关键词： 黄曲霉毒素B1   细胞毒性   复合脱毒剂   拮抗  

摘要： 黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1,AFB1）是由黄曲霉和寄生曲霉产生的有毒次生代谢产物,广泛污染农作物。畜禽采食被AFB1污染的饲料,会对其肝脏、肠道和免疫器官等造成危害。因此,加强畜禽养殖中对AFB1危害的防控很重要。本研究旨在评价一种新型复合脱毒剂拮抗AFB1致鸡肝细胞（LMH）、猪肠道上皮细胞（IPEC-J2）和猪肺泡巨噬细胞（3D4/21）细胞毒性的作用,该复合脱毒剂主要由酵母细胞壁和膨润土等组成。主要结果如下: ***1对LMH、IPEC-J2和3D4/21细胞活性30%抑制浓度(IC30)分别为0.5、15.0和2.5 mg/L;与AFB1组相比,培养基中分别添加0.025%-0.1%、0.025%-0.1%、0.005%-0.01%的复合脱毒剂,可显著缓解AFB1诱导的LMH、IPEC-J2和3D4/21细胞死亡,三种细胞的细胞活性分别显著提升了10.4%-17.8%、22.5%-51.3%、5.4%-8.0%（P<0.05）。 ***1导致LMH、IPEC-J2和3D4/21细胞ROS、DNA损伤和细胞凋亡显著增加（P<0.05）,3D4/21细胞迁移和吞噬能力显著受损（P<0.05）。培养基中分别添加0.025%、0.025%和0.005%的复合脱毒剂可显著缓解AFB1诱导的LMH、IPEC-J2和3D4/21细胞的上述细胞毒性（P<0.05）。 3.培养基中添加复合脱毒剂可通过降低LMH细胞中IL-1β、IL-6和IL-10 m RNA,IPEC-J2细胞中IL-6 m RNA,3D4/21细胞中IL-1β、MCP-1 m RNA的表达水平,显著缓解AFB1诱导的炎症反应（P<0.05）;培养基中添加复合脱毒剂可显著抑制AFB1诱导的LMH细胞中BAX、BCL-2,IPEC-J2细胞中Bcl-2、cleaved caspase-3/caspase-3、BCL-2、p53和3D4/21细胞中的cleaved caspase-3/caspase-3、BCL-2的异常变化,显著抑制AFB1诱导的3种细胞的凋亡（P<0.05）;此外,培养基中添加复合脱毒剂还可以拮抗AFB1诱导的3D4/21巨噬细胞向促炎M1型极化,进而缓解AFB1诱导的3D4/21细胞免疫功能损伤。 综上所述,本研究结果显示复合脱毒剂拮抗AFB1致LMH、IPEC-J2和3D4/21的细胞毒性,主要与其抑制ROS、炎症细胞因子、DNA损伤等介导的细胞凋亡相关。

关键词： 黄曲霉毒素B1   电化学适配体传感器   信号放大策略   比率型传感器   多模传感器  

摘要： 黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1,AFB1）是黄曲霉和寄生曲霉代谢过程中生成的次级产物,其强烈的毒性和致癌性已得到广泛认可,被国际癌症研究机构（International Agency for Research on Cancer,IARC）列为人类Ⅰ级致癌物。由于AFB1的高毒性及其在各类农产品中的广泛污染,它的存在严重威胁到食品安全和公共健康。因此,研发高灵敏度和高特异性的AFB1检测方法对食品安全监测和临床诊断具有重要意义。在功能核酸和纳米材料等新技术的推动下,各类AFB1生物传感器不断涌现,但要进一步提高传感器的性能和实现对AFB1的快速现场筛查,仍面临诸多挑战。 本课题利用稳定性好、特异性强的核酸适配体（Aptamer,Apt）和操作简单、响应迅速的电化学分析技术,借助杂交链式反应（Hybridization Chain Reaction,HCR）、催化发夹组装（Catalytic Hairpin Assembly,CHA）、核酸酶（DNAzyme）、纳米材料等信号放大策略,设计了三种新型生物传感器对AFB1的检测进行研究。具体内容如下: 1、基于HCR和AFB1驱动的Ag+-DNAzyme,构建了一种电化学适配体传感器用于AFB1的灵敏检测。将含有RNA A（rA）剪切位点和HCR引发序列的底物链（sDNA）固定在电极表面,sDNA可以打开发夹链进而引发HCR反应。凝胶电泳表征结果验证了HCR反应的成功进行。经过HCR反应形成的DNA双链能够结合大量亚甲基蓝（Methylene Blue,MB）,实现信号放大,提高检测灵敏度。Apt和互补链（cDNA）结合成双链,胞嘧啶（C）能够结合Ag+并在双链中形成C-Ag+-C结构。当AFB1存在时,Apt优先与AFB1结合,驱动Ag+掉落。Ag+诱导Ag+-DNAzyme对sDNA上的rA位点进行剪切。双链DNA从金电极（AuE）表面脱落,从而减少MB的结合量,电流信号降低。对实验条件进行优化,得到MB的最优浓度为10 mM,链霉亲和素磁珠（Streptavidin Magnetic Beads,SA-MBs）的最优用量为5μL,Ag+的最优浓度为10μM,AFB1的最优孵育时间为30 min。在上述最佳实验条件下,观察到MB的电流响应在0.001～50 ng/mL的浓度区间与AFB1浓度的对数(LgCAFB1)呈现明显的线性关联。此外,该方法的最低检出限（LOD）达到了0.416 pg/mL。 2、硫堇（Thionine,Thi）可用作电化学指示剂和还原HAuCl4的还原剂,与ZIF-8共同反应形成Thi/Au/ZIF-8纳米复合材料。将Thi/Au/ZIF-8与缓冲溶液中的[Fe（CN）6]3-/4-用作双信号探针,其电流比值IThi/Au/ZIF-8/I[Fe（CN）6]3-/4-作为响应信号,构建了一种用于AFB1检测的比率型电化学适配体传感器。以AFB1诱导的CHA作为信号放大策略,通过cDNA的循环实现信号扩增。在AFB1存在的情况下,H2/Thi/Au/ZIF-8通过CHA反应结合在电极上,Thi/Au/ZIF-8的电流信号增大。H2/Thi/Au/ZIF-8上的H2含有DNA磷酸骨架,阻碍了[Fe（CN）6]3-/4-的氧化还原反应,导致[Fe（CN）6]3-/4-电流信号降低。ZIF-8具有较高的稳定性和负载能力,能够结合大量的Thi。比率型电化学生物传感器双信号探针之间的比率可用于内置校正,提供更准确的输出信号。该传感器对实际样品的检测和分析具有良好的效果,在花生和红茶加标样品中的平均回收率分别为94.6%～96.5%和102.9%～113.4%。用该传感器对经过HPLC法验证的玉米粉质控样进行检测,检测结果与HPLC法无显著差异,表明所制备的传感器检测结果准确。 3、以链霉亲和素（SA）为有机组分,Cu3（PO4）2为无机组分,合成了SA-Cu3（PO4）2杂化纳米花(SA-Cu3（PO4）2 HNFs)。将标记有生物素的DNA链和生物素化转化酶连接到SA-Cu3（PO4）2 HNFs上,用作构建生物传感器的多功能信号探针。SA-Cu3（PO4）2 HNFs通过其内在的氧化还原活性可以产生稳定的电化学信号,用于电化学检测。同时,信号探针上的转化酶能将蔗糖转化为葡萄糖,引起血糖仪信号和尿糖试纸颜色的变化。利用智能手机获取尿糖试纸的显色结果照片,将该结果照片导入到开发的“Toxin Inspector”应用程序读取RGB值,根据设置的线性方程计算并显示AFB1浓度。该传感器利用电化学、血糖仪和基于智能手机的比色法对AFB1进行准确定量。在最佳实验条件下,该多模生物传感器在电化学模式下展现出了0.001～100 ng/mL的线性响应范围,LO

关键词： AFB1   适体传感器   纳米酶   信号放大技术  

摘要： 真菌毒素是一类高毒性次生代谢产物,严重威胁着人类健康。其中,黄曲霉毒素B1（AFB1）是污染食品中最常见、毒性最大的真菌毒素之一。因其具有高稳定、易积累的特性,建立高灵敏、特异性的AFB1检测方法对于确保食品安全至关重要。基于此,本论文设计并合成了多种类型的纳米酶,结合核酸信号放大策略,从而构建了一系列高灵敏适体传感器用于AFB1的灵敏、快速检测。主要工作如下: （1）合成了具有独特团聚特性和过氧化物酶活性的Hemin-石墨烯（H-GNs）复合材料,结合滚环扩增（RCA）辅助信号放大策略,设计、构建了一种简单、无标记的比色适体传感器用于快速、灵敏检测食品样品中的AFB1。在0.5 M Na Cl溶液中,H-GNs出现团聚现象,但当AFB1靶标存在时,适体与靶标结合,释放出的c DNA,引发RCA扩增反应。扩增产生的高分子量的长单链DNA（ss DNA）带有的负电荷增加,使H-GNs之间的斥力变大,提高了其抗盐能力,H-GNs的分散性变好。其上层清液在H2O2存在下,可催化过氧化氢酶底物TMB生成蓝色的氧化产物ox TMB,发生显色反应,可依据体系显色后溶液颜色的深浅对AFB1的存在进行初判,根据在652 nm处的紫外-可见吸收信号进行定量检测。在最佳条件下,所构建的AFB1比色适体传感器具有较宽的检测范围（0.125 ng/m L～62.5ng/m L）和较低的检出限（0.08 ng/m L）,可满足食品现场快速检测的需要。 （2）利用级联锚定策略将单原子铂锚定在MOF衍生多孔碳（p NC）纳米材料上合成了单原子铂纳米酶(（Pt-p NC SANs）。该纳米酶具有原子级分散金属活性位点,可最大限度地利用金属原子,同时MOF衍生的碳材料丰富的孔结构,可以富集更多的反应底物,因此,该纳米酶具有较高的催化效率和良好的成本效益。随后,我们基于Pt-p NC SANs优越的模拟酶活性,结合杂交链式扩增反应(（HCR）,构建了用于AFB1检测的比色适体传感器。当样品中存在AFB1时,AFB1适体特异性识别靶标,末端带有Pt-p NC SANs的HCR扩增产物在靶标的竞争下从磁球上脱落,游离至上清中。经过磁分离后,将上清液加入TMB-H2O2体系进行反应,在Pt-p NC SANs的催化下,TMB被H2O2氧化生成蓝色ox TMB,可通过观察溶液颜色变化对AFB1的存在进行初判,通过测定ox TMB在652 nm处的紫外-可见吸收信号大小,实现AFB1的快速定量检测。在最佳条件下,比色适体传感器检测线性范围为1 pg/m L～10 ng/m L,检出限低至0.16 pg/m L,可实现AFB1的快速、灵敏比色分析。 （3）设计合成了Ag@Au IP6双功能纳米酶,并基于该纳米酶构建了一种比色/无标记SERS双模式适体传感器,用于食品中AFB1的超灵敏检测。当AFB1存在时,触发探针暴露并引发HCR扩增反应,导致碱性磷酸酶（ALP）的引入,从而介导了具有核壳结构的Ag@Au IP6纳米酶的自组装。该纳米酶同时具有过氧化物酶活性和表面增强拉曼散射（SERS）效应,在TMB-H2O2体系中可促进蓝色产物ox TMB的生成,并作为SERS基底显着增强ox TMB的拉曼信号。因此,本研究开发的双模式适体传感器无需修饰信号分子和更换材料或试剂即可实现SERS/比色检测。在现场检测中,视觉传感分析可以通过智能手机中的颜色辅助应用程序收集色度信号并将其转换为RGB值来实现。在最佳条件下,双模核酸适体传感器的检测限低至0.58 fg/m L,可满足AFB1现场快速、灵敏检测的需求。

关键词： 黄曲霉毒素B1   铈离子   酶联免疫分析法   铜簇   比率荧光  

摘要： 真菌毒素是农产品中最常见、最有害的污染物之一。在所有的真菌毒素中,黄曲霉毒素B1（AFB1）是毒性最强的次生代谢物。国际癌症研究机构（IARC）将AFB1列为“I组”致癌物。花生、玉米和谷物等食物和饲料经常受到AFB1的污染。因此,开发简单、灵敏的农产品中AFB1的检测方法是保障食品安全的迫切需要。 本研究基于酶联免疫分析法（ELISA）和两种纳米材料(聚乙烯吡咯烷酮保护的铜纳米团簇（PVP-Cu NCs）和铈基配位聚合物纳米颗粒（CPNs）)开发了三种免疫分析方法来检测黄曲霉毒素B1。 1.建立间接竞争ELISA（ic-ELISA）方法检测AFB1。线性回归方程为y=127.060x-194.847,相关系数（R2）=0.988。最低检测限（LOD）为41 pg/m L,线性范围为45～159 pg/m L,满足我国AFB1最低检出限的要求。该方法特异性良好,与其他真菌毒素均不发生交叉反应。玉米样品的回收率为83.64%～105.79%之间,符合美国分析化学家协会（AOAC）的规定。 2.基于Ce4+氧化邻苯二胺和聚乙烯吡咯烷酮保护的铜簇（PVP-Cu NCs）比率荧光免疫分析法检测AFB1。线性回归方程为y=-0.004x+1.774,R2=0.989,LOD为24.75 pg/m L,线性范围为50～250 pg/m L,满足我国AFB1最低检出限的要求。该方法与其他真菌毒素均不发生交叉反应。玉米样品的回收率为84.66%～105.21%之间,符合美国分析化学家协会（AOAC）的规定。 3.基于碱性磷酸酶介导的铈基配位聚合物纳米颗粒（CPNs）和邻苯二胺的比率荧光免疫分析法检测AFB1。线性回归方程为y=-0.185x+56.596,R2=0.991。LOD为5.34 pg/m L,线性范围为75～300 pg/m L,满足我国AFB1最低检出限的要求。该方法与其他真菌毒素均不发生交叉反应。玉米样品的回收率为99.21%～120.55%之间,符合美国分析化学家协会（AOAC）的规定。

关键词： 黄曲霉毒素B1   小窝蛋白-1   肠上皮屏障   碳酸酐酶2  

摘要： 一、研究背景与目的 黄曲霉毒素B1（aflatoxin B1,AFB1）是食物中最为常见的真菌代谢产物,理化性质稳定并具有较强的毒性（急性损伤、致癌性、致畸性等）,是霉菌毒素中毒性最大、对人类健康危害极为突出的一类,被国际癌症研究机构列为I类致癌物,也是公众最为关心的食品安全热点问题[1]。目前,针对AFB1中毒尚无特效治疗药物,只能进行排毒以及对症支持治疗[2]。膳食摄入是人类和动物主要的AFB1接触途径。该毒素被摄入后必须穿过肠道屏障进入体内[3]。肠道屏障不仅是抵御有害物质和微生物入侵的初级防御线,而且是重要的营养物质及生物大分子的吸收和转运场所。研究表明AFB1在吸收过程中产生肠细胞毒性作用,导致肠屏障功能损伤。肠屏障受损后,一方面促进了毒素的旁路吸收,使得更多毒素进入体内,从而加剧毒素的毒性作用[4];另一方面引发了肠道炎性反应,并可通过“肠-肝轴”等联动效应增强毒素的肝损伤[5]。因此,早期干预AFB1肠内吸收与屏障损伤是预防AFB1急性中毒的关键。 在之前的研究中,我们的团队采用了体外肠上皮细胞转运模型,并运用RNA干扰技术对涉及肠上皮细胞跨膜运输的140种蛋白质进行了筛查。研究发现,在这些蛋白质中,小窝蛋白-1（Caveolin-1,Cav1）的表达降低后,显著地减弱了AFB1的跨膜转运功能。特别地,Cav1在AFB1转运阶段引发了肠道屏障通透性改变。Caveolin家族中,Cav1蛋白是关键成员,它在多种细胞类型中普遍存在,特别是在上皮细胞、内皮细胞以及肺泡壁细胞内的表达量最高[6]。Cav1是细胞内囊泡介导的脂质转移、吞噬作用与释放作用等机制中的一个关键参与者,尤其在内皮或上皮细胞大分子的跨膜运输中扮演着重要角色[7]。通过N端结构域,Cav1在细胞内调控多种信号传导途径,如与激酶相关的Src家族酪氨酸激酶、应激激活蛋白激酶,以及丝裂原激活蛋白激酶通路,这对上皮和内皮细胞的通透性及其屏障功能的调控至关重要[8]。研究显示,Cav1能够通过直接或间接的方式影响紧密连接的蛋白表达,从而改变肠道屏障的功能[9]。然而,Cav1如何介导肠道屏障的损害,其具体机理尚未清晰,这需要更多的研究去深入探讨。 根据近年来对Cav1的生物学功能以及毒素与肠道细胞相互作用的机制,本课题提出假设:AFB1通过Cav1调节了肠上皮细胞间的紧密连接结构,引发肠上皮屏障损伤。根据上述背景研究及假设,本课题拟开展Cav1调控AFB1肠上皮屏障损伤的作用与机制研究,旨在明确Cav1在AFB1肠道上皮屏障损伤中的关键作用,进一步阐明Cav1介导AFB1肠道上皮屏障损伤的分子机制,为寻找抑制AFB1损伤肠上皮屏障的药物开发提供新靶点。 二、研究方法 （一）第一部分:Cav1在AFB1损伤肠道过程中的作用 使用CRISPR-Cas9基因编辑技术构建Cav1敲除的Caco-2细胞株及Cav1敲除的AFB1染毒细胞模型,将野生型Caco-2细胞作为对照,通过细胞活性实验、免疫荧光、免疫蛋白印迹等方法检测AFB1作用后引起的肠道细胞毒性情况,明确Cav1在AFB1损伤肠道过程中发挥的作用。 利用Cav1基因敲除小鼠,构建Cav1敲除的AFB1动物损伤模型,在动物水平通过HE染色,血清生化检测,组织免疫荧光等方法验证Cav1是否在AFB1损伤肠道过程中发挥作用。 （二）第二部分:Cav1在AFB1肠道损伤中的作用机制 用野生型Caco-2细胞,Cav1敲除的Caco-2细胞,以及AFB1处理后的野生型及Cav1敲除的Caco-2细胞作为分析样本进行有参转录组、蛋白质组测序,分析不同处理组间的差异表达基因及蛋白。用上述同样的样本及分组进行代谢组学分析,分析不同处理组间的差异代谢物。结合多组学联合分析结果确定Cav1调控下游关键基因,利用通过RT-q PCR及免疫印迹实验,验证Cav1对关键分子的调控作用。 NCBI、UCSC数据库获取关键分子潜在启动子区域碱基序列,利用JASPAR数据库预测关键分子的转录因子,结合组学数据及GEPIA数据库分析转录因子与基因表达相关性。利用Luciferase荧光素酶报告基因实验、CHIP染色质免疫共沉淀实验验证转录因子直接作用,确定Cav1调控下游关键分子的机制及过程。 采用RNA干扰及抑制剂的方式构建关键分子敲低的Caco-2细胞株,通过细胞活性实验、免疫荧光、免疫蛋白印迹等方法检测AFB1作用后引起的肠道细胞毒性情况,明确关键分子在AFB1损伤肠道过程中的作用。利用抑制剂构建下游关键分子敲低的小鼠动物模型,在动物水平通过HE染色,血清生化检测,组织免疫荧光等方式验证关键分子是否在AFB1损伤肠道过程中发挥作用。 三、研究结果 利用CRISPR-Cas9基因编辑技术,成功构建了Cav1敲除的C

关键词： 黄曲霉毒素B1及其前体物质   多足   周期性介孔有机硅   离子液体   共价有机骨架材料  

摘要： 黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1,AFB1）及其前体物质会污染谷物,对食品安全和人类健康构成重大风险;另外,使用前体物质作为早期预警分子是防止AFB1污染的有效措施。但同时和有效地萃取和测定具有不同结构的AFB1及其前体物质仍然是一项具有挑战性的任务。本论文选取AFB1及其两种典型前体物质Averantin（AVN）和Sterigmatocystin（ST）为分析物,针对谷物样品的复杂性,三种分析物的痕量存在及结构的差异性,制备了三种具有多足、多孔结构且能提供多重相互作用的吸附剂,考察了周期性介孔有机硅（Periodic mesoporous organosilica,PMO）其对三种分析物的萃取性能,探讨了相应的萃取机理,结合高效液相色谱-紫外检测（High performance liquid chromatography-ultraviolet detection,HPLC-UV）技术,建立了测定谷物中痕量AFB1、AVN和ST的分析方法,为谷物中AFB1及其前体物质的监测以及AFB1的预警检测提供了强有力的技术支撑。主要内容如下: （1）通过表面动力学介导的多位点成核策略,以有机硅烷为前驱体在Si O2表面合成多足周期性介孔有机硅（Periodic mesoporous organosilica,PMO）,再用双咪唑基离子液体修饰,得到一种双咪唑基离子液体功能化的多足介孔硅胶(Bisimidazolium-type ionic liquid functionalized multipod mesoporous silica,Si O2@m PMO-IL（im）2),将其作为分散固相萃取（Dispersive solid phase extraction,DSPE）吸附剂,结合HPLC-UV技术,同时有效萃取和测定了大米和小麦中的AFB1、AVN和ST。归因于蒺藜子状多足、介孔结构和多重相互作用的协同效应,Si O2@m PMO-IL（im）2可以同时有效萃取不同结构的AFB1、AVN和ST。在优化萃取条件下,建立的Si O2@m PMO-IL（im）2-DSPE-HPLC-UV方法有良好的线性关系（r2≥0.9978）,三种分析物的检出限（Limit of detections,LODs）和定量限（Limit of quantifications,LOQs）分别在0.9-1.5μg kg-1和3.0-4.5μg kg-1之间,加标回收率为92.5%-106.8%,日内和日间的相对标准偏差（Relative standard deviations,RSDs）分别在0.8%-6.2%和1.8%-6.4%范围内。结果表明,该方法可成功用于大米和小麦样品中AFB1、AVN和ST的测定。本工作建立了一种测定大米和小麦样品中AFB1及其前体物质的新方法,为实现同时有效萃取具有不同结构的AFB1及其前体物质提供了新的策略。 （2）以表面活性剂为结构导向剂,以2种有机硅烷为前驱体缩合形成多足PMO,再用三苯基离子液体修饰,合成了足数可控的三苯基离子液体功能化的多足周期性介孔有机硅(Triphenyl based ionic liquid functionalized multipod periodic mesoporous organosilica,MPMO-IL（ph）3)。反应搅拌速度对MPMO-IL（ph）3的足数和比表面积影响明显。具有更多足数和更大比表面积的MPMO-400-IL（ph）3作为DSPE吸附剂,可以同时有效萃取不同品种大米样品中的AFB1、AVN和ST。结合HPLC-UV优化了一些关键萃取参数,在优化的条件下,建立的方法线性良好（r2≥0.9974）,AFB1和AVN线性范围为0.90-120μg kg-1,ST的线性范围为0.60-120μg kg-1,LODs和LOQs分别在0.18-0.30μg kg-1和0.60-0.90μg kg-1之间。该方法在三种不同大米（东北香米、原阳大米和特级糯米）中的加标回收率为93.4%-107.2%,日内和日间的RSDs分别为1.3%-6.9%和1.9%-7.0%。经MPMO-IL（ph）3-DSPE处理后,分析物的检测灵敏度明显提高,且可以有效消除基质干扰。本工作为准确可靠分析谷物中的AFB1及其前体物质提供了新的样品前处理技术。 （3）以不同单体为结构单元,在氨基硅胶表面生长成多足COF,通过磺酸基离子液体修饰,得到了磺酸基离子液体功能化的多足共价有机骨架负载硅胶（Sulfonic acid-based ionic liquid functionalized multipod covalent organic framework supported s