关键词： 核酸适配体传感器   置换型荧光探针   硫磺素T   赭曲霉毒素A   黄曲霉毒素B1   腺苷  

摘要： 利用硫磺素T(ThT)作为置换型荧光探针，分别构建了3种核酸适配体生物传感器，用于赭曲霉毒素A(OTA)、黄曲霉毒素B1(AFB1)和腺苷(Adenosine)3种生物小分子的快速检测。当靶标分子不存在时，ThT与核酸适配体结合形成复合物，具有较强的荧光响应；加入靶标分子后，ThT的荧光强度减弱，通过监测荧光信号的变化实现对靶标分子的定量检测。详细探究了检测机理，圆二色光谱分析结果表明，加入ThT和靶标分子后，核酸适配体的构象没有明显变化，只是此构象比例增加，因此系统的荧光强度的降低并非由于靶标诱导核酸适配体结构变化，而是因为分子置换作用所致；通过等摩尔连续变化法测定ThT与OTA、AFB1、腺苷的核酸适配体的化学计量比分别为1∶1、1∶1和2∶1，并且解离常数均大于靶标分子与核酸适配体的解离常数。因此，本方法的检测原理是靶标分子置换与核酸适配体结合的荧光探针(ThT)，通过测定被靶标分子置换出的ThT荧光强度的变化实现对靶标分子的定量检测。在最优实验条件下，3种小分子的检出限分别为0.8 nmol/L (OTA)、1.3 nmol/L (AFB1)和0.1μmol/L (腺苷)。本方法无需标记、操作简单、检测成本低，具有良好的选择性和较低的检出限。进一步开发了基于本方法的检测试剂盒，可用于实际样品中3种生物小分子的检测。

关键词： 食品检测   黄曲霉毒素B1   生物传感器   核酸适配体  

摘要： 黄曲霉毒素B1（Aflatoxins B1，AFB1）是一类由黄曲霉和寄生曲霉所产生的真菌毒素，广泛存在于农作物与食品介质中。AFB1毒性极强，低浓度的这种物质就可导致人体健康的严重损害。因此，对这种毒素进行高灵敏监测，是保障食品安全的重要前提。目前，AFB1的主流分析手段是仪器检测，但这类方法有前处理繁琐、仪器昂贵、分析时间长等不足。与此相对，生物传感器具有简单快速、灵敏度高、成本低等优势。基于此，本研究利用特异性高、亲和力好的适配体作为识别分子，引入核酸功能材料、球形核酸酶（SNAzymes）等生物元件，借助杂交链式反应（Hybridization chain reaction，HCR）等信号放大策略，实现对 AFB1 快速、灵敏、准确识别。具体研究内容如下：　　（1）以 DNA立方纳米结构（DNA cube nanostructure, DCN）为框架，以适配体为生物识别分子，设计了一种 AFB1 的新型生物传感器。本研究将适配体和 G-四链体DNA 酶（G4 DNAzyme, G4）封装在 DCN 内，利用 DCN 的限域效应分别提高了适配体的识别能力及G4的催化效能;此外，在传感过程中，通过封闭G4部分序列阻止其形成G4结构，有效地避免了假阳性信号的产生，提高了方法的准确性。在最优条件下，所构建传感器的检测限可达 0.23 ng/mL，检测范围为 0.01-100 ng/mL。本方法的框架核酸易于设计和制备，其可编程性和可预测性为构建尺寸选择性传感器提供了一个简单可靠的平台。　　（2）在上述工作中，尽管框架核酸能增强 G4 的催化活性，但所构建传感器的灵敏度仍不能满足复杂介质中痕量AFB1的检测要求。为此，本研究引入HCR用于信号放大，利用SNAzymes作为信号分子的载体，设计了一种新型DNA适配体生物传感器。其中，金纳米颗粒核（AuNPs）和DNA壳制成的常规SNAzymes通过Au-S共价连接。而HCR被用来提升负载酶（G4）的数量，并通过均匀分布的催化空间以增强其催化能力，从而极大地改善了方法的灵敏度。而且，本研究将 G4序列作为 HCR的信号分子，其在发夹上的修饰位置显著影响 HCR的杂交活性。当 G4序列在发夹茎区的分裂比为4∶0时，DNA发夹非粘性末端的修饰可使其杂交效率得到有效提升，从而减少了空间位阻，提升了酶的催化效能。以此构建的生物传感器在最佳的条件下，其检出限可达0.08 ng/mL，线性范围为 0.01-1000 ng/mL。该方法准确性较高（回收率，96.5%-107.4%），与商业化AFB1酶联免疫试剂盒的检测结果高度相符。　　（3）为了进一步实现G4在AuNPs上的紧凑有序组装，克服DNA探针倒伏现象，本章以适配体为识别元件，构建了一种可调节 SNAzymes 催化能力的生物传感器用于检测谷物中的AFB1。本研究利用适配体和链置换反应分别进行目标物的识别与信号放大，以独特的二嵌段聚腺嘌呤核酸单链（PolyA）作为衔接元件实现靶标的特异性捕获，从而达到对 SNAzymes 表面的空间进行调控等多种目的。以此构建了新型适配体生物传感器，该方法通过调节 PolyA长度精确控制 SNAzymes探针空间构型，实现了探针在 SNAzymes 的表面的可控性分布。经优化聚腺嘌呤的长度和反应条件后，该方法在0.01-1000 ng/mL范围内具有良好的线性关系，检测限为 0.083 ng/mL，对谷物的回收率在 94.3%-103.4%范围内。该方法所用的 PolyA DNA 探针相较于传统的 Au-S，无需特别修饰，仅依靠PolyA嵌段与AuNPs的相互作用就实现捕获探针在AuNPs表面的紧凑有序组装，实现了识别和探针固定功能的一体化。

关键词： 黄曲霉毒素B1   饲料类芽孢杆菌E1   微生物降解   玉米酒精糟   发酵  

摘要： 黄曲霉毒素（Aflatoxins,AFs）主要是由黄曲霉菌（Aspergillus flavus）和寄生曲霉菌（Aspergillus parasiticus）代谢产生的一类小分子化合物,其中黄曲霉毒素B1（AFB1）是毒性最强的,被国际癌症研究机构列为Ⅰ级致癌物,其含量约占总黄曲霉毒素污染总量的70%以上,联合国粮食及农业组织报告指出食品和饲料中的AFB1污染每年在全球范围内造成巨大的经济损失且逐年加剧。传统的辐射和高温加热等物理方法消耗大量能源,而臭氧处理等化学方法严重破坏食品和饲料中的营养成分,因此本研究拟采用微生物法降解AFB1。根据黄曲霉生长环境特点以及可能存在于畜禽肠道中降解AFB1微生物,本研究从多种来源样本中筛选得到一株可以降解AFB1菌株,并对其降解酶和AFB1降解产物进行表征;探究了菌株生物安全性以及评估了其固态发酵DDGS降解AFB1效果,为其推广应用提供理论指导和实践基础。主要研究结果如下: （1）从不同来源的样品筛选到一株可以降解AFB1饲料类芽孢杆菌E1（Paenibacillus pabuli E1）。该菌株温度耐受范围为26-47℃,pH耐受范围为6.0-9.0,盐度耐受范围0-4%,*** E1发酵上清液存在AFB1降解蛋白,经鉴定为N-酰基高丝氨酸内酯酶。3种主要AFB1降解产物被检测到,推测其降解过程为AFB1主体结构香豆素环酯键首先被水解,其次侧链戊烯酮环结构被破坏,最后呋喃环-8,9-双键被降解。 （2）*** E1全基因组长度为7,601,165 bp,是一条单一环状染色体,不含任何质粒,其GC含量为47.34%。*** E1基因组共预测6,966个功能基因,其中包含大量与AFB1降解密切相关的氧化还原酶;*** E1基因组中预测到372个碳水化合物活性酶,其中98个与非淀粉多糖降解直接相关。 （3）从基因组、代谢物和小鼠实验三个层次,探究了*** E1菌株安全性。*** E1基因组未发现毒力基因和运输毒素的分泌蛋白或转运系统;*** E1不含有耐药基因并对常见抗生素全部敏感;*** E1基因组无法诱导出活性噬菌体。*** E1代谢产物分析显示在降解AFB1过程中无其它有害物质产生。小鼠实验证明饲喂*** E1有助于小鼠采食,对小鼠肠道结构和功能无影响;饲喂*** E1有助于降低小鼠血液中的MDA含量,显著提高小鼠血液CAT、SOD和GSH-Px酶活性。*** E1可以改变小鼠肠道菌群多样性并不易消失,显著提高厚壁菌门（Firmicutes）比例,对肠道原位优势菌群拟杆菌门（Bacteroidetes）无影响。 （4）通过单因素和响应面优化实验,*** E1固态发酵DDGS降解AFB1最佳条件为:发酵时间为8.3 d,温度为28.9℃,料水比为0.68,接种量为10%（6.8×10～7CFU/g）,此时AFB1降解率可达62.24%。*** E1对DDGS半纤维素降解率为11.86%、纤维素降解率为11.53%、木质素降解率为8.78%;发酵结束后DDGS中粗蛋白含量由26.59%提高到30.59%。*** E1内切葡聚糖酶活性达到5.37 U/mL,β-葡萄糖苷酶活性为4.60 U/mL;木聚糖酶和β-木糖苷酶分别为11.05 U/mL和4.16 U/mL;果胶酸裂解酶和果胶裂解酶活性分别为8.19 U/mL和2.43 U/mL;*** E1的漆酶活性为1.87 U/mL,Mn P的活性为和4.30 U/mL。 综上所述,本研究确定*** E1是一株能够降解AFB1的安全菌株,为*** E1在消除饲料或食品中AFB1污染提供了理论依据和应用基础。

关键词： 染料脱色过氧化物酶   黄曲霉毒素B1   玉米赤霉烯酮   脱氧雪腐镰刀菌烯醇   脱毒  

摘要： 真菌毒素是由真菌产生的次级代谢产物,存在于谷类作物和饲料中,是危害饲料和食品质量安全的重要因素;因此,迫切需要一种绿色有效的脱毒策略来解决真菌毒素的污染问题。木质素降解酶是一类可以降解真菌毒素的酶,但木质素降解酶对真菌毒素的脱毒机理尚不清楚。本研究对不同家族来源的染料脱色过氧化物酶进行高效重组表达,并对其降解主要真菌毒素的能力进行评价,鉴定主要真菌毒素的降解产物,阐明真菌毒素降解产物的生物学毒性效果,主要结论如下: 首先,本研究借助于分子伴侣共表达系统在大肠杆菌宿主中实现了对来源于I、P和V类染料脱色过氧化物酶的高效重组表达。通过对染料脱色过氧化物酶的生化特性表征发现,不同家族的染料脱色过氧化物酶可以氧化模式底物ABTS、酚类化合物DMP和GUA,Mn2+、蒽醌染料RB19,并表现出类锰过氧化物酶的催化特性。 其次,染料脱色过氧化物酶在介体存在时能实现对黄曲霉毒素B1（AFB1）、玉米赤霉烯酮（ZEN）和呕吐毒素（DON）的高效降解能力。Mn2+存在时,染料脱色过氧化物酶对三种真菌毒素的降解率在48 h时在60%以上;1-HBT存在时,染料脱色过氧化物酶对ZEN的降解率在48 h达到70%以上。 然后,利用液质联用技术解析了不同家族染料脱色过氧化物酶降解主要真菌毒素的产物。不同家族染料脱色过氧化物酶对AFB1的降解途径主要为C3羟基化作用,以及C8-9双键的氧化和水解作用,对ZEN的降解途径主要包括羟基化、水解和开环作用,对DON的降解途径主要为羟基化和苯环双键的开环作用。 最后,不同家族的染料脱色过氧化物酶对AFB1、ZEN和DON的降解产物的生物学毒性显著降低。染料脱色过氧化物酶对AFB1的降解产物的细胞存活率提高15%以上,ZEN降解产物的细胞存活率提高25%以上,BsDyP和BaDyP对DON的降解产物的细胞存活率分别提高26.36%和28.78%。 综上所述,在本研究中,不同家族来源的染料脱色过氧化物酶在介体Mn2+和1-HBT存在时可以显著提高其对真菌毒素AFB1、ZEN、DON的降解能力,并且,AFB1、ZEN、DON的降解产物生物学毒性显著降低,为饲料中真菌毒素的脱毒提供技术支持。

关键词： 多功能过氧化物酶   理性设计   霉菌毒素降解   黄曲霉毒素B1   玉米赤酶烯酮  

摘要： 霉菌毒素作为霉菌在生长过程中产生的次级代谢物,对人类和动物的健康构成了不容忽视的威胁。为了有效应对这一威胁,科研人员积极探索多种脱毒方法,其中,酶法脱毒因其环境友好的特性而受到广泛关注。然而,当前已有的霉菌毒素降解酶在应对多种霉菌毒素污染时,其脱毒效果并未达到预期的水平。鉴于此,本研究选取了四种不同来源的多功能过氧化物酶并成功实现了这些酶在毕赤酵母中的高效表达。选取了其中表达量最可观的一条酶基因进行理性设计以提高其表达量、酶学性质等,旨在实现对霉菌毒素的高效降解,具体研究过程与结果如下所述: 本研究成功实现已经报道并成功实现异源表达具有酶活的四种不同来源多功能过氧化物酶在毕赤酵母中表达并通过摇瓶发酵筛选出表达量最好的Pleurotus sapidus来源的Ple进行理性设计。 基于Ple的蛋白质结构进行精确设计,完成了Y69F、L71I、R75D三个单点突变,成功使突变体Ple-gold展示出更好的催化能力及酶活性质,研究表明:突变体Ple-gold酶活达到2.981×10～4U/L,与野生型酶活相比提高了207.31%;酶学性质方面,野生型和突变体的最适反应p H均为4,最适反应温度均为37℃,而在热稳定性方面,野生型Ple在55℃条件下明显失活,而突变体Ple-gold在65℃下仍有4.8%的残余活性,p H稳定性方面,突变体Ple-gold在p H 2～11范围内孵育30 min,残余活性均在47%以上。总的来说,突变体Ple-gold的酶活、酶学性质相较野生型得到显著提升,符合理性设计的预期。 在应用方面,研究了野生型与突变体对黄曲霉毒素B1和玉米赤酶烯酮的降解,通过HPLC分析,突变体Ple-gold可做到对黄曲霉毒素B1的完全降解,对玉米赤酶烯酮降解率达到37.68%。经LC-MS分析,突变体Ple-gold成功将黄曲霉毒素B1、玉米赤酶烯酮降解为低毒产物。同时研究了多功能过氧化物酶对靛蓝的脱色能力,结果突变体Ple-gold实现对靛蓝的完全脱色,这也为多功能过氧化物酶不仅在霉菌毒素脱毒方面且在工业中的广泛应用提供了重要参考。 为进一步提高突变体酶的表达量,本研究成功构建突变体Ple-gold的二拷贝菌株,测定出二拷贝菌株的酶活为3.639×10～4U/L,较单拷贝酶活提高了22.07%。对二拷贝菌株进行高密度发酵,上罐发酵至110 h时,纯化后的酶上清液酶活达到1.273×10～5U/L,即成功通过多拷贝菌株的构建提高酶的表达量,为多功能过氧化物酶的产业化及工业应用奠定了基础。

摘要： 何为中药制剂？何为中药制剂？这是一些患者不明白的问题，在他们看来，中药就是中药，主要指汤剂。西药就是各种片剂或是胶囊剂，还有一些冲剂。站在医学角度上分析，中药制剂其实是将中医药理论作为指导，有效传承传统中药制剂方法，但又应用现代科学理论技术制作而成的药物。这一类药物其实是人们预防、治疗疾病的常用物质，是否准确应用药物，直接影响用药者的身体健康。

关键词： AFB1   适体传感器   纳米酶   信号放大技术  

摘要： 真菌毒素是一类高毒性次生代谢产物,严重威胁着人类健康。其中,黄曲霉毒素B1（AFB1）是污染食品中最常见、毒性最大的真菌毒素之一。因其具有高稳定、易积累的特性,建立高灵敏、特异性的AFB1检测方法对于确保食品安全至关重要。基于此,本论文设计并合成了多种类型的纳米酶,结合核酸信号放大策略,从而构建了一系列高灵敏适体传感器用于AFB1的灵敏、快速检测。主要工作如下: （1）合成了具有独特团聚特性和过氧化物酶活性的Hemin-石墨烯（H-GNs）复合材料,结合滚环扩增（RCA）辅助信号放大策略,设计、构建了一种简单、无标记的比色适体传感器用于快速、灵敏检测食品样品中的AFB1。在0.5 M Na Cl溶液中,H-GNs出现团聚现象,但当AFB1靶标存在时,适体与靶标结合,释放出的c DNA,引发RCA扩增反应。扩增产生的高分子量的长单链DNA（ss DNA）带有的负电荷增加,使H-GNs之间的斥力变大,提高了其抗盐能力,H-GNs的分散性变好。其上层清液在H2O2存在下,可催化过氧化氢酶底物TMB生成蓝色的氧化产物ox TMB,发生显色反应,可依据体系显色后溶液颜色的深浅对AFB1的存在进行初判,根据在652 nm处的紫外-可见吸收信号进行定量检测。在最佳条件下,所构建的AFB1比色适体传感器具有较宽的检测范围（0.125 ng/m L～62.5ng/m L）和较低的检出限（0.08 ng/m L）,可满足食品现场快速检测的需要。 （2）利用级联锚定策略将单原子铂锚定在MOF衍生多孔碳（p NC）纳米材料上合成了单原子铂纳米酶(（Pt-p NC SANs）。该纳米酶具有原子级分散金属活性位点,可最大限度地利用金属原子,同时MOF衍生的碳材料丰富的孔结构,可以富集更多的反应底物,因此,该纳米酶具有较高的催化效率和良好的成本效益。随后,我们基于Pt-p NC SANs优越的模拟酶活性,结合杂交链式扩增反应(（HCR）,构建了用于AFB1检测的比色适体传感器。当样品中存在AFB1时,AFB1适体特异性识别靶标,末端带有Pt-p NC SANs的HCR扩增产物在靶标的竞争下从磁球上脱落,游离至上清中。经过磁分离后,将上清液加入TMB-H2O2体系进行反应,在Pt-p NC SANs的催化下,TMB被H2O2氧化生成蓝色ox TMB,可通过观察溶液颜色变化对AFB1的存在进行初判,通过测定ox TMB在652 nm处的紫外-可见吸收信号大小,实现AFB1的快速定量检测。在最佳条件下,比色适体传感器检测线性范围为1 pg/m L～10 ng/m L,检出限低至0.16 pg/m L,可实现AFB1的快速、灵敏比色分析。 （3）设计合成了Ag@Au IP6双功能纳米酶,并基于该纳米酶构建了一种比色/无标记SERS双模式适体传感器,用于食品中AFB1的超灵敏检测。当AFB1存在时,触发探针暴露并引发HCR扩增反应,导致碱性磷酸酶（ALP）的引入,从而介导了具有核壳结构的Ag@Au IP6纳米酶的自组装。该纳米酶同时具有过氧化物酶活性和表面增强拉曼散射（SERS）效应,在TMB-H2O2体系中可促进蓝色产物ox TMB的生成,并作为SERS基底显着增强ox TMB的拉曼信号。因此,本研究开发的双模式适体传感器无需修饰信号分子和更换材料或试剂即可实现SERS/比色检测。在现场检测中,视觉传感分析可以通过智能手机中的颜色辅助应用程序收集色度信号并将其转换为RGB值来实现。在最佳条件下,双模核酸适体传感器的检测限低至0.58 fg/m L,可满足AFB1现场快速、灵敏检测的需求。

关键词： 绵羊   黄曲霉毒素B1   球虫病   生殖毒性   肠道菌群  

摘要： 谷物和动物饲料在世界范围内经常受到霉菌毒素污染,黄曲霉毒素是最常见的霉菌毒素之一,摄入后影响机体各器官的功能,严重威胁着畜禽的健康。球虫病是一种绵羊常发的传染性寄生虫病,主要导致幼龄动物腹泻和生长迟缓,极大地限制了绵羊养殖业的发展。黄曲霉毒素B1(Aflatoxin B1,AFB1)暴露已被证明能够破坏动物生殖系统功能,然而,联合球虫感染对反刍动物生殖系统的损害尚未被关注。因此,本研究以绵羊为大型动物模型,探究AFB1和球虫联合通过肠道-血液-生殖轴对绵羊生殖系统的毒性作用。 随机挑选100只35日龄健康断奶母湖羊,灌服地克珠利溶液1 mg/kg,每日一次连续两天,驱除可能感染的球虫。用药后第11天对每只绵羊进行直肠采样并显微镜检测,连续检测3天。最终选取16只体重在8-12 kg无球虫感染的健康雌性湖羊,随机分为对照组(Con)、AFB1暴露组(AFB1)、球虫组(E.o)和联合处理组(AFB1+E.o)。Con组灌服等量DMSO和生理盐水。AFB1组灌服AFB1 60μg/kg。E.o组灌服2×10～4孢子化卵囊(仅第0天)。AFB1+E.o组灌服AFB1 60μg/kg+2×10～4个孢子化卵囊(仅第0天),连续处理14天。主要研究内容与结果如下: 研究一:AFB1和球虫联合对绵羊子宫损伤的作用 首先,绵羊的生长性能及卵囊数量和粪便形态分析结果证明AFB1和球虫模型的成功建立。绵羊子宫形态学和组织学结果显示,AFB1和球虫单独或联合作用导致子宫内膜上皮细胞紊乱、炎性细胞浸润和充血。荧光定量PCR(RT-q PCR)结果显示,与Con组相比,AFB1和球虫处理显著下调绵羊子宫组织中雌激素受体ERα(p=0.021)和ERβ(p=0.021),和抗炎因子IL-10(p=0.016)的mRNA表达水平,上调促炎因子IL-6(p=0.003)和TNF-α(p<0.001)mRNA表达水平。以上结果表明AFB1和球虫联合作用对生殖系统的毒性作用可能与子宫激素的改变和炎症的诱发有关。 研究二:AFB1和球虫联合对绵羊肠道健康的影响 通过对绵羊肠道组织病理学观察发现,AFB1和球虫联合诱导肠道屏障结构的损伤。绵羊粪便16S rRNA测序分析发现,AFB1和球虫处理导致肠道菌群紊乱,其中类杆菌属(Bacteroides)、经黏液真杆菌属(Blautia)、优杆菌属([Eubacterium])、弯曲杆菌属(Campylobacter)、副拟杆菌属(Parabacteroides)、刺骨鱼属菌(Epulopiscium)、琥珀酸弧菌属(Succinivibrio)和脱硫弧菌属(Desulfovibrio)存在显著的组间差异。粪便代谢组学分析显示,AFB1和球虫联合组绵羊粪便代谢物与Con组存在显著差异,并且筛选出的14个共有的差异代谢物与类杆菌属(Bacteroides)、优杆菌属([Eubacterium])、刺骨鱼菌属(Epulopiscium)和肠屏障指标Claudin1、Claudin4和Occludin呈现显著正相关,与经黏液真杆菌属(Blautia)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、副拟杆菌属(Parabacteroides)、琥珀酸弧菌属(Succinivibrio)、脱硫弧菌属(Desulfovibrio)和ZO-1呈现负相关。以上结果表明,AFB1和球虫联合可能是通过干扰肠道菌群组成及其代谢物引起绵羊肠道屏障功能障碍。 研究三:AFB1和球虫联合对绵羊血液指标的影响 为进一步阐明AFB1和球虫单独或联合诱导的子宫损伤与肠屏障受损之间的关联机制,首先采用ELISA方法检测血液中的炎症因子的表达水平。AFB1和球虫处理显著上调促炎因子IL-6、TNF-α的表达水平(all p<0.05)和LPS的表达水平(all p<0.05),显著下调抗炎因子IL-10(all p<0.05)的表达水平。同时显著增强血液中雌激素受体ERα和ERβ(all p<0.05)的表达水平。进一步通过广泛非靶向代谢组学检测血液中代谢产物的变化。根据|Log2FC|≥1和P<0.05选择差异表达的代谢物,Con vs AFB1组鉴定出402种差异代谢物,Con vs E.o组鉴定出978种差异代谢物,Con vs AFB1+E.o组鉴定出1211个差异代谢物,这些差异代谢物均主要富集在氨基酸代谢途径。将富集在氨基酸代谢途径中的10个代谢物与血液炎症因子及激素相关指标进行皮尔逊相关性分析,发现N-乙酰-L-苯丙氨酸与血液指标之间存在显著的相关性,这表明肠道菌群及其代谢紊乱是由AFB1和球虫作用引起循环中炎症和激素改变的主要原因,其中氨基酸代谢可能是一个主要的促成因素。 研究四:AFB1和球虫联合对绵羊子宫损伤的机制 通过绵羊子宫组织转录组分析

关键词： 比率电化学适配体传感器   黄曲霉毒素B1   光响应策略   金纳米粒子   水凝胶基质   激光诱导石墨烯电极  

摘要： 花生是我国重要的油料作物和经济作物，在保障农业发展与粮食安全方面具有重要作用。目前，黄曲霉毒素（AF）污染是影响我国花生产业发展的主要因素之一，其中尤以黄曲霉毒素B1 （ AFB1 ）毒性强、污染范围广，发展可实现花生“耕-种-管-收”全流程AFB1检测的方法利于从源头上监测AF污染问题。相比于依赖“现场采样-实验室检测”的AFB1分析技术，电化学法仪器简单、响应速度快且成本低，但由于农业环境多变、样本基质复杂等因素干扰分析结果、影响检测效率，发展精准、灵敏、便携的电化学传感器仍是AFB1电化学法检测的主要难题。针对以上问题，本论文发展了多种比率电化学适配体传感器的构筑方法，提出了基于光响应机制的传感器信号放大策略，构建了水凝胶基光响应比率电化学传感器，并进一步研制了便携式电化学传感装置，实现了AFB1的精准、灵敏、现场分析，为花生及其种植土壤中AFB1的污染监测提供了新的解决方案。本论文的主要研究内容和研究结果如下：　　（1）为了提高传感器的精准度，以二茂铁标记AFB1适配体（Fc-Apt）单信号电化学传感器为基础，引入比率策略，构建了比率电化学适配体传感器，探究了AFB1的连续重复响应机制。其中，Fc-Apt为识别元件与响应信号（IFc），硫堇还原氧化石墨烯（THI-rGO）复合材料为参比信号（ITHI），根据ITHI、IFc比值（ITHI/IFc）与AFB1浓度关系实现精准分析。同时，基于比率策略可同时消除外界环境因素对两个响应信号的干扰，实现了比率传感器对花生样品中AFB1浓度范围为0.01~100 ng/mL的连续重复检测，回收率在88.0%~104.0%之间，并成功用于14天霉变实验花生样品中AFB1的监测。检测结果与高效液相色谱-荧光检测法（HPLC-FL）（GB 5009.22-2016）所得结果一致，表明传感器的准确性良好。　　（ 2 ）为了实现传感器动态范围的调控，设计了基于亚甲基蓝标记茎环DNA （ MB-DNA）的双比率电化学适配体传感器，以茎环MB-DNA和线性Fc-Apt为响应探针（IMB， IFc），蒽醌还原氧化石墨烯（AQ-rGO）复合材料为参比探针（IAQ）。根据识别元件MB-DNA与Fc-Apt对AFB1的不同亲和力，实现了传感器在0.0001~500 ng/mL范围内对AFB1检测范围的调控。应用于花生样品中AFB1的检测，回收率在99.0%~111.7%之间。进一步，以引起电流IMB变化的AFB1固定浓度为传感器的阈值响应浓度，实现了传感器对7天霉变实验花生样品中AFB1的阴性/阳性判别分析。检测结果得到HPLC-FL验证。　　（ 3 ）为了提高AFB1检测的灵敏度，引入光响应策略，构建了基于金纳米粒子（ AuNPs ）调控MB光响应的比率电化学适配体传感器。以AuNPs与MB标记互补DNA （MB-cDNA）为光响应探针构筑电化学传感界面，组装Fc-Apt与MB-cDNA形成双链DNA结构，使MB远离AuNPs，从而抑制了光激发下MB与AuNPs之间的能量转移。当Fc-Apt与AFB1识别后，Fc-Apt-AFB1从传感界面剥离，IFc降低，同时，MB-cDNA在传感界面发生弯曲，MB与AuNPs的距离变近，受AuNPs 表面等离子体共振（SPR）效应的影响，IMB增大。将光响应传感器的灵敏度与黑暗条件下进行对比，光响应传感器的灵敏度提高了2.3倍，对AFB1的浓度响应范围为0.5~1000 ng/mL，检出限低至0.467 ng/mL，并成功用于花生与土壤样品中AFB1的灵敏检测，回收率在86.3%~106.0%之间，且检测结果与HPLC-FL所得结果一致。　　（4）为了提高激发光对传感界面的作用效率，引入单波长光响应策略，设计了基于单探针响应的比率电化学Janus生物传感界面。根据MB与AuNPs对不同激发光的响应能力不同，选择合适波长的光源。以532 nm激光为AuNPs的激发光、650 nm激光为MB的激发光，考察激发方向对传感界面响应电流的影响。当532 nm激光从传感界面正面激发，650 nm激光从背面激发时传感器的性能最佳。AFB1存在时，MB与电极表面的距离发生变化，引起响应信号I532 front和I650 back不同程度的降低，基于I532 front/I650 back与AFB1浓度关系，实现在AFB1浓度范围为0.0005~50 ng/mL的分析，检出限低至0.175 pg/mL，成功用于花生样品中AFB1的检测，回收率在92.0%~103.0%之间，超高效液相色谱-串联质谱法验证了Janus生物传感器的准确性良好。　　（5）为了提高传感器的便携性，引入具有空间限域功能的水凝胶基质作为适配体与AFB1的识别场所，利用365 nm紫外光固定水凝胶基质于电极表面，