关键词：
中药
黄曲霉毒素B1
胶体金试纸条
适配子
现场可视化检测
摘要：
胶体金免疫层析技术是将特异性的抗原或抗体以条带状固定在硝酸纤维素膜(NC)上,以胶体金为标记物可达到肉眼观察的新型检测技术。该技术能在非实验室条件下快速呈现检测结果,具有操作简单、省时、省力、低成本的优点,可用于目标物的现场快速检测,已在医学、毒品、激素、食品安全检测等领域得到广泛应用,在真菌毒素检测方面多集中于食品、饲料等基质,在中药真菌毒素检测的报道非常少。作为黄曲霉毒素中毒性最强、且被世界卫生组织癌症研究机构列为Ι类致癌物的黄曲霉毒素B1(AFB1)已被报道在中药材中的发生率和残留量均较高,从而影响药材的质量和安全性。目前对中药材中AFB1的研究主要集中于实验室检测方法的开发,使用的仪器笨重、样品前处理步骤复杂,且操作繁琐,而中药材在种植、采收、加工和储藏过程中均存在AFB1污染的风险,所以,建立适合中药材中AFB1现场快速筛查的分析方法以方便、快捷地评价中药材AFB1的残留情况,对保障药材质量和安全性及使用者的身体健康具有重要意义。为此,本文基于抗原抗体的特异反应,自制了胶体金试纸条,并用于大批量中药材样品中AFB1的快速筛查,不仅样品前处理过程简单,且操作简单、可视化检测,满足了现场快速检测的要求。进而,基于新型抗体替代材料-适配体的高特异性和强亲和力优势,本文以适配体识别元件,克服抗体的一些固有缺陷,自组装了胶体金适配子试纸条,尝试用于中药材中AFB1的现场可视化快速筛查,为后期研究奠定基础。主要研究内容和结论如下:1.制备胶体金颗粒,优化AFB1适配体序列,为构建可视化检测试纸条奠定基础。采用柠檬酸三钠还原法,通过比较柠檬酸三钠加入量,优化搅拌速度、沸腾后加热时间等关键参数,制备胶体金颗粒,并通过紫外可见光谱扫描和透射电镜对胶体金颗粒进行表征。构建可视化检测方法,并通过对盐浓度、适配体浓度等关键因素进行优化,确定最佳检测条件,优化AFB1适配体序列,为自组装胶体金可视化试纸条奠定基础。2.自组装可用于现场可视化检测中药中AFB1的胶体金试纸条。选取前期合成的粒径16.70～40.10 nm范围的胶体金溶液标记AFB1单克隆抗体,通过对不同粒径胶体金制备试纸条的工艺进行优化,并对各试纸条性能进行评价,自组装基于竞争法原理的黄曲霉毒素胶体金试纸条。研究发现,采用粒径为17.4 nm胶体金制备的试纸条的灵敏度最高,检测限为0.1 ng/mL,cut-off值为1 ng/mL,检测时间为20 min。3.采用自组装的胶体金试纸条快速可视化检测4种中药材中黄曲霉毒素的污染水平。通过优化提取溶剂及稀释配比等,采用合适的样品前处理技术制备4种中药材样品,同时探讨样品基质对胶体金试纸条检测的影响。确定最佳的样品制备方法为:茯苓、天麻药材采用70%甲醇-水提取,稀释3倍;白及采用60%甲醇为提取溶剂,稀释4倍;白芷以70%甲醇-PBS为提取溶剂,稀释4倍;胶体金试纸条检测天麻、茯苓、白及、白芷的检测限分别是5μg/kg、5μg/kg、3.125μg/kg、1.25μg/kg,满足限量标准5μg/kg的检测要求。同时建立了检测中药中黄曲霉毒素B1的UFLC-MS-MS方法,AFB1线性相关系数分别为0.9967～0.9995。AFB1高中低三个添加水平的回收率在88.91～96.34%之间,相对标准偏差在1.1～2.3之间。采用所建立的UFLC-MS-MS方法验证了免疫层析分析方法样品检测结果。4.基于新型抗体替代材料-适配体的高特异性和强亲和力优势,尝试自组装胶体金适配子试纸条。以胶体金标记适配体作为探针,通过优化金标核酸适配体的偶联比、重悬液体系、硝酸纤维素膜和结合垫上点样量等条件,自组装基于竞争法原理检测AFB1的胶体金适配子试纸条。核酸加入量为3μL,10 mM PBS(1%蔗糖,0.02%MgSO4,0.1%Tween 20)的溶液体系下,采用Vivid 90硝酸纤维素膜,肉眼检测限为0.5μg/mL,检测时间17 min,为今后深入研究奠定了基础。
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