关键词： 黄曲霉毒素B1   反刍动物   类绵羊艾美耳球虫   肠道菌群   氧化磷酸化   凋亡  

摘要： 绵羊球虫病是由艾美耳属的原生动物引起的一种常见的肠道疾病,主要引起腹泻以及体重减轻等症状。动物健康状态是影响其对球虫易感性的重要因素。先前有研究证实,霉菌毒素可以影响家禽对球虫的易感性。由于球虫对宿主特异性以及动物物种的不同,尚不清楚霉菌毒素是否干扰绵羊对球虫的易感性。黄曲霉毒素B1(AFB1)是一种已知的强致癌物,它广泛存在于环境、土壤、粮食作物和动物饲料中。研究已证实,它对人类和动物的健康有负面影响。作为抵御有害物质进人机体内环境的第一道屏障,肠道不仅是AFB1的主要暴露部位,还是球虫发育和繁殖的场所。因此,本研究使用绵羊作为动物模型来深入探究AFB1和球虫联合作用时是否影响球虫单独作用时对肠道结构以及功能的破坏,同时基于蛋白组学挖掘AFB1和球虫之间相互作用的复杂机制。首先使用抗球虫药物地克珠利处理羔羊两周,从中挑选20只健康未感染球虫的雌性羔羊作为受试对象。随后,随机分为4组,每组5只羔羊:对照组(CON)、AFB1组(AFB1)、类绵羊艾美耳球虫(Eimeria ovinoidalis)组(EO)和AFB1+类绵羊艾美耳球虫组(EO+AFB1),试验周期为15天。其中,EO组和EO+AFB1组在试验第一天灌服2×10～4个孢子化卵囊。AFB1和EO+AFB1组灌服AFB1溶液(60μg/kg体重的AFB1,溶于2%DMSO溶液),其余两组灌服等体积、等浓度的DMSO溶液,连续灌服14天。探究AFB1与球虫共同存在下对羔羊肠道损伤的潜在作用机制。 研究一:AFB1暴露对球虫感染下羔羊肠道屏障的影响 选取CON组、EO组、AFB1组和EO+AFB1组肠道样本进行组织病理学观察,然后通过阿利新蓝-过碘酸雪夫(AB-PAS)染色、PAS染色、免疫荧光和蛋白免疫印迹(WB)技术分析肠道通透性的变化。 (1)AFB1的暴露影响了球虫感染羔羊粪便中卵囊的数量及球虫的发育过程。与EO组相比,EO+AFB1组羔羊卵囊排出的高峰期提前,并且减少高峰期时粪便卵囊排出的数量。 (2)AFB1和球虫联合作用可以严重破坏盲肠组织。通过组织病理学观察,发现两种因素的联合作用主要导致了羔羊盲肠结构的严重破坏,造成盲肠隐窝的破坏以及出血,并且严重减少盲肠粘膜的厚度。进一步采用AB-PAS和PAS染色评估肠道杯状细胞的数量和分泌,同时免疫荧光和WB技术检测肠道通透性的关键蛋白(紧密连接蛋白)的表达水平。结果发现,与EO组和AFB1组相比,EO+AFB1组羔羊盲肠中杯状细胞数量和粘蛋白的表达水平被进一步降低(p<0.05)。同时,与EO组相比,EO+AFB1组羔羊盲肠中紧密连接蛋白Occludin的蛋白表达水平也被进一步抑制(p<0.001)。 研究二:AFB1暴露对球虫感染羔羊肠道菌群稳态以及全身免疫的影响 (1)AFB1加重球虫对肠道菌群稳态的影响。对各组羔羊盲肠内容物进行16S r RNA测序分析,发现在AFB1存在下加重球虫对肠道菌群多样性和丰富度的影响。与CON组相比,EO组羔羊盲肠表现为一种产生丁酸盐的Oscillospira(颤螺菌属)相对丰度的降低,并且在AFB1暴露下(EO+AFB1组)进一步减少(0.0015 vs 0.0057 vs 0.0103)。通过检测盲肠中短链脂肪酸的含量,结果显示与CON组相比,EO组盲肠中乙酸(48.53 vs 453.8 vs 1088)、丙酸(4.068 vs 84.48 vs 280.2)、丁酸(0.9567 vs 54.95 vs 179.3)、异丁酸(0 vs 10.09 vs 23.15)、戊酸(0 vs 6.083 vs 21.08)和异戊酸(0 vs 11.57 vs 21.13)的含量均有所下降,当同时暴露于AFB1时,这些短链脂肪酸的含量进一步降低。通过Spearman分析发现Oscillospira(颤螺菌属)与肠道中6种短链脂肪酸均呈较强的正相关(R>0,p<0.05)。 (2)AFB1加重球虫对肠道炎症的影响。通过实时荧光定量PCR(q RT-PCR)发现,与CON组相比,EO组可显著诱导TLR4和NF-k B基因水平的表达(p<0.05)。然而,AFB1减弱了球虫对羔羊盲肠中TLR4和NF-k B基因表达水平的影响(p>0.05)。同时,球虫对羔羊IL-6和TNF-α基因表达、IL-17A和IFN-γ含量的影响因AFB1的存在而加剧(p<0.001),这可能是肠道菌群的紊乱以及肠道屏障的破坏,造成脂多糖(LPS)通过肠道屏障进入血液循环,引起全身的免疫反应。此外,试验检测血浆中LPS含量发现,EO+AFB1组羔羊血浆LPS含量降低显著低于EO组(p<0.01)。同时也发现EO+AFB1组羔羊血浆中全身免疫相关指标IL-6、IL-17A、IFN-γ和TNF-α的水平低于EO组。

关键词： 滑液囊支原体   复方中药   网络药理学   组织病理分析   NF-κB通路  

摘要： 滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae,MS)感染引起的鸡滑囊炎是家禽养殖生产中常见的传染病。MS可长期定植于呼吸道,在世界范围广泛流行,不同品种、性别和年龄的鸡均可发病。病鸡表现为关节或足垫肿大、呼吸道病、消瘦及生产性能下降等症状,给家禽养殖业造成巨大的经济损失。当前生产中广泛使用抗生素治疗MS感染,导致MS耐药性增加以及食品中的药物残留,严重威胁人类的健康。因此,寻求安全有效的抗生素替代品迫在眉睫。中草药来源广,无药物残留且不易产生耐药性,具有抗菌消炎,提高机体免疫力的功能,使其极具替抗潜力。本研究以中兽医学理论为指导,复方选择黄芩、黄连、黄柏和甘草等7味中药配伍而成,并利用网络药理学分析预测其防治MS感染的作用机制。通过动物试验评估该复方对鸡MS感染的防治效果,以探索其分子机制,旨在为复方中药的临床应用和推广提供科学依据。主要研究结果如下: 1.本复方中药制剂对MS的最小抑菌浓度(MIC)为12.5 mg/m L。 2.将39日龄欣华鸡随机分为8组,每组28只,分别为A(健康组)、B(复方中药单独处理组,1 g/kg)、C(低剂量防治组,1 g/kg)、D(高剂量防治组,1.5 g/kg)、E(低剂量治疗组,1 g/kg)、F(高剂量治疗组,1.5 g/kg)、G(泰乐菌素治疗组,0.5 g/L)、H(MS感染模型组)。结果表明,B组复方中药连续灌喂26 d,其料肉比和体增重与A组无显著差异;攻毒5 d,MS感染率为100%,MS感染各组鸡的料肉比显著高于A和B组,体增重显著低于A和B组;治疗7 d并观察14 d,所有组料肉比无显著差异,H组的体增重显著低于其余各组,治疗有效率均在75%以上。此外,H组的脾脏指数显著高于其余各组,胸腺指数显著低于A、B、C、E和G组,法氏囊指数显著低于A、B和C组。q PCR结果显示,A和B组气管中未检出MS,其余各组MS载量均显著低于H组。 3.关节周长测定结果显示,MS感染前所有鸡关节周长体重比无显著差异。攻毒后,与A和B组相比,MS感染各组鸡关节周长体重比显著上调;治疗7 d结束,各治疗组与H组无显著差异;治疗后观察14 d,H组关节周长体重比显著高于其余各组,表明复方中药防治可有效缓解MS感染导致的关节肿胀。 4.剖检评分结果可见,MS感染后,病鸡气囊出现轻微程度的增厚和积液;关节出现明显肿胀,切开可见黄白色至血脓样黏性渗出物;足垫出现肿胀,严重者可见黄色干酪物。而复方中药防治提高了气囊、足垫和关节的保护率,与泰乐菌素治疗效果相当。 5.组织病理学分析结果表明,MS感染导致气管、足垫、关节、肺、肝脏、肾脏、脾脏、胸腺和法氏囊等器官损伤,复方中药防治显著缓解MS引起的气管黏膜增厚,减少炎性细胞浸润,保护气管黏膜层的结构;改善了足垫组织的血管增生、血管壁增厚以及脂肪细胞结构异常;缓解了关节组织中滑膜的指突状增生和肌腱的炎症浸润;有效改善了MS感染导致的轻度肺损伤,恢复正常的肺组织结构;减少了肝组织中的炎性浸润及肝细胞坏死;明显改善肾小管的萎缩和消失及肾皮质结构紊乱;缓解了脾脏的炎症细胞浸润、核碎裂和核溶解等坏死特征,减少了白髓区域的异常增大;改善了胸腺小体空泡化以及法氏囊髓质结构紊乱,与泰乐菌素治疗效果相当。 6.对复方中药的4种主药进行网络药理学分析,得到886个药物作用靶点,MS有66个靶点,二者的共同靶点有30个。对共同靶点进行分析,GO功能注释主要涉及炎症、凋亡及免疫反应等生物过程,KEGG通路分析主要涉及NF-κB信号通路、Th17细胞分化、炎症性肠病等信号通路。 ***检测肝脏中NF-κB通路相关基因的表达发现,MS感染后,NF-κB通路关键基因TAK1、TLR4、IKKα、IκBα、P50和P65的m RNA表达显著上调,复方中药防治组和治疗组均显著降低其表达量,且与泰乐菌素治疗效果相当,说明复方中药能通过抑制NF-κB信号通路防治MS感染。 ***荧光染色发现,MS感染后肝脏组织凋亡细胞的数量显著上调,复方中药的使用能显著减少凋亡细胞数量。q PCR结果表明,与H组相比,复方中药防治显著下调IL-1β、TNF-α、IL-6、Caspase3、Caspase8和BAX的m RNA表达水平,上调BCL-2的m RNA表达水平。 综上所述,复方中药可通过抑制NF-κB信号通路,显著降低炎症因子和凋亡相关基因的表达,有效缓解MS感染诱导的体增重下降、关节肿胀、器官损伤以及炎症反应,抑制MS增殖,抵抗MS的持续感染。

ISBN: (纸本)9787122440273

关键词： 纳米抗体   硫化铜纳米花   侧流层析免疫试纸条   黄曲霉毒素B1   抗体游离  

摘要： 黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1,AFB1）通常是由黄曲霉和寄生曲霉产生的剧毒次生代谢物。AFB1广泛存在于受污染的农作物中,容易通过食物链进入人身体内,对免疫系统造成损伤或引发癌症。鉴于AFB1分布广泛、污染严重、对人畜危害大、难以去除等特点,迫切需要一种方便灵敏的检测方法。侧流层析免疫试纸条（Lateral Flow Immunoassay,LFIA）与仪器分析法不同,具有测定时间短、成本低、效率高、不需要专业人员操作等优点。传统的LFIA以胶体金（Gold nanoparticles,Au NPs）为信号标签,以单克隆抗体为免疫识别元件,其发展容易受到胶体金低摩尔吸光系数和单克隆抗体低亲和力的限制。信号标签和免疫识别元件是实现高灵敏度LFIA的关键。因此本论文选用显色度更好的硫化铜纳米花（CuS Nanoflowers,CuS NFs）作为信号标签,并在其基础上通过电取代反应合成了CuS NFs-Au复合材料,进一步实现信号放大,提高灵敏度。与单抗相比,纳米抗体具有体积小,稳定性好,亲和力强,易于批量生产的优点,因此采用纳米抗体代替单克隆抗体,提高信号探针的稳定性。本研究以CuS NFs和CuS NFs-Au为信号标签,以固定和游离的纳米抗体G8-DIG为免疫识别元件构建高灵敏度的LFIA用于检测玉米粉中的AFB1。 1.基于CuS NFs和G8-DIG的LFIA检测AFB1。本实验将纳米抗体G8与抗地高辛抗体构建融合表达载体p ET25b-G8-DIG,将其转化至*** BL21中进行原核表达。通过镍柱纯化后,使用SDS-PAGE凝胶电泳确认合成的G8-DIG的分子量在30 k Da左右。合成的融合蛋白G8-DIG具有多功能性,既可以与AFB1抗原结合,也可以与地高辛（Digoxin,DIG）抗原结合,利用DIG-BSA代替传统试纸条上控制线所用的二抗,提高试纸条的稳定性并节约成本。使用三水合硝酸铜和硫脲合成CuS NFs,通过TEM和SEM确认合成的纳米材料为花状结构,尺寸为300 nm左右。通过XPS分析合成材料中含有Cu和S,XRD图样的衍射峰与Cu39S28（JCPD file No.36-0380）的六方相对应,证实了硫化铜纳米花的合成。通过优化该试纸条的最优CuS NFs溶液的浓度、最优G8-DIG添加量、最佳T线浓度,最佳探针量,有效的提升了免疫层析试纸条上T线的信号强度。在最优条件下建立了标准曲线,该方法的LOD为2.4 ng/mL,加标回收率在86～110%之间,CV值小于10.9%。对玉米质控样进行检测,回收率在111.8%。此外利用OTA、T-2、DON和ZEN作为干扰样品对试纸条进行特异性检测,结果表明该方法特异性良好。 2.基于CuS NFs-Au和G8-DIG的LFIA检测AFB1。通过电取代反应合成CuS NFs-Au。该反应可以在CuS NFs表面原位生长金纳米颗粒,不添加任何还原剂,也无需加热。CuS NFs的花状分支结构为Au NPs的原位生长提供了大的比表面积,通过高分辨TEM图可看出CuS NFs花瓣上有粒径较小的颗粒。通过Mapping分析可以得知花瓣上的颗粒为Au NPs。EDS图可以看出合成的材料中含有大量的Cu、S、Au元素,进一步表明CuS NFs-Au的合成。双金属纳米复合材料与单金属纳米材料相比,有更强的显色度,实现了信号放大,从而提高了试纸条的灵敏度。对CuS NFs-Au免疫层析试纸条探针结合p H,最优G8-DIG的添加量进行优化。引入阳性样品对试纸条进行抑制,通过ΔT选择最佳T线浓度和探针量。在最优条件下,该方法的检测范围为2.82～89.56ng/mL,IC10为0.87 ng/mL。与第二章基于CuS NFs免疫层析试纸条相比,灵敏度提高了2.76倍。回收率为81.7～117%,CV值小于11.5%。对玉米质控样进行检测,该方法检测的浓度为0.58 ng/mL,回收率为108%。 3.基于CuS NFs-Au@DIG-BSA和游离G8-DIG的LFIA检测AFB1。与固定在纳米材料上的抗体相比,游离抗体的生物活性更好,布朗运动更快,更容易与检测液中目标物结合。因此将DIG-BSA与CuS NFs-Au结合制备信号标签,纳米抗体G8-DIG处于上样缓冲液中。为了对LFIA进行最优灵敏度评价,优化了CuS NFs-Au的材料体积、DIG-BSA的体积、G8-DIG体积、T线浓度、探针量和反应温度。在最优条件下,该方法的LOD值为0.26 ng/mL,检测范围为0.51～63.3 ng/mL。与第三章基于CuS NFs-Au免疫层析试纸条相比,灵敏度提高了3.35倍。对特异性进行评价,用该方法检测5种真菌毒素,结果表明该试纸条只对AFB1有

关键词： 核酸适配体传感器   GO   GO-Fe3O4   结构转换   纳米酶   金黄色葡萄球菌肠毒素A   黄曲霉毒素B1  

摘要： 食品安全监测是全球性议题,备受消费者关注。构建新型快检方法是保障食品安全和公众健康的重要技术手段。传统仪器分析法和免疫学法因具有高可靠性和高灵敏度被广泛应用,但仍受限于高成本和繁琐操作。作为传统方法的补充,基于核酸适配体（Aptamer）识别探针的生物传感器被广泛开发,在提升检测性能的同时,兼顾降低成本和检测时效。目前,基于核酸适配体检测方案的设计多针对特定靶标,在提升方法的广泛适用能力方面仍面临一定挑战。结构转换适配体（Structure-switching aptamers,SSA）是利用适配体结构开关性质传导靶分子识别的通用技术。适配体既能与靶标分子形成复合物,也能与互补序列形成双螺旋,可通过靶标诱导使两种状态间发生结构转换过程,但方法存在不适用于低亲和力或长序列适配体的弊端有待改进。因此,本论文基于核酸适配体的特异性识别能力,结合氧化石墨烯（Graphene oxide,GO）和GO-Fe3O4对核酸的吸附分离能力以及核酸适配体结构转换设计,分别以食品中的金黄色葡萄球菌肠毒素A（Staphylococcal enterotoxin A,SEA）和黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1,AFB1）为分析物代表,设计检测方法并探究方案细节和机理机制,提升方法的检测性能,改进方法设计的通用性。论文的主要研究内容和结果如下: （1）利用GO对单链DNA（single-stranded DNA,ss DNA）的吸附和离心分离的作用探索GO对体系荧光的干扰,结合核酸适配体结构转换设计,以双链DNA（double-stranded DNA,ds DNA）敏感染色的SYBR Green I染料作为荧光探针,构建可灵敏检测SEA的无标记荧光适配体传感方法。GO通过吸附和离心分离去除溶液中的游离适配体,保留aptamer/SEA复合物。利用长序列互补DNA（complementary DNA,c DNA）与适配体的结合力强于适配体与靶标结合力的特点,实现以c DNA诱导的从aptamer/SEA复合物向ds DNA的结构转换,提升设计的便捷性、稳定性和通用性。形成的ds DNA放大SYBR Green I荧光探针的信号输出强度,有效避免aptamer/SEA复合物在反应中可能出现的结合不稳定情况,保证信号的稳定输出。利用二次加入GO吸附、分离游离c DNA,进一步降低背景、提高灵敏度。方法具有宽的线性范围（1-8000 ng/m L）和低的检出限（0.899ng/m L）,并实现对牛奶和奶粉中SEA的灵敏检测。该方法对扩展GO在基于核酸适配体的荧光方法开发中的应用具有指导意义。 （2）合成具有优异磁性分离能力的GO-Fe3O4复合材料以改进上述方法中分离GO所需的离心操作,简化操作步骤。同时,复合材料优异的类过氧化物酶活性能扩展其在比色核酸适配体传感器中的应用。因此,本研究通过氨共沉淀法制备具有丰富官能团的GO-Fe3O4复合材料,并解析ss DNA与GO-Fe3O4间的相互作用机制和催化机理。结果表明,GO-Fe3O4与ss DNA间主要受π-π堆积和静电相互作用的影响,疏水相互作用、范德华力和氢键作用力也一定程度上影响二者间的吸附。ss DNA可通过增加GO-Fe3O4表面的负电荷进而增强GO-Fe3O4对正电底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺（3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine,TMB）的亲和力,实现对GO-Fe3O4的类过氧化物酶活性的增强效果。以上研究结果将为构建基于ss DNA调控GO-Fe3O4类酶活性的传感器开发提供扎实的理论基础。 （3）单一模式的荧光分析方法应用广泛但结果准确性易受环境和基质干扰,一定程度上限制方法的准确性和应用范围。因此,本研究利用GO-Fe3O4的吸附、磁性分离、类过氧化物酶催化等多功能特性,构建一种新型比率荧光/比色双模式可视化分析平台灵敏检测AFB1。采用荧光染料（7-Amino-4-methylcoumarin-3-acetic acid-NHS ester,AMCA）标记的适配体（AMCA-aptamer）特异性识别AFB1,然后基于GO-Fe3O4对AMCA-aptamer的吸附和磁性分离特性,分离AMCA-aptamer/AFB1和AMCA-aptamer/GO-Fe3O4,并分别用于比率荧光和比色模式分析。通过可合成铜纳米粒子（Cu NPs）的茎部聚AT/TA序列的发夹DNA与AMCA-aptamer/AFB1间的结构转换,实现单波长激发下的比率荧光信号输出,以进行内置荧光校正,增强体系的抗干扰能力。通过AMCA-aptamer调控GO-Fe3O4的类过氧化物酶活性,实现比色信号输出。两种模式结果相互验证,进一步改善方法的可靠性和特异性。通过Imag

关键词： 黄曲霉毒素B1   生物学特性   降解机理   应用  

摘要： 黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1,AFB1）是由黄曲霉和寄生曲霉生长代谢产生的次级代谢产物,是具有强致畸性、强致癌性、强致突变性及强肝毒性的一种真菌毒素。AFB1普遍存在于土壤、粮油、坚果及乳制品中,尤其在潮湿的环境中食品和饲料十分容易被污染。因此,探究如何高效降解AFB1的方法已成为现阶段的研究热点。降解AFB1的主要方法有物理法、化学法和生物法,而利用生物法降解AFB1具有高效、绿色、环保及作用条件温和等特性,且有较高的特异性。因此,选用生物法降解AFB1是较为合适的解毒方法。本研究选用微生物降解AFB1,筛选出一株可降解AFB1的菌株,探究该菌株的部分生物学特性,并对其降解AFB1的机理进行初步探究,将可降解AFB1的菌株应用于以燕麦麸为基质的固态发酵中,具体研究结果如下: （1）以香豆素为唯一碳源、AFB1的降解率为指标,筛选出一株对降解AFB1降解为78.37%的Bacilus haynesii strain LM4。 （2）生长曲线表明菌株LM4的对数生长期为2～12h,生长稳定期为12～24h。对酸、胆盐及人工胃肠液的结果表明,在p H分别为2.5、3.0、3.5、4.0的PBS溶液中作用3h后,存活率分别为39.70%、47.57%、58.8%、72.10%;在胆盐浓度分别为0.1%、0.2%、0.3%的LB培养基中作用3h后,存活率分别为76.77%、56.36%、47.37%;在人工胃液中作用3h后,存活率为56.50%,在人工肠液中作用8h后,存活率为43.30%。溶血性实验表明,菌株LM4并未出现溶血环。抑菌实验表明,菌株LM4对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、单增李斯特菌均能产生抑菌特性。 （3）菌株LM4发酵上清液对AFB1的降解率显著高于菌悬液和胞内液（P<0.05）。通过沸水浴、蛋白酶K和蛋白酶K+SDS等处理发酵上清液后AFB1降解率的变化,分析发酵上清液中的活性成分是具有良好热稳定性的酶。通过紫外光谱、荧光光谱和TLC发现降解后的AFB1荧光性减弱,通过LC-MS/MS分析,未明确已报道的降解产物及途径。 （4）以燕麦麸为发酵基质进行固态发酵,测定菌株LM4在燕麦麸中AFB1的降解效果,探究筛选的可降解AFB1的菌株LM4的应用效果。通过正交试验确定菌株LM4固态发酵燕麦麸降解AFB1的最佳发酵条件为:料水比1:1、接种量1.0%,发酵时间48h,发酵温度37℃。 通过研究,筛选出降解AFB1效果较好的菌株LM4,并明确菌株LM4在酸、胆盐和人工胃肠液中的耐受性、溶血性及对有害菌的抑制效果。探究了菌株LM4降解AFB1的初步机理。获取了菌株LM4固态发酵燕麦麸降解AFB1的最佳发酵条件,为微生物降解AFB1提供了新的菌种来源,也为提高农副产品在饲料中的利用率提供参考。

关键词： 黄曲霉毒素B1   胶体金   陈皮   多功能净化柱  

摘要： 目的：探索中药材陈皮黄曲霉毒素B1胶体金快速检测中假阳性的解决方法，以提高准确率。方法：根据中药基质的干扰来源，首次在胶体金快检前处理方法中引入多功能净化柱快速除杂步骤，并结合高效液相色谱法对快检结果进行验证。结果：多功能净化柱净化能排除油脂、色素、蛋白的干扰，在不降低灵敏度的同时显著降低胶体金试纸条的假阳性率。考察23种药材共计400批次，假阳性率为2%，假阴性率为0。结论：免疫胶体金法快速检测中药陈皮黄曲霉毒素B1前处理步骤中增加固相萃取除杂步骤的操作简便，结果稳定可靠，可作为解决中药复杂基质胶体金快检假阳性的方案。