关键词： 黄曲霉毒素   降解率   Bacillus subtilis Natto3   花生样品  

摘要： 黄曲霉毒素(Aflatoxin,简称AFT)是一类由真菌产生的次级代谢产物,具有很强的毒性和致癌性。黄曲霉毒素理化性质非常稳定,在食品加工过程中难以被破坏。与传统的物理和化学方法相比,生物法降解黄曲霉毒素具有反应条件温和、不造成产品的营养流失及不会有新的毒素产生等优点,因此越来越受到人们的重视。目前已经报道多种微生物对黄曲霉毒素具有较强的降解作用。本研究从容易被黄曲霉毒素污染的环境中筛选具有降解黄曲霉毒素B1(AFB1)能力的细菌菌株。以香豆素为唯一碳源从动物粪便、发酵食品、花生土壤及实验室保存的菌株中筛选出12株能高效降解AFB1的微生物菌株。经16s r DNA测序分析鉴定,12株菌均为芽孢杆菌属。用高效液相色谱法(HPLC)测定AFB1含量,从而计算得到AFB1降解率。37℃培养72h后,有9株菌的发酵液对AFB1降解率达80%以上,7株菌发酵上清液对AFB1降解率达60%以上。一株来源于发酵食品纳豆的菌株发酵上清液对AFB1的降解率达85.73%,将上清液浓缩后制成的粗酶液对AFB1降解率达到91.4%,该菌株经形态学、生理生化及系统发育学方法鉴定为枯草芽孢杆菌,命名为Bacillus subtilis Natto3。以Bacillus subtilis Natto3为对象,进一步研究了发酵时间、反应温度、p H值以及金属离子等对AFB1降解率的影响。当培养时间为72h,反应温度为37℃,p H值为8.5时,Natto3粗酶液对AFB1的降解率最高,而且Zn2+,Mn2+,Mg2+,Cu2+和Li+五种金属离子均会不同程度的抑制其降解活性。将在37℃条件下培养72h的Natto3菌液的不同成分对AFB1进行降解实验研究,结果发现Natto3菌细胞悬浮液对AFB1的降解率为6.5%,细胞提取物对AFB1的降解率为仅为1.4%,而发酵上清液对AFB1降解率高达87%。对Natto3发酵上清液分别用1mg m L-1蛋白酶K、沸水浴10min及0.22μm滤膜抽滤三种方式处理,前两种处理明显降低发酵上清液对AFB1的降解率,处理后降解率分别为8.6%和15%;而抽滤对上清液中AFB1的降解率影响不大(83%),推测Natto3降解AFB1可能是通过分泌胞外降解酶实现的。以受到黄曲霉毒素污染的花生样品为对象,研究了Natto3粗酶液添加量、反应时间、p H值以及温度对花生中AFB1降解效率的影响。当温度为35℃,p H值为8,Natto3菌粗酶液添加量为3m L时,用粗酶液处理10天后,高度污染的花生样品中AFB1的浓度从344μg kg-1降低到25μg kg-1,中度污染的花生样品中AFB1的浓度从192μg kg-1降低到11.4μg kg-1,而轻度污染的花生样品中AFB1浓度从51.3μg kg-1降低至检测不到的水平。Natto3菌株不仅对AFB1标品具有较强的降解能力,而且也能有效降解污染花生样品中的AFB1。本研究为食品级微生物在降解黄曲霉毒素中的应用奠定了基础。

关键词： 伏马毒素B1   黄曲霉毒素B1   胶体金   试纸条   多残留   谷物  

摘要： 本研究以真菌毒素伏马毒素B1(FB1)、黄曲霉毒素B1(AFB1)为研究对象,研制出检测伏马毒素B1、黄曲霉毒素B1的单残留胶体金免疫层析试纸条以及同时检测两种真菌毒素的多残留胶体金免疫层析试纸条。通过优化,确定伏马毒素B1胶体金免疫层析试纸条的最佳工作条件为：胶体金粒径为18 nm;硝酸纤维素膜选择(NC膜)Millipore HF 135s;胶体金标记抗体蛋白最适pH值为7.5,最佳抗体量为30 μg/mL;包被原的最佳包被量为0.07μg／条,金标抗体稀释倍数为1：5;羊抗兔二抗稀释倍数为1：150;包被稀释液为磷酸盐缓冲溶液(PB);金标垫处理液为PBS缓冲溶液。伏马毒素B1胶体金免疫层析试纸条视觉检测限为5 ng/mL,检测时间小于10 min。方法与其他真菌毒素均没有交叉反应,方法具有很好的特异性。谷物样品的检测限为100 ng/g。通过优化,确定黄曲霉毒素B1胶体金免疫层析试纸条的最佳工作条件为：胶体金粒径为18 nm;硝酸纤维素膜选择Millipore HF 135s;胶体金标记抗体蛋白最适pH值为8.0,最佳抗体量为20 μg/mL;包被原的最佳包被量为0.07μg／条,金标抗体稀释倍数为1：5;羊抗兔二抗稀释倍数为1：130;包被稀释液为PBS缓冲溶液;金标垫处理液为PBS缓冲溶液。黄曲霉毒素B2胶体金免疫层析试纸条视觉检测限为0.5 ng/mL。检测时间小于10 min。方法与其他真菌毒素均没有交叉反应,方法具有很好的特异性。谷物样品的检测限为5 ng/g。通过对伏马毒素B1、黄曲霉毒素B1的多残留胶体金免疫层析试纸条同时检测两种毒素的工作条件的优化,确定最佳工作条件为：伏马毒素金标抗体和黄曲霉毒素金标抗体混合比例为2：1;NC膜划线顺序为质控线、FB1检测线、AFT检测线;样品垫处理液为0.25%Tween-20水溶液,其他工作条件同单残留检测试纸条工作条件。伏马毒素B1、黄曲霉毒素B1的多残留胶体金免疫层析试纸条视觉检测限分别为5 ng/mL、0.5 ng/mL。检测时间小于10 min。谷物样品的检测限分别为96 ng／g和6ng/g。

关键词： 中药制剂   不良反应   预防对策  

摘要： 目的探讨中药制剂的常见不良反应类型与引发因素，有针对性的提出有效的预防对策。方法选取2010年1月~2014年1月我院上报的中药制剂不良反应患者160例，对其临床资料进行回顾性分析，分析不良反应发生的原因。结果在160例发生中药制剂不良反应的患者中，男性72例（45.0%），女性88例（55.0%），不良反应发生60岁以上的老年人中分布最多，42例（26.25%），其次为0~10岁的儿童，37例（23.12%），其他年龄阶段比较无统计学意义（>0.05）。对160例发生中药制剂不良反应的患者的给药途途径进行分析，其中静脉滴注最多，73例，占45.62，其次是口服患者，51例，占31.88%，然后是肌肉注射，28例，占17.50，最少的是外用，8例，占5.00%；累及器官为皮肤的最多，为82例（51.25%）。结论在中药制剂不良反应患者中，在60岁以上的老年人和0~10岁的儿童中最多，主要给药途径为静脉注射，累及器官最多的为皮肤。

关键词： 组合蛋白酶   中药制剂   虫草金钱龟口服液   鸡肉渣   氨基酸含量   提取工艺  

摘要： 目的:氨基酸含量是中药制剂“虫草金钱龟口服液”的重要指标，标准规定含量在80mg/瓶以上。在“虫草金钱龟口服液”产品的生产中，不溶性鸡肉蛋白（鸡肉渣），作为废物被弃掉，没有充分利用其价值。本实验通过开展中药制剂中鸡肉提取工艺的研究，优选最佳提取工艺，以提高氨基酸含量，变废为宝，提升虫草金钱龟口服液产品的品质。　　方法:以氨基酸含量作为考察指标，通过单因素试验和多因素多水平正交试验设计，比较常规工艺、加压工艺、酶解工艺的优劣，确定最佳的提取工艺。　　结果:鸡肉提取中获得氨基酸最多的最佳工艺为:动物蛋白水解酶与木瓜蛋白酶组合水解工艺(工艺条件:温度60(±5)℃，时间6h，加酶量0.15％，组合比1∶2，pH6.0-7.0，水解鸡肉渣的固液比1∶4)。改进工艺应用于生产制作的虫草金钱龟口服液，产品的氨基酸含量平均为153.28mg/瓶，是新标准80.0mg/瓶的191.6％，比加压工艺生产的产品86.15mg/瓶增加了178％。　　结论:虫草金钱龟口服液鸡肉提取工艺中，酶解工艺远远优于常规工艺和加压工艺，加压工艺优于常规工艺，而酶解工艺中，组合酶的水解工艺优于单酶水解工艺。在原料不增加的情况下，获得了更多的氨基酸等营养物质，提升产品品质。

关键词： 高职教育   中药制剂技术课程   基于工作过程   课程开发  

摘要： 中药制剂技术课程是高职药制药技术专业的核心课程。黑龙江农业经济职业学院立足中药制剂岗位群需求制定课程标准,以中药制剂一线品种为依托优化教学内容,基于中药制剂生产工作过程构建教学环节,并进行了人员、文件、物料、环境和设备的模拟,取得了良好的教学效果。

关键词： 中药   中药制剂   指纹图谱  

摘要： 中药是中华民族的精髓,是中华民族五千年历史的结晶,中药的现代化成为中药走出国门更上一个新台阶的必要手段,因此药材、中成药的质量标准成为医药研究的一个重要课题。中药的指纹图谱作为一种非常先进并且切实可行有效手段,在中药质量、中药制剂及其中间体质量控制等方面得到了广泛的应用,已成为国际公认的控制中药质量非常有效的方法。本文就中药指纹图谱的方法及应用进展进行了综述。

关键词： 中药制剂分析   实验教学   教学改革  

摘要： 本文就中药制剂分析实验课程教学模式改革进行探讨。通过优化实验内容、改变教学模式、完善考试制度,提出中药制剂分析改革方法。中医药教育在不断改革,只有不断发现和总结教学中的不足,才能更新教学内容,改革教学方法,促进教学,真正提高教学质量,从而培养出适应时代需要的、既有扎实理论基础又有较强动手能力的高质量中药学专业人才。

关键词： 粮食   食用油   黄曲霉毒素B1   HPLC  

摘要： 通过对目前常用的黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1,AFT B1）检测方法的研究,开发出一种高效,低耗的液相色谱（配有柱后衍生系统）检测方法。经过本研究试验建立了粮食和食用油的样品处理方法、仪器检测条件以及样品测定精密度评价结果如下:谷物样品前处理步骤:称取25.0g粉碎后谷物样品于均质杯中,加入100mL甲醇/水（7/3,V/V）溶液,高速均质5min,静置分层后,吸取5 mL上层清液,4000r/min高速离心后吸清液过0.22μm针式过滤头进样。食用油样品前处理步骤:称取5.0g食用油样品于50 mL具塞量筒中,加入20 mL石油醚,振摇使油样溶解,加入10 mL甲醇-水（7+3）溶液,涡旋混合提取5min,静置分层后,吸取5 mL下层提取液,放入冰箱中,在-25℃下迅速冷冻10min,将提取液趁凉用0.22μm针式过滤头过滤后进样分析。液相色谱检测条件:采用荧光检测器进行检测分析,激发波长:360nm;发射波长:440nm;流动相:甲醇-乙腈-水（22+22+56）;流速:1.0mL/min。柱后衍生系统检测条件:采用C18（4.6×250mm×5μm）色谱柱进行分离,柱温:42℃;反应器温度:90℃;衍生剂:I2溶液（100mg/L）;流速:0.3 mL/min。本论文研究的液相检测方法对黄曲霉毒素B1标准样品峰面积响应良好,能对粮食和食用油样品中的黄曲霉毒素B1加入标样进行有效分离。建立的标准曲线线性回归方程的相关系数为0.9998。本方法的最低检测限为0.4μg/kg,对市售食用油的不同浓度加标回收率为90.4%99.4%,相对标准偏差为4.56%5.36%;对玉米、大米等粮食的不同浓度加标回收率为91.2%100.6%,相对标准偏差为1.40%2.35%。本方法对粮食和食用油中黄曲霉毒素B1检测结果的重复性和准确性优于现有的ELISA方法、免疫亲和层析净化高效液相法和荧光光度等方法。该检测方法与其他仪器检测方法相比不用任何净化小柱,缩短了检测时间,降低了检测成本,前处理更加简便快捷,灵敏度、准确性高,检测限低,能够满足粮食和食用油中黄曲霉毒素B1的检测要求。

关键词： miR-138-1   BEAS-2B细胞   CYP450 2A13   PDK1   黄曲霉毒素B1   恶性转化  

摘要： 环境致癌物与肺癌的发生、发展密切相关,其致癌机制越来越受到广泛的关注。环境致癌物可引起机体某些表观遗传学的改变,在其所致的肿瘤发生和发展中发挥了重要作用。其中,microRNAs(miRNAs)已被认为肿瘤发生发展的关键调节因素,可通过转录后调控许多基因的表达影响细胞的增殖、分化和凋亡等过程,促进细胞的恶性转化和肿瘤的进展。黄曲霉毒素B1(AFB1)是公认的强致癌物,广泛分布于高湿高热地区的各种粮食和饲料中,空气中的AFB1污染可能与肺癌的发生有关。AFB1系间接致癌物,可被呼吸系统中高表达的细胞色素P450 2A13代谢活化而增强其致癌能力。课题组前期采用0.1 nM AFB1处理高表达CYP2A13的肺支气管上皮细胞BEAS-2B(B-2A13)50代(P50)可引起恶性转化,但mi RNAs在此过程中的作用及其机制尚不清楚。因此,了解miRNAs在AFB1致B-2A13细胞恶性转化过程中的作用及其机制有助于全面认识miRNAs在环境致癌物所致肿瘤发生发展中的关键作用。围绕上述问题,本研究利用miRNA芯片比较了P50恶性转化的B-2A13细胞和同期对照细胞的mirnas表达谱,筛选与细胞恶性转化相关的关键mirnas;再通过功能研究评价关键mirna在细胞恶性转化中的作用及其分子调控机制;试图为阐明环境致癌物afb1与肺癌的关系提供依据,也为肺癌的预防和控制提供新的生物学标志。第一部分afb1诱导的b-2a13细胞恶性转化相关的关键mirnas的筛选目的:筛选在p50b-2a13细胞和p50b-vector细胞间差异表达的mirnas,寻找与afb1所致细胞恶性转化相关的关键mirnas。方法:采用affymetrixmirna芯片中检测afb1持续处理的恶性转化的p50b-2a13细胞和同期未转化的对照细胞(p50b-vector)的mirnas表达谱,比较两种细胞间差异表达的mirnas。采用targetscan软件预测差异表达的mirnas的靶基因,分析它们所参与的基因通路,筛选出与细胞恶性转化及肺癌发生密切相关的mirnas,采用rt-qpcr对相关mirnas进行验证。最后再采用瞬时转染mirnamimics的方法在p50b-2a13细胞中过表达mir-138-1*、mir-1271、mir-296-3p和mir-708,用细胞增殖实验和划痕实验检测它们对p50b-2a13细胞增殖和迁移的影响。结果:***芯片分析:在p50b-2a13细胞和p50b-vector细胞间差异表达的mirnas有63个,其中上调的有36个,下调的有27个。***软件预测:初步筛选出差异表达的mirnas共13个,其中上调的有7个,分别为mir-432、mir-382、mir-370、mir-335、mir-183、mir-494和mir-421;下调的有6个,分别为mir-138、mir-138-1*、mir-708、mir-125b-1*、mir-1271、mir-296-3p。***-qpcr验证:rt-qpcr和芯片结果高度相关,除mir-370、mir-138、mir-494外,其余10个mirnas的表达改变同芯片结果方向一致。4.细胞增殖:与对照组(mir-control)相比,mir-138-1*可抑制p50b-2a13细胞的增殖,但mir-1271、mir-296-3p和mir-708对p50b-2a13细胞的增殖影响不显著。5.细胞迁移:测定的4种mirnas都能抑制细胞的迁移,其中mir-138-1*mimics处理组的抑制作用最为显著。瞬时转染mir-control、mir-138-1*、mir-1271、mir-296-3p和mir-708的p50b-2a13细胞的24h划痕愈合情况分别为47%、27%、30%、37%和32%。第二部分mir-138-1*对afb1所致的b-2a13细胞恶性转化的影响及调控机制目的:探讨mir-138-1*对afb1所致的b-2a13细胞的恶性转化过程的影响,分析mir-138-1*调控的分子机制。方法:采用瞬时转染的方法改变mir-138-1*或pdk1在p50b-2a13细胞的表达水平。用体外研究评价mir-138-1*或pdk1对p50b-2a13细胞的增殖、迁移、侵袭和克隆形成的影响。细胞增殖实验、划痕实验、平板克隆形成、软琼脂克隆形成实验、transwell迁移实验、transwell侵袭实验、westernblot、rt-qpcr、报告基因实验等按标准操作程序进行。结果:***-138-1*对p50b-2a13细胞增殖、迁移、侵袭和克隆形成的影响:增加mir-138-1*的表达能显著抑制p50b-2a13细胞的

关键词： 冠心病   经皮冠状动脉介入   中药制剂   体外反搏   白细胞介素   高敏C反应蛋白  

摘要： 目的：评估经皮冠状动脉介入(percutaneous coronary intervention, PCI)治疗后的冠心病(Coronary heart disease, CHD)患者接受中药制剂联合体外反搏治疗后对hs-CRP、IL-8及IL-10水平的影响并探讨其可能作用机制。　　方法：将150例拟行PCI术的CHD患者按照随机数表法分为A组(常规药物治疗组，50例)、B组(常规药物+中药制剂组,50例)与C组(常规药物+中药制剂联合体外反搏组,50例)，各组均给予介入治疗及常规药物治疗;B组在此基础上，从术后当日至术后第14天连续加用中药制剂40mL，1日1次。C组在B组的基础上，给予体外反搏治疗(1h/次，1次/天，术后当日至术后第14天)。同时，分别在术前(T0)、术后第24h(T1)、术后第14日(T2)这三个时间点采取所有入选研究对象肘静脉血5mL，经离心后收集血清备用。采用酶联免疫吸附双抗体夹心法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)集中测定各组血浆高敏C反应蛋白(hs-CRP)、白细胞介素-8(IL-8)及白细胞介素-10(IL-10)的浓度，同时进行在不同时间点三者水平的组内组间比较。　　结果与CHD患者PCI术前水平相比较，术后1天三组的hs-CRP、IL-8及IL-10均升高，且差别有统计学意义(P＜0.05);用药14d时，与常规组相比，中药制剂组、中药制剂联合体外反搏组IL-8、IL-10及hs-CRP较前降低，差异有统计学意义(P＜0.05)，与中药制剂组相比，中药制剂联合体外反搏组降低更明显(P＜0.05)。　　结论在常规治疗的基础上，加用中药制剂可显著降低PCI术后患者血浆中炎症因子hs-CRP、IL-8及IL-10等的水平，说明中药制剂有一定的抑制炎症反应作用。此外，在中药制剂治疗基础上，联合体外反搏亦能显著降低PCI术后病人IL-8、IL-10及hs-CRP水平，这对于指导临床治疗具有重要意义。