关键词： AFB1   蜡样芽孢杆菌ATCC10987   C4   降解产物   真菌毒素  

摘要： 如今,全球粮食安全计划仍面临着许多挑战,其中一个问题在于真菌及其代谢产物对食品和饲料的污染,从而对动物和人类的健康造成严重的疾病与各类并发症。真菌毒素是由特定真菌产生的次生代谢产物,这些真菌在农作物与农产品中大量生长繁殖。这些代谢产物能够污染食物与饲料,从而对人类和动物的健康造成危害。大多数真菌毒素具有致癌、致畸和致突变性,而黄曲霉毒素是其中毒性最强的一种。出于上述原因,控制和减轻真菌毒素对不同生产水平的食品和饲料的污染是非常有必要的。 蜡样芽孢杆菌ATCC 10987（C4）是从山东省临沂市的土壤中分离得到的。通过给予最合适的时间、温度和p H的情况下,可有效降解黄曲霉毒素B1（AFB1）。在p H值为2、3、4、5、6、7、8、9和10时,C4对AFB1的降解率分别为2.4%、9%、10%、57.4%、87%、88.5%、81.8%、73%和42.1%。C4对AFB1的降解随着培养时间的延长而增加,72小时后降解率达到最高,达到84.1%。在28、37、45、55、60、70和80°C的温度下评估降解率,C4对AFB1的降解率分别为74.2%、85.8%、84.9%、90.8%、88.5%、76.4%和58.3%。降解的最佳温度为55°C。将C4加入不同浓度的AFB1（5、10、20、30、40和50μg/m L）中,降解率分别为84.4%、83.4%、81.3%、58.1%、48.5%和30.8%。 我们还评估了菌株的不同组分降解AFB1的能力,发现C4上清液、细胞悬浮液和细胞提取物的降解能力分别为85.2%、43.1%和36.8%。C4的上清液在降解中表现出更高的效率,表明负责AFB1降解的主要活性物质主要存在于上清液中。还研究了金属离子对C4降解AFB1能力的影响,发现往上清液中加入Mn2+和Cu2+都提高了AFB1的降解速率。除此之外,高温也不影响C4对AFB1的降解速率,表明负责降解的酶是耐热的。当用蛋白酶K、SDS和蛋白酶K+SDS分别处理时,发现C4上清液失去降解能力。 基于LC-MS/MS检测,C4对亲本AFB1的降解产物鉴定为黄曲霉毒素D1（AFD1）。与AFB1相比,降解产物AFD1具有更低的毒性。

关键词： 黄曲霉毒素B1   绵羊   睾丸   睾酮   氧化应激   瘤胃微生物  

摘要： 绵羊是人类最早驯化的畜种之一,特别是杜泊羊以其生长速度快、繁殖能力强、肉质蛋白含量高等为特征,在养殖业中广受欢迎。为满足市场对羊肉的高需求,肉羊的集约化、规模化养殖是目前肉羊生产的主要形式。然而,在规模化养殖过程中,饲料霉变问题一直困扰养殖业的发展,给全球畜牧业造成巨大的经济损失。黄曲霉毒素是霉变饲料中检出率最高、毒性最强的一类次级真菌代谢物,对禽类和哺乳动物均表现出严重的肝毒性、肾毒性和肠毒性。羊群繁殖力是肉羊生产的基础,而种公羊的配种能力对提高羊群生产力方面起着重要作用。瘤胃内存在大量不同种类的微生物,它是最早接触霉菌毒素暴露的器官。因此,本研究聚焦于黄曲霉毒素对绵羊睾丸功能和瘤胃微生物的毒性影响,对揭示霉菌毒素对绵羊生产和繁殖性能的危害具有重要意义和价值。试验将6月龄24只杜泊公羊随机分为对照组和黄曲霉毒素B1暴露组(AFB1组),AFB1组灌喂1 mg/kg溶于20毫升4%乙醇中的AFB1,对照组灌喂20毫升4%乙醇,每组12个重复,试验周期为24 h。 研究一:AFB1暴露对绵羊睾丸功能的影响 每组随机选取6只绵羊进行试验样品的采集,对睾丸组织病理学和睾丸功能相关基因进行检测。结果如下: (1)对照组绵羊未发现明显的睾丸组织病理变化,AFB1组观察到绵羊的睾丸组织细胞内空泡化、曲细精管直径减小和生精上皮萎缩变薄(p<0.05),这说明AFB1急性暴露造成绵羊睾丸组织结构的损伤。 (2)与对照组相比,AFB1组绵羊睾丸组织中AFB1残留量显著增加(p<0.05),睾酮含量呈升高趋势(p<0.05)。通过实时荧光定量PCR(q RT-PCR)检测结果显示AFB1组绵羊睾丸类固醇激素合成急性调控蛋白(STAR)和胆固醇侧链裂解酶(CYP11A1)的表达水平显著升高(p<0.05)。以上结果显示AFB1暴露引起绵羊睾丸组织中AFB1的残留,并造成睾酮合成功能基因异常表达。 研究二:AFB1暴露对绵羊睾丸组织损伤的原因分析 (1)与对照组相比,AFB1组绵羊血清还原型谷胱甘肽(GSH)浓度、过氧化氢酶(CAT)活性和还原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽(GSH/GSSG)比值均显著升高(p<0.05)。通过q RT-PCR分析发现AFB1组睾丸组织的抗氧化基因谷胱甘肽过氧化物酶-3(GPX-3)和促凋亡基因Bax的m RNA表达水平显著上调(p<0.05),同时细胞调亡基因半胱天冬酶-3(Caspase-3)和B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)的m RNA表达水平显著下降(p<0.05),表明AFB1急性暴露可引起绵羊睾丸发生氧化应激和凋亡损伤。 (2)运用Pearson相关性分析来探究睾酮合成功能与抗氧化指标的关系,发现3β-羟类固醇脱氢酶(3β-HSD)基因表达水平与超氧化物歧化酶(SOD)活性和睾丸中抗氧化基因GPX-3呈显著正相关(p<0.05)。相反,总抗氧化能力(T-AOC)和CYP11A1基因呈显著负相关(p<0.05),GSSG的浓度与17α-羟化酶(CYP17A1)基因呈负相关(p<0.05)。这些结果表明AFB1暴露绵羊睾酮合成功能异常可能与体内的抗氧化系统破环有关。 (3)Pearson相关性分析睾酮合成功能与凋亡相关基因的关系,发现Caspase-3与CYP11A1和CYP17A1基因表达水平呈显著负相关(p<0.05),3β-HSD与Bcl-2基因呈显著负相关,与Bax呈显著正相关(p<0.05),表明细胞凋亡过程参与AFB1暴露绵羊的睾酮合成功能。 研究三:AFB1暴露对绵羊瘤胃微生物菌群的影响 (1)利用16S r RNA基因测序技术分析AFB1对瘤胃微生物群落结构和组成的影响。结果显示,与对照组相比,AFB1组Chao1指数显著升高(p<0.05)和Simpson指数显著降低(p<0.05)。OTU分析显示大多数OTU在两组之间且共享(2861个OTU),对照组和AFB1组分别识别出4914和5903个独立的OTU,表明绵羊AFB1暴露通过影响瘤胃微生物的丰度和多样性引起瘤胃微生物群落结构发生改变。 (2)试验绵羊中,门水平丰度最高的依次是厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和变形菌门(Proteobacteria)。在门水平上,AFB1组绵羊瘤胃中厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)和TM7的丰度(分别为47.53%、0.77%和0.79%)显著低于对照组(p<0.05)。同时,AFB1组厚壁菌门/拟杆菌门(F/B)比率也显著降低(p<0.05)。在属水平上,AFB1组绵羊瘤胃中普雷沃特菌(Prevotella)、琥珀酸杆菌(Succiniclasticum)、丁酸弧菌(Butyrivibrio)、CF231

关键词： 旋转型纸芯片   核酸外切酶Ⅰ   G-四链体二聚体   DNA四面体   黄曲霉毒素B1  

摘要： 本研究利用DNA四面体（TDN）精准调控识别配体的取向和密度，结合核酸外切酶Ⅰ（ExoⅠ）对单链DNA的特异性切割活性，借助G-四链体（G4）二聚体对硫黄素T(ThT)的荧光增强作用，构建了旋转型纸芯片，用于快速高灵敏检测黄曲霉毒素B1(AFB1)。以含有G4二聚体与AFB1识别序列的单链DNA(G4二聚体探针)为识别探针，其中AFB1识别序列与TDN的延伸手臂链通过碱基互补配对形式结合。当AFB1不存在时，G4二聚体探针上的G4二聚体与ThT结合，体系呈现出较强的荧光信号；当AFB1存在时，AFB1与G4二聚体探针结合，使其脱离TDN。此时，ExoⅠ切割脱离的G4二聚体探针，释放出AFB1, AFB1能够再次与TDN上的G4二聚体探针结合，如此循环，使得TDN上的G4二聚体探针减少，导致体系剩余的G4二聚体减少，荧光强度降低。此旋转型纸芯片在AFB1浓度为0.0001～500 ng/mL范围内具有良好的线性关系，检出限为0.1 pg/mL。将本方法用于花生和红酒样品中AFB1的检测，回收率为85.2%～118.2%。本研究开发的的TDN/G4二聚体/ExoⅠ检测策略显著增强了体系的特异性和灵敏度。

关键词： 黄曲霉毒素B1   噬菌体展示技术   全合成纳米抗体库   优化   分子对接  

摘要： 真菌毒素是由不同真菌种类产生的次生代谢物,主要是曲霉、赤霉、镰刀菌和青霉。据联合国粮食及农业组织（FAO）报道,世界上25%的食物受到真菌毒素污染。然而,最近的一项研究表明,全世界60～80%的作物受到真菌毒素的感染,这一数字超过了粮农组织给出的数字。曲霉属包括4个亚属339种。曲霉产生的真菌毒素被称为黄曲霉毒素。黄曲霉毒素是由各种类型的曲霉,特别是黄曲霉和寄生曲霉产生的次生代谢物,具有较强致癌作用。目前已经分离鉴定出来的黄曲霉毒素及其衍生物有20多种,其中黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1,AFB1）的毒性作用最强,被世界卫生组织的国际癌症研究机构（ARC）划分为Ⅰ类致癌物质。为了避免AFB1的污染风险,几乎世界上所有的国家和地区都制定了AFB1的强制限量标准。为了避免受到黄曲霉毒素B1的污染,检测所有食物中AFB1的含量显得特别重要。当前有很多检测技术可应用于检测AFB1,主要包括理化分析方法和免疫学方法等。其中,免疫学方法由于其精确度高,特异性强,操作简便等优点被广泛地用来检测AFB1,但它需要高灵敏度和特异性的抗体。随着分子生命工程的持续发展,重组抗体特别是单链抗体（Single chain Fv antibody fragment,Sc Fv）由于其易于改造、批次间差异小、制备时间短和表达量高等优点成为研究板块。但是,单链抗体与其亲本单克隆抗体相比,亲和力较低此外稳定性较差,从而导致在应用上具有局限性。研究抗原抗体间的不同反应,阐明单链抗体亲和力的影响机制,可为在基因水平上改造单链抗体,进一步提高其亲和力提供理论指导。本研究通过全合成噬菌体展示库筛选制备黄曲霉毒素B的纳米抗体,进一步结合计算机辅助建模设计实现抗体优化,主要内容及实验结果如下:（1）基于噬菌体展示技术利用实验室前期建成的全合成抗体库筛选制备黄曲霉毒素B1抗体基因G5,在此基础上对其进行表达,以期获得大量与AFB1结合的单链抗体,随后通过创建表达载体,再将修饰表达载体转化至感受态细胞BL21（DE3）中,进行诱导后获得可翻译的蛋白即纳米抗体,用于生物活性的鉴定实验。ELISA检测分析G5对AFB1-BSA的结合率以及AFB1对G5结合的抑制率,综合分析抗体亲和力。结果表明,G5对AFB1-BSA的EC约为0.95μmol/LAFB1与抗体竞争结合AFB1-BSA的IC约为43μmol/L,亲和力较好。（2）考虑到G5可能存在亲和力不高、特异性不强的问题,提出了一种基于计算机引导的同源建模和分子对接的体外亲和力成熟方法来优化抗体,通过计算机辅助搜寻目标序列同源建模模板、再进行目标序列与同源模板的多重序列比对,同时对同源模型的构建和模型评估、优化,最终获得一个可靠的三维结构。从抗体-抗原复合结构上来看,根据该试验构建模型G5与AFB1的分子对接,进行相互作用力分析。对接结果按照复合物能量值排序,能量越低表明该结构越稳定。通过打分,最佳G5-AFB1复合物能量分值为-6.29 kcal/mol。G5-AFB1复合物结构选择单链抗体的互补决定区（Complementarity Determining Regions,CDRs）区进行分析,AFB1与纳米抗体结合的氨基酸残基位点为:TYR103、VAL102、ARG101、ILE51、THR52、THR58,并且AFB1与残基ARG101形成较稳定的氢键网络体系。其中氢键键长越短,作用力越强;同时还与残基TYR103、VAL102、ILE51、THR52、THR58形成了疏水作用。再通过Py Mol可视化分析复合物5A内的氨基酸残基,选择最合适的残基ARG101进行突变,突变为IEL101,利用重叠延伸（genesplicingbyoverlapextension PCR,SOE PCR）获得突变基因及其对应的蛋白G5-1,经目的蛋白经纯化后,EC50值为0.196μmol/L,亲和力提高了9倍;IC50值为10.27μmol/L,抑制率提高了4倍,证明优化目的达到。

关键词： 黄曲霉毒素B1   金属有机框架   纳米酶   可视化传感   花生  

摘要： 黄曲霉毒素是黄曲霉菌和寄生曲霉菌的次生代谢物,容易污染粮油类农产品及其制品。迄今已分离鉴定出20余种黄曲霉毒素,其中以黄曲霉毒素B1（AFB1）的分布最广、毒性最强、危害最大。AFB1是国际公认的三大致癌物之一,而且AFB1的化学性质异常稳定,即便经高温处理或紫外线长时间照射,其结构亦难被破坏;即使低剂量的AFB1摄入,也会因为长期累积而危害人类健康;因此,AFB1被世界各国列为重点监控的食源性污染物。花生（俗称长生果）,和黄豆一样被誉为“植物肉”,同时花生油也因含80%以上的不饱和脂肪酸,易于被人体消化吸收,成为世界范围主要的粮油类农产品。然而,花生是最易感染AFB1的农产品之一,因此发展可靠、快速、便捷的花生中AFB1的检测方法对确保食品安全,有效防控AFB1对人类的危害具有重要意义。 本论文围绕建立AFB1可靠、快速、便捷的检测方法这一主旨,通过调控金属有机框架（MOF）的组成和结构,设计制备了一系列具有高类过氧化物酶（Peroxidase-Like,PL）活性的纳米酶,并以对AFB1具有特异性识别能力的适配体为识别元件,构建了多种可视化检测AFB1的传感平台,并进一步检测了花生实际样品,检测结果的准确性得到了国标法（GB5009.22-2016）验证。主要研究内容如下: 1、受辣根过氧化物酶（HRP）催化中心中结合袋结构的启发,本章选择与HRP具有相同催化金属中心（Fe）、大孔隙的MOF材料—MIL-101（Fe）为模板,依次通过氨基配体改性、硝酸选择性刻蚀和氯金酸原位还原的调控制备策略,得到了具有PL活性的纳米酶MIL-101-金纳米粒子（MIL-Au NPs）。以H2O2和TMB为底物,酶促反应动力学实验表明,MIL-Au NPs的米氏常数比HRP更低,呈现出超越HRP的催化活性;这源于纳米酶MIL-Au NPs对底物的富集和活化能力的增强,以及Fe、Au双金属位点的活性叠加和协同增强的共同作用。以MIL-Au NPs为催化剂,AFB1适配体为识别元件,成功构建了一种AFB1适配体比色传感平台。利用AFB1能够使纳米酶催化的“TMB+H2O2”氧化变色体系颜色增强的现象,基于AFB1浓度在1～1000 ng/m L范围内与比色溶液在652 nm处的吸光度呈线性关系,实现了AFB1的比色检测。 2、为了实际测量的便捷性,自制了一套光学数据采集装置,使用智能手机采集和分析传感体系反应前后的RGB值;同时为了提升反应体系的灵敏度和检测范围,进一步引入光作为激发源,选择以光敏金属Ti为中心的MIL-125（Ti）作模板,依次通过氨基配体改性、配位掺Fe（Ⅲ）和氮气气氛煅烧处理,实现了光照条件下,PL催化性能的提升。以H2O2和TMB为底物,酶促反应动力学实验表明,所构建的纳米酶MIL-125（Ti/Fe）-1.0%-N2呈现出超越HRP的催化活性,其米氏常数更低;这源于调控策略拓宽了可见光吸收范围、降低了光生电子-空穴对重组率,以及建立了高导电性的电子传输通道。进一步以MIL-125（Ti/Fe）-1.0%-N2为催化剂,AFB1适配体为识别元件,成功构建了一种AFB1适配体比色传感平台。利用AFB1能够使纳米酶催化的“TMB+H2O2”氧化变色体系颜色增强的现象,基于AFB1浓度在1～1200 ng/m L范围内与采集的RGB值呈线性关系,实现了AFB1的可视化检测。 3、上一章研究表明,Fe位点是PL催化活性的来源,但光照条件下,MIL-125（Ti）中配位掺Fe（Ⅲ）过量,却会导致PL催化性能的降低。为了改善光照对纳米酶活性的影响,本章以MIL-101（Fe）为主体,在其外围生长具有光活性的MIL-125（Ti）,构建了MOF-on-MOF结构的MIL-125@MIL-101纳米酶,并将其在氮气氛围煅烧（产物记作MIL-125@MIL-101-N2）,进一步增强了光响应PL活性。实验结果证实,纳米酶的MOF-on-MOF结构,避免了因Fe（Ⅲ）配位过量,导致加速光生电子-空穴复合的缺点,纳米酶MIL-125@MIL-101-N2呈现出更宽的光吸收范围,和更强的光生电子能力;以该纳米酶为催化剂,羧基化的AFB1适配体为识别元件,二者通过酰胺键结合,成功构建了一种AFB1适配体比色传感平台。利用AFB1能够使纳米酶催化的“TMB+H2O2”氧化变色体系颜色减弱的现象,基于AFB1浓度在1～1380 ng/m L范围内与采集的RGB值呈线性关系,实现了AFB1的可视化检测。 4、为进一步提高AFB1检测准确性,本章选择了强活性中心的两种MOF材料（Cu-BTC/W纳米线和Ce-MOF纳米片）为组成单元,构建了三明治型强-强活性中心的双MOF纳米酶Cu-BTC/W@Ce-MOF,其PL催化性能优于前三个工作。实验结

关键词： 墨黑素   肠-肝轴损伤   信号通路   代谢通路   实验药理  

摘要： 黄曲霉毒素B1（Aflatoxin，AFB1）是日常生活中较为常见致癌性强的真菌毒素，广泛存在于自然环境和发霉的稻谷、花生、大豆等谷物粮食中，人和动物都不可避免的摄入被AFB1污染的食物。其毒性作用严重影响着机体的肝脏功能，并且也会不同程度地影响机体的肠道屏障功能，因此有必要评估一种活性物质对AFB1暴露的“肠-肝轴”毒性损伤的干预作用，了解其干预机制。来源于乌贼墨囊中的天然活性物质黑色素，简称墨黑素（Squid ink melanin，SIM）具有较好的抗氧化、抗肿瘤、促凝血和抗菌等特性，且化学性质稳定，生物利用度高。关于SIM生物特性的研究很多，但目前尚未有关于预防AFB1暴露致“肠-肝轴”损伤的研究报道。因此，探究SIM在AFB1亚急性下暴露造成小鼠“肠-肝轴”损伤的干预作用和机制变得尤为重要。　　本论文研究SIM对AFB1在亚急性条件下诱导肝、肠组织器官损伤的干预效果及功能特性的作用，并初探SIM的干预机制。本研究以C57雄性小鼠为实验对象，选择SIM建立AFB1暴露的干预模型，通过多组学结合的方法探究其“肠-肝轴”损伤的干预效果，了解SIM干预的信号通路和代谢通路的改善机制。具体方法及结果如下：　　（1）从表型层面探究连续14天口服灌胃750μg/kg AFB1，同时每天灌胃300 mg/kg（L-SIM）和900 mg/kg（H-SIM）墨黑素28天对小鼠肠、肝的影响。实验每14天解剖一批小鼠，共两批。通过分析实验期间的两批小鼠体重增长量和脏器系数、组织病理变化、血生化指标（AST、ALT、ALP、GGT）、抗氧化指标（SOD、CAT、GSH-Px、MDA）、促炎因子水平（TNF-α、IL-6、IL-β）、肠屏障功能（LPS、DAO）和肠道蛋白ZO-1的表达情况，来比较不同剂量和时间的SIM干预对AFB1诱导的肠道、肝脏损伤的改善效果。结果表明：与对照组（CON）相比，模型组（AFB1）血生化指标、促炎因子水平以及肠黏膜屏障功能指标均在第14天显著升高，但经过28天SIM的预处理发现有恢复到正常水平的趋势;同时抗氧化酶的活性在第14天下降到最低，经SIM28天的预处理提高了小鼠抗氧化酶活性， MDA含量无显著性差异变化;暴露于AFB1的回肠和肝脏组织病理学切片显示组织损伤严重，并且SIM的干预减轻了AFB1引起的组织损伤，以及增加了回肠黏膜ZO-1蛋白的活性，第28天的改善效果最佳。由此可知，SIM对AFB1诱导小鼠肠、肝损伤具有改善作用。　　（2）基于RNA-Seq技术探究高剂量墨黑素（HSIM）预处理对AFB1暴露肠道和肝脏的基因表达和信号通路的影响。通过分析测序数据，发现SIM预处理能够干预AFB1诱导小鼠肠道和肝脏引起的抗氧化基因（Nrf2、NQO1）和抗炎基因（TLR4、NF-κB）的相对表达量降低，以及降低小鼠肠道蛋白（Claudin-1、Occludin）的基因表达量。此外，SIM还可能参与影响TLR4-NF-κB通路，通过激活TLR4受体启动NF-κB下游基因的表达，提高机体自身的抗炎能力来缓解AFB1导致的细胞炎症反应。HSIM组的差异表达基因还显著富集在凋亡通路，参与AFB1诱导小鼠细胞的增殖分化和凋亡。氧化磷酸化通路可能是SIM作用机体调节的关键通路。　　（3）基于多组学技术研究高剂量墨黑素（HSIM）预处理对AFB1暴露肠道和肝脏的微生物菌群和代谢系统的影响。通过分析测序数据，发现SIM预处理能够干预AFB1诱导小鼠肠道引起的菌群紊乱，增加肠道物种丰富度，提高盲肠菌群的多样性和均匀度，并且重塑小鼠肠道菌群的组成，调节Firmicutes/Bacteroidota的比率，减少肠道中Muribaculaceae菌的相对丰度，上调Lachnospiraceae NK4A136 group属的丰度以调控肠道菌群。高剂量SIM的处理使小鼠血清很多代谢物发生了变化，HSIM组的差异代谢物主要富集在胆汁酸的生物合成代谢通路中，SIM的干预能调控小鼠肠道胆汁酸的代谢能力，缓解肠、肝损伤程度和减少代谢异常现象。　　综上所述，本研究构建了SIM干预AFB1亚急性暴露致肠、肝损伤的研究模型并对其干预机制进行初探，发现了SIM能有效缓解机体产生氧化应激、炎症反应以及减少菌群紊乱和代谢异常现象，并且与SIM的剂量和影响时间有关。本研究为墨黑素干预黄曲霉毒素暴露机体研究提供了重要的理论支持。

关键词： 纸芯片   电化学发光   双信号   黄曲霉毒素B1  

摘要： 黄曲霉毒素（AFs）是由多种霉菌,特别是曲霉,在一定的温度和湿度条件下形成的天然有毒的低分子量次生代谢物。其中黄曲霉毒素B1（AFB1）被国际组织列为Ⅰ级致癌物。许多食源性疾病大多是由黄曲霉毒素导致的,因此探索一种高效、简便、快速的现场检测方法对于在源头上有效预防食品污染具有重要意义。由于纸芯片便携、成本低等固有优势被研究人员认为是食品安全快检领域理想的分析装置。但食物样品基质复杂,导致纸芯片在检测时的可靠性和实用性受到质疑,而双信号独立输出的同时能够相互验证,保证了结果的准确性。基于此,越来越多的双信号纸芯片被构建用于食品中毒素的现场检测。电化学发光（ECL）是在一种通过施加电压产生激发态物质来控制光发射的技术,具有时间和空间可控、背景干扰小、响应迅速等优点。将电化学发光与比色集成到纸芯片上,利用比色信号实现目标物的预判,电化学发光超灵敏检测目标物,实现信号的优势互补。这种双信号纸芯片充分发挥了两种方法的优势,提高了检测的准确性和灵敏度。本论文制备了两种电化学发光纸芯片,分别结合刺激响应型分子门策略和磁分离策略建立了黄曲霉毒素B1的快检方法,主要分为以下两个部分: （1）比色/电化学发光双信号纸芯片超灵敏检测黄曲霉毒素B1 通过将图案化的纸基电极和铂纳米粒子（Pt NPs）处理的比色区域组装,制备了一种比色/电化学发光双信号纸芯片（DPC）。利用装载3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）分子的金属有机框架（Ui O-66-NH2,MOFs）和硫化镉量子点修饰的适配体链（Cd S QDs-Apta）组成刺激响应型纳米材料。当存在AFB1时,AFB1与适配体链特异性识别,触发响应型分子门打开,释放出装载的TMB分子,在DPC上实现了双信号的输出,该方法的检测限为7.8 fg/m L。对玉米样品进行加标回收实验,并与常用的高效液相色谱方法（HPLC）对比,结果无显著差异,表明所构建的双信号纸芯片具有一定的实用性,该装置为各种食品污染物的分析提供了理想的快速检测平台。 （2）距离读出/电化学发光双信号纸芯片快速检测黄曲霉毒素B1 将碳油墨电极与流动通道集成在聚氯乙烯（PVC）基板上构建了距离读出/电化学发光双信号纸芯片（d DPC）。利用羧基化磁球作为载体制备了S1/Fe3O4,然后将其与修饰有葡萄糖氧化物酶（GOx）和Au-luminol的适配体（GOx-Apt-Au-luminol）碱基互补配对,组成双链DNA。目标物AFB1存在时,形成AFB1-GOx-Apt-Au-luminol的复合物,经磁分离方法分离。以适配体上修饰的Au-luminol和GOx作为双信号标签,借助3,3'-二氨基联苯胺（DAB）氧化形成的棕色ploy（DAB）流动的距离作为信号输出,建立基于距离读出的方法对目标物可视化定量分析。同时,Au-luminol在过氧化氢（H2O2）作共反应试剂时产生电化学发光（ECL）信号,建立ECL方法精准检测AFB1。此分析装置无需大型仪器的参与,可在野外实现对目标物AFB1的快速预判和精准定量,拓宽了双信号纸芯片在农产品污染物检测中的应用前景。

关键词： 荧光生物传感器   制造工艺   银纳米簇   DNA模板   黄曲霉毒素B1   灵敏检测   早期筛查  

摘要： 黄曲霉毒素B1（AFB1）是I级致癌物，主要危害人和动物的肝脏、肾脏，具有强烈的致癌、致畸性和致突变性。因此，开发快速、低成本、简便的AFB1检测新方法，意义重大。近年来，基于DNA模板化银纳米簇（AgNCs-DNA）因其优异的荧光性质、良好的生物相容性、无需额外标记等特性，在荧光生物传感领域展现出巨大的应用潜力。本文以AgNCs-DNA为免标记荧光探针，核酸适配体（Apt）为分子识别元件，通过耦合荧光能量共振转移（FRET）、变色龙DNA序列和富G荧光增强子等多种策略，成功构建了一系列荧光生物传感器，实现了对AFB1的灵敏检测或早期筛查。具体研究内容如下：　　1、以设计的6条DNA链为模版，以AgNO3为前驱体，NaBH4为还原剂，一锅法制备了AgNCs-DNA免标记系列探针。比较六种DNA模板合成的AgNCs-DNA的荧光性质，选择荧光性质最优异的AgNCs-DNA为荧光探针与AFB1的Apt复合，以MoS2纳米片为淬灭剂，成功构建了组件式通用型FRET适配体传感器。采用透射电镜（TEM）、荧光光谱等多种手段，对所制备的AgNCs-DNA及传感器构建过程进行了表征。优化条件下，AFB1浓度与传感体系的荧光信号强度呈现良好的线性关系，线性回归方程为 I=2.68cAFB1+20.84 （R2=0.9981），线性区间为 0.03-120 ng/mL，检出限（LOD）为 3.63 pg/mL（S/N=3）。通过将传感器中的AFB1的Apt更换为赭曲霉毒素A（OTA）或赭曲霉毒素（ZEN）的Apt，成功实现了对OTA或ZEN的识别与检测，验证了该传感器的通用特性，为食品安全监测、环境污染物检测、生物医学诊断等领域提供了新的思路。　　2、以设计的DNA链为模版，AgNO3为前驱体，NaBH4为还原剂，一锅法合成了发射绿色荧光的AgNCs-DNA免标记探针。该探针利用模板上预留的杂化区域与设计的G7-Apt序列进行配对，形成独特的比率荧光传感体系。G7-Apt序列不仅含有Apt用于识别目标分子 AFB1，还包含富 G 碱基序列作为荧光增强子和转换子，能够将原本发射绿色荧光的AgNCs-DNA转换为发射红色荧光的AgNCs-DNA/G7-Apt探针。当目标物AFB1存在时，会与G7-Apt上的Apt部分结合，形成G7-Apt/AFB1复合物，导致G7-Apt与AgNCs-DNA分离，从而引起传感器中绿色荧光和红色荧光比值变化，基于此构建了一种新型比率荧光适配体传感器，用于AFB1灵敏检测。采用TEM、荧光光谱等多种手段，对所制备的AgNCs-DNA和传感器构建过程进行了表征。优化条件下，I560/I625与AFB1浓度之间呈现良好的线性关系，线性回归方程为 lg(I560/I625)=0.089+0.278lgcAFB1（R2=0.9973），线性区间为 0.005-400 ng/mL，LOD 低至 1.64 pg/mL（S/N=3）。同时，该比率荧光传感器在 30-400 ng/mL 的浓度范围内，表现出显著的裸眼可视化荧光颜色变化，为AFB1的现场直观检测提供了便利。所构建的比率荧光传感器仅使用了AgNCs作为单一荧光探针，无需借助其他荧光淬灭剂，从而简化了传感器的制备过程并显著降低了检测成本，具有广阔的应用前景。　　3、以设计的发夹DNA1（hDNA1）为模版，AgNO3为前驱体，NaBH4为还原剂，一锅法合成了弱荧光发射的AgNCs-hDNA1免标记探针。利用富G序列发夹DNA2（hDNA2）对AgNCs-hDNA1荧光信号的增强能力，借助催化发夹自组装（CHA）触发的DNA链置换循环机制，构建了一种用于检测AFB1生物合成关键基因alfD的“点亮型”荧光DNA传感器。在目标aflD基因（T-DNA）存在时，CHA过程被激活，AgNCs-hDNA1的茎环结构展开，导致其与T-DNA形成杂交双链（AgNCs-hDNA1/T-DNA）。随后，该杂交双链与hDNA2再次进行催化组装，将T-DNA从杂交双链中替换下来，形成AgNCs-hDNA1/hDNA2复合物。替换下的T-DNA进入新一轮CHA循环，从而实现信号放大。由于hDNA2的5’端是富含G碱基的，所以AgNCs-hDNA1/hDNA2形成的同时，AgNCs的荧光信号被增强，从而实现“点亮”效果。采用 TEM、荧光光谱等多种手段，对所制备的 AgNCs- hDNA1 和传感器构建过程进行了表征。优化条件下，传感体系的荧光强度与产毒基因aflD浓度之间呈现出良好的线性关系，线性回归方程为 I=167.76lgcaflD+459.19（R2=0.9941），LOD 为 1.73 pM （S/N=3）。该传感器为农产品AFB1污染的早期筛查提供了新的侦检工具。

关键词： 黄曲霉毒素B1   过氧化氢酶   异源表达   分子改造  

摘要： 黄曲霉毒素是一种由黄曲霉和寄生曲霉等真菌产生的小分子代谢产物,是一类结构相似的化合物,目前已经鉴定出超过20种不同的类型。其中,黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1,AFB1）的毒性最强,具有强烈的致癌、致畸和致突变作用,因此去除粮油食品中的AFB1尤为重要。AFB1的去除方法主要有物理法、化学法和生物法,与传统化学物理法降解黄曲霉毒素相比,生物法具有效率高、副作用小等优点。实验室前期研究表明过氧化氢酶具有降解AFB1的能力。为了使过氧化氢酶更好地满足工业生产和应用的需求,本论文在大肠杆菌中异源表达了索诺拉沙漠芽孢杆菌（Bacillus sonorensis）s262的过氧化氢酶基因,研究了重组酶的酶学性质及对AFB1的降解;并在大肠杆菌中对过氧化氢酶进行分子改造,选择酶活提高的正突变体进行酶学性质研究,AFB1降解的测定。主要研究成果包括: （1）优化过氧化氢酶基因的克隆及表达条件。成功克隆了菌株s262过氧化氢酶基因Kat A,其大小为1 458 bp。成功构建了质粒p ET28a-Kat A,并将其转入*** BL21（DE3）感受态细胞中,经过SDS-PAGE验证表达成功。重组过氧化氢酶分子量大小为58.4 k Da。对重组过氧化氢酶的表达条件进行优化,最适条件为:IPTG 0.8mmol/L,温度25℃,时间10 h。 （2）*** BL21重组过氧化氢酶的纯化及酶学性质研究。IPTG诱导表达后通过镍柱纯化获得重组过氧化氢酶,经过SDS-PAGE检测分子量大小为58.4 k Da,最适温度为50℃,50℃下测定其半衰期为2.5 h,最适反应p H为7.0。重组酶在p H 5.0-10.0的环境中处理1 h后,在p H 5.0-9.0范围内剩余酶活均达到40%以上。0.1mmol/L Fe2+、Zn2+和Cu2+可使酶活分别提高40%、8%和12%;K+对酶活抑制作用最强,可使酶活下降39%;Mg2+、Ca2+、Li+和Mn2+对酶活性也有抑制作用。Na+对酶活性的影响不大。其中通过双倒数作图法计算该酶动力学参数Vmax为（760.17±19.61）mmol/（min·L）,Km为（63.73±3.87）mmol/L。高效液相色谱法检测得出重组过氧化氢酶对AFB1降解率为61.44%,降解效果较好。 （3）对重组过氧化氢酶进行定点突变。根据各突变位点的结合自由能,选择结合自由能高的4个突变位点突变为8个菌株。根据突变位点设计特定引物,使用一步式PCR诱变试剂盒,对选定的位点进行突变。经测序后得到了突变成功8个菌株。其中突变体G394T过氧化氢酶活相比原始菌过氧化氢酶活提高34.14%。对突变体G394T过氧化氢酶进行纯化及SDS-PAGE检测,发现其分子量大小相较于原始菌有所下降。对其酶学性质进行测定,发现其热稳定性下降,耐碱性增强。金属离子对突变体过氧化氢酶的影响变弱。突变体G394T过氧化氢酶Vmax为421.94±72.46 mmol/（min·L）,相较于原始菌重组过氧化氢酶有所降低。突变体G394T过氧化氢酶Km为82.99±8.73mmol/L,是原始菌重组过氧化氢酶的1.3倍,说明酶与底物的结合能力减弱。通过对突变体G394T过氧化氢酶及原始菌过氧化氢酶降解AFB1的对比,降解48 h时突变体G394T过氧化氢酶的AFB1降解率为78.31%,是原始菌过氧化氢酶的1.27倍。