关键词： 黄曲霉   黄曲霉毒素B1   M2M   转录因子Af Mcm6及AfSreA   DNA损伤  

摘要： 黄曲霉(Aspergillus flavus)广泛污染玉米、花生和小麦等重要农作物,在储藏和加工过程中污染多种食品,其产生的黄曲霉毒素具有强烈的毒性和致癌性,严重威胁食品安全和人类健康。据报道,全球多达28%的原发性肝细胞癌由黄曲霉毒素引起;我国四川、湖北、广东等高温高湿地区种植的玉米,黄曲霉毒素阳性率超过90%,农产品中黄曲霉毒素超标问题已经严重影响我国食品加工行业的产品质量、食用安全性及相关产品的对外出口。目前,对于控制农产品黄曲霉危害及黄曲霉毒素污染尚缺乏令人满意的方法。化学防治仍是目前控制黄曲霉污染的主要策略。因此,开发绿色、高效、高特异性的杀菌剂以防控黄曲霉及黄曲霉毒素污染,对保障食品安全具有重要意义。2-甲基丁酸甲酯(M2M)是国标(GB 2760—1996)规定的食品添加剂,对多种细菌及真菌具有广谱抗菌特性,但对黄曲霉的作用缺乏报道。本研究针对这一问题展开研究,研究M2M对黄曲霉及黄曲霉毒素的抑制作用;探索M2M抑制黄曲霉及黄曲霉毒素的机制。主要研究结果如下: (1)M2M显著抑制黄曲霉生长及黄曲霉毒素B1的产生。 通过生理生化指标分析表明,M2M能够显著抑制黄曲霉的生长、产孢、产毒及菌核形成。其中,M2M对黄曲霉的最小抑制浓度(MIC)为2.0μL/m L,其以剂量依赖性方式抑制黄曲霉的生长发育及产毒。 (2)M2M通过破坏细胞壁、细胞膜、降低ATP水平、诱导ROS积累及DNA损伤进而抑制黄曲霉的生长。 收集用1/2 MIC处理过的黄曲霉菌丝进行转录组分析,结果显示,与对照菌株相比,共有2899个显著差异表达基因(DEGs)(1439个上调,1460个下调)。这些DEGs主要集中在AFB1生物合成、孢子萌发、细胞壁及细胞膜的形成、糖酵解、TCA循环、氧化应激、DNA损伤等生物途径。实时荧光定量PCR(RT-q PCR)结果表明黄曲霉毒素生物合成途径相关基因afl B、afl C、afl H、afl R的转录水平下调,与转录组结果一致,表明M2M通过下调AFB1生物合成途径中afl B、afl C、afl H、afl R基因表达进而抑制AFB1合成。此外,生理生化指标结果表明,M2M破坏了黄曲霉细胞壁和细胞膜的完整性,降低胞内ATP含量,诱导菌丝ROS的积累和DNA损伤,与转录组结果一致。 (3)敲除转录因子AfSreA显著抑制黄曲霉生长及产量。 我们通过同源重组技术构建GATA型锌指转录因子AfSreA(AFLA＿132440)的缺失菌株,并分析其对黄曲霉生长的影响。结果显示,敲除AfSreA显著抑制黄曲霉的生长、黄曲霉毒素B1的合成、菌核的产生及黄曲霉致病性。刚果红试验表明,AfSreA缺失破坏黄曲霉细胞壁完整性,表明敲除AfSreA通过破坏细胞壁完整性抑制黄曲霉生长;RT-q PCR结果显示AfSreA缺失显著抑制了afl B、afl C、afl E、afl H、afl K、afl L、afl R基因的表达水平。表明AfSreA通过抑制AFB1生物合成途径基因表达进而抑制黄曲霉生长及产毒。 (4)敲除转录因子AfMcm6通过下调AfFui1基因表达诱导黄曲霉DNA损伤,进而显著抑制黄曲霉生长和产毒。 我们首先通过同源重组技术构建转录因子AfMcm6(AFLA＿119250)的缺失及回补菌株,证实了该基因缺失能够诱导DNA损伤,同时显著抑制了黄曲霉的生长、产孢及产毒。对AfMcm6缺失前后的菌株进行转录组分析发现,黄曲霉中编码尿嘧啶/尿苷透过酶的同源基因AfFui1(AFLA＿072600)表达水平显著下降。TUNEL染色结果表明,敲除AfFui1仍可诱导黄曲霉DNA损伤,且抑制黄曲霉生长和产毒。因此,我们认为转录因子AfMcm6调控AfFui1参与诱导黄曲霉DNA损伤,从而抑制黄曲霉的生长和产毒。 综上所述,本研究在明确M2M显著抑制黄曲霉及黄曲霉毒素产生的基础上,通过转录组分析结合生理生化指标进一步揭示了M2M抗黄曲霉的作用机理,同时筛选到有效的转录因子,并解析其功能,为开发新型高特异性杀菌剂,以防控黄曲霉污染提供理论依据。

关键词： 真菌毒素   黄曲霉毒素B1   酶-金属复合催化剂   化学-生物级联反应   花生油   靶向脱除  

摘要： 真菌毒素污染是谷物、植物油、饲料等食品安全的重要问题。真菌毒素污染不仅对人类健康构成严重威胁,而且在全球范围内产生了巨大经济损失。开发绿色高效的真菌毒素靶向脱除技术,对保证食品质量安全具有重要理论和实际意义。化学法脱除真菌毒素具有高效性,但是可能造成食品二次污染和营养成分破坏。生物法具有特异性,由于酶的活性和稳定性限制了其在食品中的广泛应用。本论文提出了基于酶驱动芬顿反应的真菌毒素降解新技术,融合生物法和化学法的强特异性和高效的优点,针对酶催化和金属催化反应在同一条件下难以高效进行的瓶颈问题,提出了将酶与金属催化剂分层固定在纳米花状介孔共价有机骨架材料（COFs）的酶-金属复合催化剂构筑新策略,实现了花生油中黄曲霉毒素B1（AFB1）的高效靶向脱除。 首先,分别利用原位还原法和共价结合法将金属颗粒（Fe3O4NPs）和葡萄糖氧化酶（GOx）分区域共同固定在纳米花状介孔COFs上,合成酶-金属复合催化剂GOx-Fe3O4@COF。利用COFs的限域效应和酶与金属的邻近效应,调控反应微环境,实现了酶与金属催化剂的兼容性和高活性。GOx-Fe3O4@COF在3.0～7.0的广泛p H范围内具有高活性,克服了传统芬顿反应只能在p H 3.0以下进行的限制。COFs的限域效应有利于底物富集和中间体局部浓度提高。GOx-Fe3O4@COF催化化学-生物级联反应对AFB1的降解效率是Fe3O4@COF催化传统芬顿反应的6.8倍。GOx-Fe3O4@COF具有良好的重复使用性和稳定性,AFB1降解产物对肾细胞和肝细胞无毒。 针对酶在油相催化性能差的难题,进一步通过席夫碱反应在GOx-Fe3O4@COF表面修饰生物相容的双亲性聚合物pluronic F127,合成双亲性酶-金属复合催化剂PL-GOx-Fe3O4@COF,用于花生油中AFB1去除。催化剂表面的双亲性聚合物提高了酶分子表面必需水的保留率以及酶在油水界面的分散性。经过双亲性聚合物修饰的酶在花生油中的催化活性是游离酶活性的3倍。基于COFs对AFB1的特异性吸附和限域效应,PL-GOx-Fe3O4@COF可以高效、绿色靶向去除花生油中AFB1。PL-GOx-Fe3O4@COF催化的化学-生物级联反应降解AFB1的效率是使用GOx与Fe3O4组合催化剂的6倍。PL-GOx-Fe3O4@COF具有良好的重复使用性和稳定性。处理后的花生油对肾细胞和肝细胞无毒。并且花生油品质无明显变化,未发现催化剂泄漏。该研究为食用油中真菌毒素的靶向脱除提供了新技术,同时为构建高效界面酶-金属复合催化剂提供了理论基础。

关键词： 真菌毒素检测   黄曲霉毒素B1   免疫传感器   有机电化学晶体管  

摘要： 粮食在储藏过程中极易受到真菌毒素的污染,黄曲霉毒素是储粮中常见的一种真菌毒素,其中黄曲霉毒素B1(Aflatoxin B1,AFB1)是一种毒性较高的致癌物质,食用后会对人体健康造成严重危害,在粮食安全领域引起了广泛的关注,因此对储粮中AFB1含量的精确检测具有重要意义。传统的检测方法通常存在检测过程复杂、耗时长、成本高等缺点,为了简便快速、低成本、高灵敏检测储粮中AFB1的含量,本文提出了基于垂直有机电化学晶体管(Vertical organic electrochemical transistors,vOECT)生物传感器的AFB1检测方法,与电化学免疫传感器相比,具有制备简单、选择性好、灵敏度高以及检测限低的优点。本文主要研究内容如下: (1)制备了基于壳聚糖-石墨烯(Chitosan-Graphene nanosheets,CS-GNs)纳米复合材料的电化学免疫传感器。利用壳聚糖的良好分散性和生物相容性,将导电性能优异的石墨烯均匀的分散于壳聚糖溶液中,形成均匀的CS-GNs纳米复合材料。在玻碳电极上通过层层自组装方式修饰CS-GNs纳米复合材料、AFB1抗体和牛血清蛋白(Bovine serum albumin,BSA),制备了基于CS-GNs纳米复合材料的电化学免疫传感器,用于玉米样品中AFB1含量的检测。实验结果表明,在最优条件(抗体浓度为150μg/mL,测试底液pH为7.0,抗体孵育时间为50min,免疫反应时间为40min)下,传感器的检测限可低至0.021ng/mL,灵敏度达到0.822μA/dec,在玉米样品中的加标回收率为97.3%～101.4%,表现出了优异的稳定性和选择性。 (2)为了进一步提高储粮真菌毒素AFB1检测的灵敏度,制备了基于垂直有机电化学晶体管(vOECT)的高性能真菌毒素免疫生物传感器。结合蒸镀、旋涂和紫外光刻等微纳加工工艺,制备了具有超高跨导(94mS)和出色放大性能的vOECT器件;结合层层自组装技术,采用玻碳电极和金盘电极作为敏感电极,制备了基于vOECT的超高性能免疫生物传感器,用于检测玉米样品中AFB1的浓度。实验结果表明,该免疫生物传感器的检测限可低至0.01fg/mL,且具有超高灵敏度,灵敏度达到1mA/dec,灵敏度比已报道文献高出2个数量级,检测限比已报道文献的低约3个数量级,实现了AFB1超低检测限和超高灵敏度的检测。在玉米样品中的加标回收率为96.23%～101.18%,同时也展现出了优异的稳定性和选择性。