机理，并通过鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验和细胞毒理实验对降解产物的致突变性和细胞毒性进行了研究，同时评估了EB去毒工艺对花生粕品质的影响。 首先，研究花生粕中不同辐照剂量、不同初始浓度、不同物料厚度、不同水分含量等因素对AFB1电子束降解行为的影响。结果表明，花生粕中AFB1的降解效果与辐照剂量有关，受初始浓度、固体粕厚度和水分含量影响。AFB1水溶液在4kGy时降解率达80%，8kGy时达92%。在实验范围内，随着辐照剂量、初始浓度和固体粕中水分含量的增加，花生粕中AFB1的降解效果增强;固体粕厚度增加降解率降低。 然后，运用UPLC-Q-TOF/MS技术鉴定出水中五种降解产物分别为P1（C16H12O7）、P2（C16H16O6）、P3（C17H14O8）、P4（C15H12O6）和P5（C17H12O7），降解过程首先由AFB1在C（6a）-O（7）处发生分子间氢提取反应，并在C（1）-C（2）处和C（3）-C（3a）处发生消去反应生成P4，AFB1同时也在C（8）-C（9）处发生加成反应生成P3，P3再发生消去反应、还原反应等生成P1、P2和P5。五种EB降解产物结构与AFB1类似，只在部分基团稍有不同。花生粕中AFB1电子束降解反应剧烈，AFB1经过电子束辐照以后，迅速发生氧化反应，断裂为小分子物质。 此外，应用Ames和细胞毒理实验研究水、花生粕两种体系中AFB1降解产物的致突变性和细胞毒性。结果表明：阳性对照AFB1对鼠伤寒沙门氏菌组氨酸缺陷型菌株和HepG2细胞毒性强烈，导致细胞活性降低72.44%。经过EB去除两种体系中AFB1后，辐照降解产物致突变性和细胞毒性已大幅度降低（p＜0.001），其中水中EB降解产物致突变性降低50%以上，细胞活性降低18.61%，花生粕中降解产物已无毒性（p＜0.001）。 最后，在降解有效性的基础上以花生粕为原料，选取粗脂肪、粗蛋白、氨基酸、总糖、还原糖、总黄酮、灰分和脂肪酸含量等几个重要营养指标为检测对象，研究不同辐照剂量下，EB降解花生粕中AFB1对花生粕品质的影响。结果表明：在实验剂量范围内，随辐照剂量增加，花生粕中还原糖、总黄酮、棕榈酸、亚油酸、油酸含量有少量增加，花生酸含量降低，粗脂肪、粗蛋白、氨基酸总量、总糖和灰分含量等无显著变化（p＞0.05）。应用EB辐射技术去除花生粕中AFB1对花生粕品质影响较小。

关键词： 黄曲霉毒素B1   人工抗原   抗体   胶体金   试纸条  

摘要： 黄曲霉毒素B1广泛存在于粮食作物和饲料中，是迄今为止发现的最强的致癌物质之一，其毒性要远远高于氰化物、有机农药等，严重威胁了人类和动物的生命安全。目前黄曲霉毒素B1检测方法大多依靠液相色谱等昂贵的仪器来进行，不利于现场检测，而且需要专业的检测人员来操作仪器，花费时间久且检测费用高。因此，研究出适合现场检测且时间短、费用低的检测方法具有重要的意义。 黄曲霉毒素B1属于小分子化学物，不能采用直接免疫动物的方法来获取多克隆抗体。抗原合成首先利用羧甲基羟胺半盐酸盐进行黄曲霉毒素B1的改造，使其在碳三位置连接上羧基。2mg AFB1于2mL吡啶甲醇（V/V1:3）溶液中直接在室温下进行反应，生成肟化物AFB1-O，利用薄层层析、紫外扫描和质谱进行AFB1-O的鉴定，得到其紫外吸收峰为209、220、264、360nm，AFB1的利用率为85.7%。AFB1-O在EDC或者DCC的作用下与牛血清白蛋白、鸡蛋清白蛋白进行偶联，得到免疫原AFB1-O-BSA和包被原AFB1-O-OVA。 利用免疫原AFB1-O-BSA免疫小鼠，得到多抗血清，利用辛酸-硫酸铵盐析及透析法进行纯化，纯化后血清经过SDS-PAGE电泳显示为2条带。采用间接ELISA方法测定血清效价，6只小鼠的效价均在6000以上，其中3号小鼠的效价为10000以上，抗体浓度为1.37mg/mL，IC-ELISA标准曲线为y=-43.50x+99.37(R2=0.988)，IC50为12.59ng/mL。 以柠檬酸钠还原氯金酸来制备胶体金。以反应时间、反应pH、转速进行50mL0.01%氯金酸中加入1%柠檬酸钠2mL进行正交实验，得出最优反应条件为不加入酸碱物质，转速为100r/min，沸腾后反应10min条件下制备出来的胶体金良好，电镜下观察粒子平均直径为14.6nm，紫外吸收峰为518.5nm。通过计算得到粒子浓度为6.8×1010个/cm3，摩尔浓度为1.13×10-10mol/L，每个胶体金粒子中含有9.64×105个金原子，其胶体金临界絮凝浓度为0.8g/mL。 试纸条主要由样品垫、金标垫、NC膜和吸水纸等组成。利用目测法和光电比色法确定了最适抗体标记量和最适pH，稳定1mL胶体金最适抗体稳定量为55.2μg，1mL胶体金中加入12μL浓度为0.1mol/L碳酸钾时为最适pH。制备好的金标探针进行可见光扫描，其吸收峰为528.5nm。采用浸金法制备金标垫，检测线划上浓度为1mg/mLAFB1-O-OVA，质控线划上浓度为1.2mg/mL羊抗鼠二抗。组装试纸条后经过测定，得到组装后的试纸条的灵敏度为150ng/mL。

关键词： 慢性萎缩性胃炎   中药   疗效   系统评价   Meta分析  

摘要： 目的：评价中药制剂治疗慢性萎缩性胃炎有效性及安全性。方法：按照系统评价方法,检索成都中医药大学网上图书馆提供的维普中文科技期刊数据库(VIP)；万方数据库；清华同方CNKI系列数据库中的中国知识资源总库；西文生物医学期刊数据库及Cochrane Library临床试验数据库。并手工检索了部分中文核心期刊,运用百度、google搜索引擎,医学论坛等查找相关参考-文献。时间限制在2013年以前。制定纳入及排除标准筛选文献,对符合的文献按照相关的质量评价标准进行评价,提取数据,用RevMan5.2软件对数据进行Meta分析。 结果：共纳入17个研究,1549例慢性萎缩性胃炎患者,研究方法学质量均较低下。Meta分析的结果显示：较之对照组,治疗组显示了更好的临床总疗效[RR=1.30,95%CI(1.20,1.41),P<0.00001],能更好改善CAG患者的总体症状体征[RR=1.14,95%CI[1.02,1.27],p<0.02]、胃脘胀满[MD=0.92,95%CI[0.57,1.26], p<0.00001]、胃痛[MD=0.59,95%CI[0.36,0.82],p<0.00001]、食欲减退[MD=0.61,95%CI[0.24,0.99],p=0.001]、暖气症状[MD=0.40,95%CI[0.11,0.69],p=0.006],改善患者胃镜表现[RR=1.79,95%CI(1.27,2.53),P=0.0009]及病理总体情况[RR=2.16,95%CI(1.67,2.79),P<0.00001]、粘膜萎缩[RR=1.68,95%CI(1.44,1.96),P<0.00001]、肠上皮化生[RR=4.68,95%CI(2.24,9.78),P<0.0001]、异型增生情况[RR=2.46,95%CI(1.34,4.51),P=0.004]。对HP感染阳性的CAG患者,两组根除HP疗效无统计学差异。13个研究进行了不良反应的观察,其中4个研究观察到发生不良反应,主要有过敏、头晕、恶心、口干、口腔溃疡、舌边尖糜烂、失眠、皮疹、荨麻疹、大便稀溏及其他消化道症状,经比较组间无统计学差异。 结论：此次研究提示在一般治疗基础上使用中药制剂治疗慢性萎缩性胃炎较使用西药在症状体征、胃镜表现及病理改善方面更能提高其疗效,临床综合疗效更高；根治HP方面与西药疗效无明显差异。但因纳入研究的质量均较低下,存在讨论中所提及的各种不足与问题,因而根据现有证据尚且不能充分证明中药制剂治疗慢性萎缩性胃炎的疗效及其安全性。故对以上结果应持谨慎态度。因此有必要进行高质量的临床随机对照试验予以证实。

关键词： 中药制剂   新一代测序   生物成分   HPLC指纹图谱   化学成分  

摘要： 中药制剂是在中医理论指导下，按照“君臣佐使”的组方原则，选择适宜的药味和剂量，制成随时可以取用的现成药品。目前，我国中药制剂并不被欧美国家所认可，主要原因之一在于其质量评价体系不完善。建立科学、合理的中药制剂质量评价体系是实现中药现代化、产业化和国际化的关键之一。中药制剂传统质量评价方法(显微鉴别，TLC鉴别和HPLC含量测定等)的局限性在于难以区分形状相似的近缘物种及含有相同主要化学成分的物种，不能检测制剂中的未知生物成分，这些瓶颈制约着中药制剂走向国际化。基于新一代高通量测序技术的元基因组研究方法是目前认识、分析生物混合体系结构和功能最有效、最重要的方法之一。本课题选择六味地黄丸作为研究对象，尝试将高通量元基因组研究思路与技术应用于中药制剂研究中，即对中药制剂的全部生物成分进行定性分析，然后结合传统HPLC评价方法，以期建立一种全面、准确、有效的中药制剂质量评价新方法。 目的：使用新一代测序技术以及高效液相色谱指纹图谱技术对不同厂家、不同批次的六味地黄丸样品进行质量评价。 方法：采用新一代测序技术对六味地黄丸样品中的处方物种和杂质物种进行鉴定，以转录间隔区ITS2基因和质体trnL基因的p-loop区作为分子标记片段，对9个市售样品和一个自制样品进行扩增和测序，共得到了90,000多条高质量的序列。此外，通过HPLC指纹图谱技术对不同六味地黄丸样品的化学组成进行了分析和比较。 结果：基于新一代测序技术的方法，确定了六味地黄丸中的部分处方物种成分以及杂质成分，并发现不同厂家的六味地黄丸的质量存在差异；HPLC指纹图谱的结果进一步表明，不同厂家六味地黄丸样品的一致性有一定的区别，两种方法的质量评价结果一致。 结论：新一代测序方法可以有效的鉴定六味地黄丸中的生物成分。中药制剂的质量评价应既包含化学成分的分析，又包括物种成分的鉴定。因此，将基于新一代高通量测序技术的物种成分鉴定法与化学成分分析法相结合，将进一步提高中药制剂成分分析和质量评价的准确性。