关键词：
黄曲霉毒素B1
酶联免疫吸附法
单链抗体
蛋白表达
摘要：
真菌毒素（mycotoxins）主要是由产毒的丝状真菌在具有一定温度和湿度的特定环境下产生的一类具有致癌、致畸、致突变作用的次级代谢产物,也是农产品的主要污染物之一,而黄曲霉毒素（aflatoxins,AFs）是其中的代表之一。AFs是一类次级代谢产物的总称,目前已分离鉴定出的AFs大概有12种,如AFB1、AFB2、AFG1、AFG2和AFM1等,其中致癌能力最强的是AFB1。AFs是主要是由曲霉菌产生的、对人和动物肝脏有剧毒,并有致畸、致癌和致突变作用的次级代谢产物,常见于霉变的粮食和粮食制品中,尤其是干果、花生、棉籽以及玉米等农产品。1993年AFB1被WHO的癌症研究机构划定为I类致癌物,如果长期摄入低剂量的或者一次性暴露大剂量的,均可导致人或动物急性中毒或肝脏发生癌变,如肝损伤、肝硬化和肝癌。鉴于此,世界上几乎所有的国家、地区都规定了AFB1在食品和饲料中的最大允许含量以最大限度地降低AFB1的暴露风险,因此,关于AFB1的检测分析方法应运而生。免疫学检测分析方法因其快速、灵敏等优点而被广泛应用于AFB1的检测。而高质量的抗体是免疫学分析方法所需的主要试剂。随着分子生物学技术的快速发展,基因工程抗体,尤其是单链抗体（single chain Fv fragment antibody,Sc Fv）,因其分子量小、免疫原低、易于制备、无Fc段引起的非特异性反应、易于改造且表达产量高而获得了研究学者们的广泛关注。近年来,关于抗AFB1Sc Fv的研究较多,但研究者多采用噬菌体展示技术和基因克隆技术筛选得到Sc Fv基因,并将其在不同的表达系统中表达。本课题以课题组已获得的能稳定分泌抗AFB1单克隆抗体的2株杂交瘤细胞株（2C10和2H1）为原材料,分别提取杂交瘤细胞的总RNA,设计通用引物,采用分子生物学技术分别克隆其重链可变区（heavy chain variable region,VH）和轻链可变区（light chain variable region,VL）基因,以一段连接肽（Linker）将VH和VL连接起来,组装成Sc Fv基因,然后分别在*** BL21（DE3）表达系统和毕赤酵母GS115表达系统中进行蛋白表达,比较不同表达系统中Sc Fv的生物活性的差别,选出较为适合Sc Fv表达的宿主菌。具体研究内容和结果如下:1 AFB1单链抗体（Sc Fv）的基因构建以课题组已获得的能稳定分泌抗AFB1单克隆抗体的2株杂交瘤细胞株2C10和2H1为原材料,经活化培养8天后,分别提取2株杂交瘤细胞株的总RNA,经反转录后获得2种c DNA,根据小鼠抗体基因的框架区保守结构设计通用引物,基因克隆分别得到2种不同的VH和2种不同的VL基因,采用生物信息学手段分析序列,确认其均为抗体可变区基因。采用重叠延伸PCR法（gene splicing by overlap extension PCR）将VH、连接肽（Gly4Ser）3和VL基因构建为Sc Fv基因（Sc Fv-VH-linker-VL-2C10和Sc Fv-VH-linker-VL-2H1）。2抗AFB1 Sc Fv在*** BL21（DE3）中的表达与特性分析将两种不同的Sc Fvs基因首先分别与质粒p ET-22b连接,在此基础上,再分别与质粒p ET-30a连接,并在*** BL21（DE3）中进行目的蛋白表达,纯化后的蛋白以紫外吸收法对其定量,以SDS-PAGE和ELISA对其进行性质研究。结果表明,两种不同的Sc Fv都可在*** BL21（DE3）中成功表达,并以有活性的可溶性蛋白的形式表达存在,两者产量没有太大区别,均约为340mg/L;ELISA对其性质进行分析结果表明,Sc Fv-VH-linker-VL-2C10检测AFB1的灵敏度约为40μg/m L,Sc Fv-VH-linker-VL-2H1检测AFB1的灵敏度大于50μg/m L。3抗AFB1 Sc Fv在毕赤酵母GS115中的表达及其性质分析由于原核表达体系的蛋白翻译后加工修饰体系不完善,抗AFB1 Sc Fv蛋白表达的生物活性低、产量低,而酵母表达系统稳定性好、表达产量高且成本低。所以本研究将Sc Fv-VH-linker-VL-2C10（2E6,2H1）基因分别与毕赤酵母质粒p PICZa A连接并转化到*** Trans5a,获得重组质粒p PICZa A-Sc Fv-VH-linker-VL-2C10（2E6,2H1）,然后电转毕赤酵母GS115宿主菌进行蛋白表达,纯化后的蛋白以紫外吸收法对其定量,以SDS-PAGE和ELISA分别对其性质分析。结果表明,三种不同的Sc Fv均可在GS115中成功表达,并都以有活性的可溶性蛋白的形式存在,三者蛋白产
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