关键词：
蒲公英甾醇
黄曲霉毒素B1
网络药理学
转录组学
肝肾损伤
摘要：
黄曲霉毒素B1(Aflatoxin B1,AFB1)是一种主要污染谷物、香料、中草药等的天然毒素。AFB1中毒是目前人和动物食源性疾病死亡的主要原因。虽然已禁止使用受污染的食品加工供人类食用,但轻微污染的原料仍用于动物饲料,这极大地增加了人类通过食物链暴露于AFB1的可能性。肝脏和肾脏是机体代谢解毒、排泄代谢产物的重要器官,也是AFB1攻击的主要靶器官。因此,开发疗效显著且安全性高的药物对于AFB1中毒的防治和人类健康具有重要意义。蒲公英甾醇(Taraxasterol,TAR)是药食同源植物蒲公英(Taraxacum mongolicum Hand.-Mazz.)的主要生物活性成分之一,能够通过Nrf2/HO-1途径对药物性肝损伤发挥保护作用,并能够通过ERK和JNK途径缓解缺血再灌注引起的肾损伤。然而,TAR对AFB1所致肝肾损伤的保护作用及潜在机制尚不清楚。因此,本研究整合网络药理学、转录组学和传统药理学方法,深入探究TAR对AFB1所致肝肾损伤的保护作用及机制。
在网络药理学分析中,首先筛选出21个TAR抗AFB1致细胞损伤的核心靶点,这些靶点主要富集在信号转导、细胞凋亡的负调控以及转录调节等生物过程和PI3K-Akt、Rap1、MAPK、Fox O等信号通路,并且AKT1在TAR抗AFB1致细胞损伤中具有重要意义。在肝脏转录组学分析中,获得43个模型组与TAR治疗组的差异基因,这些差异基因主要富集在凋亡信号转导过程和PI3K-Akt、Fox O信号通路。在肾脏转录组学分析中,获得42个模型组与TAR治疗组差异基,这些差异基因主要富集在氧化还原酶活性、细胞凋亡、线粒体自噬等生物过程和MAPK信号通路。
整合肝脏转录组学与网络药理学研究结果发现,TAR抗AFB1致肝损伤的靶点共同富集于PI3K-Akt和Fox O信号通路,且与细胞凋亡过程密切相关。因此,本研究通过体内外试验探究TAR对肝细胞凋亡和PI3K/AKT1/FOXO1信号通路的调控作用。在体内试验中,建立AFB1诱导肝损伤小鼠模型并检测TAR对肝脏功能、组织病理学变化、氧化应激(OS)和细胞凋亡的影响。结果显示,TAR显著降低AFB1引起的血清ALT和AST水平升高(P<0.05和P<0.01),并缓解AFB1暴露导致的肝细胞肿胀、炎性细胞浸润和线粒体损伤。TAR显著提高肝脏组织T-AOC、GSH和SOD水平(P<0.05和P<0.01),并抑制ROS和MDA产生(P<0.01),从而减轻AFB1诱导的小鼠肝脏OS。TUNEL染色发现,AFB1暴露导致肝细胞凋亡加剧,而TAR治疗明显抑制细胞凋亡。蛋白免疫印迹(WB)和免疫组织化学(IHC)结果显示,TAR的干预抑制了AFB1暴露导致的肝脏PI3K、AKT1和Bcl2蛋白表达水平下调(P<0.05、P<0.01和P<0.001)以及FOXO1和Bax蛋白表达水平上调(P<0.01和P<0.001)。在体外试验中,建立AFB1诱导AML12细胞损伤模型并使用特异性抑制剂NACET、SC79干预以探究TAR对OS和AKT1途径的影响。结果显示,TAR显著降低AML12细胞Bax和Caspase3蛋白的表达,提高Bcl2蛋白的表达,这一作用趋势与OS抑制剂NACET一致。此外,AKT1激动剂和TAR的干预均能够引起FOXO1、Bax、Bcl2蛋白表达水平降低和Bcl2蛋白表达水平升高。上述结果证实,TAR通过OS和AKT1/FOXO1途径抑制AFB1诱导的肝细胞过度凋亡。
整合肾脏转录组学与网络药理学研究结果发现,TAR抗AFB1致肾损伤的靶点共同富集于MAPK信号通路,且与细胞凋亡和自噬过程密切相关。因此,本研究通过体内外试验探究TAR对EGFR/ERK信号通路以及肾细胞凋亡和自噬的影响。在体内试验中,建立AFB1诱导肾损伤小鼠模型并检测TAR对肾功能、组织病理学变化、OS、细胞凋亡和自噬的影响。结果显示,TAR降低AFB1引起的血清CRE和BUN水平升高(P<0.01和P<0.001),并缓解AFB1暴露导致的肾小球增大、肾间质水肿、肾小管空泡化、线粒体损伤,同时减少凋亡小体的数量和增加自噬小体的数量。TAR显著提高肾脏T-AOC、GSH和SOD水平(P<0.05,P<0.01和P<0.001),并抑制ROS和MDA产生(P<0.05,P<0.01和P<0.001),减轻AFB1暴露引起的OS。TUNEL染色发现,AFB1暴露导致肾细胞凋亡加剧,而TAR治疗明显抑制细胞凋亡。WB和IHC结果显示,TAR下调肾脏EGFR、p-ERK、Bax、Caspase3蛋白表达(P<0.05,P<0.01和P<0.001),上调Bcl2、BECN1、ATG12、LC3B蛋白表达(P<0.05,P<0.01和P<0.001)。
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