关键词： 球虫   黄曲霉毒素B1   肉品质   糖酵解   羊肉   代谢组  

摘要： 近年来,随着我国居民收入水平的不断提高和生活方式的转变,我国羊肉消费市场快速发展,羊肉健康安全的营养特性得到广泛认可,羊肉的消费量稳步增长。消费者在购买肉制品时,主要关注的是肉质。而饲料霉变和球虫感染是绵羊养殖生产过程中常见的不良影响因素,可能会对绵羊肉品质产生不利影响。霉变饲料可引起动物肠道疾病,食用霉变饲料会诱发氧化应激、免疫抑制、生产性能下降等问题,可能会对肉质产生影响。此外,球虫感染是绵羊的一种常见寄生虫病,表现为腹泻和采食量减少,产肉量降低,甚至死亡。然而,在霉菌毒素胁迫下,球虫如何影响绵羊的肌肉发育,目前尚未见报道。因此,本试验旨在探究球虫和黄曲霉毒素对羊肉品质的影响,以及其作用机理,为动物的饲养管理和疾病防控提供指导。试验选用50日龄湖羊16只;所有的羊都是雌性的。在试验开始前两周,所有绵羊都灌服了地克珠利以清除体内的球虫。经过适应性饲喂后,将试验动物随机分为对照组（CON）、球虫处理组（EO）、黄曲霉毒素B1处理组（AFB1）、球虫和AFB1共同处理组（EO+AFB1）。在试验开始的第1天,EO组绵羊单次灌服2万个类绵羊艾美尔球虫卵囊,AFB1组绵羊每日灌服60μg/kg AFB1直至处死,EO+AFB1组给予EO和AFB1叠加处理。饲喂相同饲粮,试验期15天,各组羊单独饲养。分别于第0、7、10、11、12、13、14、15天采集绵羊粪便,用Mc Master的方法检测每克粪便中卵囊的数量（OPG）以观测球虫的排出高峰期,在球虫卵囊排出高峰期附近对绵羊进行屠宰。试验结束后,麻醉处死所有绵羊,取位于最后和倒数第二胸椎之间的背腰最长肌。 研究一:球虫和AFB1对肌肉生长以及肉品质的影响 为了探究球虫和AFB1对肌肉生长以及肉品质的影响,对羊肉进行组织病理学观察和肉品质相关指标检测,包括p H,肉色,气味特征,持水性,剪切力,水分分布,口感质地,蛋白质二级结构等,结果如下所示: （1）球虫和AFB1对绵羊肌肉生长和组织产生了损害。球虫感染和AFB1处理后,肌肉组织纤维的横截面积减小,肌纤维之间的间隙增大,并且肌肉的生长受到抑制。 （2）球虫和AFB1的处理改变了羊肉的p H,肉色。p H计的测定结果显示羊肉的p H24h没有较大差异,EO组的p H45min较对照组升高,AFB1组和EO+AFB1组的p H45min较对照组下降。肉色分析仪测定结果显示处理组羊肉的红度下降。 （3）球虫和AFB1的处理改变了羊肉的气味特征。电子鼻的主成分分析（principal component analysis,PCA）结果显示,EO+AFB1组与CON组之间的距离较远,表明煮后肉样之间的气味构成差别较大,羊肉煮制后香气主要差异为烷类,无机硫化物,有机硫化物、芳烃化合物。 （4）球虫和AFB1的处理改变了羊肉持水性和剪切力。与CON组相比,处理组的滴水损失减少,蒸煮损失增加,剪切力下降。 （5）球虫和AFB1的处理改变了羊肉组织的水分分布。与CON组相比,AFB1组的结合水显著增加（p<0.01）;与EO组相比,EO+AFB1组的结合水显著增加（p<0.05）。与CON组相比,EO+AFB1组的游离水显著增多。处理组的不易流动水较CON组减少。 （6）球虫和AFB1的处理改变了羊肉的口感质地。与CON组相比,处理组的胶着性,回复性和咀嚼性增加。 （7）球虫和AFB1的处理改变了羊肉的蛋白质二级结构。处理组的β-转角结构占比较CON组增加;与CON组相比,EO+AFB1组的β-折叠增加。 研究二:基于代谢组学探究球虫和AFB1对绵羊肌肉组织代谢物的影响 为探究球虫和AFB1联合引起绵羊肌肉品质破坏背后肌肉改变的物质基础,试验采取非靶代谢组学技术对绵羊肌肉组织进行代谢物分析,挖掘导致羊肉品质发生改变的关键代谢物质以及富集的信号途径。结果如下所示: （1）球虫感染和AFB1处理对羊肉代谢物的组成产生影响。 （2）筛选出的差异代谢产物与肉品质指标之间存在密切联系。 （3）将筛选出的差异代谢物进行KEGG通路注释和网络关联性分析,发现所注释到通路与糖酵解和三羧酸循环有密切关联性。 研究三:研究EO和AFB1处理对肉品质影响的作用机制 为进一步研究EO和AFB1联合引起羊肉代谢物质改变的潜在调控机制,对绵羊肌肉组织进行转录组测序分析,然后通过蛋白免疫印迹（Western blotting,WB）和实时荧光定量（Quantitative real time polymerase chain reaction,q RT-PCR）技术对筛选出的关键信号通路以及参与氧化应激和炎症的关键分子进行检测。结果如下所示: （1）球虫感染和AFB1处理通过PI3K/AKT/HIF-1α调控HK2的表达,加快了糖酵解的进程,从

关键词： 核酸适配体传感器   置换型荧光探针   硫磺素T   赭曲霉毒素A   黄曲霉毒素B1   腺苷  

摘要： 利用硫磺素T(ThT)作为置换型荧光探针，分别构建了3种核酸适配体生物传感器，用于赭曲霉毒素A(OTA)、黄曲霉毒素B1(AFB1)和腺苷(Adenosine)3种生物小分子的快速检测。当靶标分子不存在时，ThT与核酸适配体结合形成复合物，具有较强的荧光响应；加入靶标分子后，ThT的荧光强度减弱，通过监测荧光信号的变化实现对靶标分子的定量检测。详细探究了检测机理，圆二色光谱分析结果表明，加入ThT和靶标分子后，核酸适配体的构象没有明显变化，只是此构象比例增加，因此系统的荧光强度的降低并非由于靶标诱导核酸适配体结构变化，而是因为分子置换作用所致；通过等摩尔连续变化法测定ThT与OTA、AFB1、腺苷的核酸适配体的化学计量比分别为1∶1、1∶1和2∶1，并且解离常数均大于靶标分子与核酸适配体的解离常数。因此，本方法的检测原理是靶标分子置换与核酸适配体结合的荧光探针(ThT)，通过测定被靶标分子置换出的ThT荧光强度的变化实现对靶标分子的定量检测。在最优实验条件下，3种小分子的检出限分别为0.8 nmol/L (OTA)、1.3 nmol/L (AFB1)和0.1μmol/L (腺苷)。本方法无需标记、操作简单、检测成本低，具有良好的选择性和较低的检出限。进一步开发了基于本方法的检测试剂盒，可用于实际样品中3种生物小分子的检测。

关键词： 染料脱色过氧化物酶   黄曲霉毒素B1   玉米赤霉烯酮   脱氧雪腐镰刀菌烯醇   脱毒  

摘要： 真菌毒素是由真菌产生的次级代谢产物,存在于谷类作物和饲料中,是危害饲料和食品质量安全的重要因素;因此,迫切需要一种绿色有效的脱毒策略来解决真菌毒素的污染问题。木质素降解酶是一类可以降解真菌毒素的酶,但木质素降解酶对真菌毒素的脱毒机理尚不清楚。本研究对不同家族来源的染料脱色过氧化物酶进行高效重组表达,并对其降解主要真菌毒素的能力进行评价,鉴定主要真菌毒素的降解产物,阐明真菌毒素降解产物的生物学毒性效果,主要结论如下: 首先,本研究借助于分子伴侣共表达系统在大肠杆菌宿主中实现了对来源于I、P和V类染料脱色过氧化物酶的高效重组表达。通过对染料脱色过氧化物酶的生化特性表征发现,不同家族的染料脱色过氧化物酶可以氧化模式底物ABTS、酚类化合物DMP和GUA,Mn2+、蒽醌染料RB19,并表现出类锰过氧化物酶的催化特性。 其次,染料脱色过氧化物酶在介体存在时能实现对黄曲霉毒素B1（AFB1）、玉米赤霉烯酮（ZEN）和呕吐毒素（DON）的高效降解能力。Mn2+存在时,染料脱色过氧化物酶对三种真菌毒素的降解率在48 h时在60%以上;1-HBT存在时,染料脱色过氧化物酶对ZEN的降解率在48 h达到70%以上。 然后,利用液质联用技术解析了不同家族染料脱色过氧化物酶降解主要真菌毒素的产物。不同家族染料脱色过氧化物酶对AFB1的降解途径主要为C3羟基化作用,以及C8-9双键的氧化和水解作用,对ZEN的降解途径主要包括羟基化、水解和开环作用,对DON的降解途径主要为羟基化和苯环双键的开环作用。 最后,不同家族的染料脱色过氧化物酶对AFB1、ZEN和DON的降解产物的生物学毒性显著降低。染料脱色过氧化物酶对AFB1的降解产物的细胞存活率提高15%以上,ZEN降解产物的细胞存活率提高25%以上,BsDyP和BaDyP对DON的降解产物的细胞存活率分别提高26.36%和28.78%。 综上所述,在本研究中,不同家族来源的染料脱色过氧化物酶在介体Mn2+和1-HBT存在时可以显著提高其对真菌毒素AFB1、ZEN、DON的降解能力,并且,AFB1、ZEN、DON的降解产物生物学毒性显著降低,为饲料中真菌毒素的脱毒提供技术支持。

关键词： 多功能过氧化物酶   理性设计   霉菌毒素降解   黄曲霉毒素B1   玉米赤酶烯酮  

摘要： 霉菌毒素作为霉菌在生长过程中产生的次级代谢物,对人类和动物的健康构成了不容忽视的威胁。为了有效应对这一威胁,科研人员积极探索多种脱毒方法,其中,酶法脱毒因其环境友好的特性而受到广泛关注。然而,当前已有的霉菌毒素降解酶在应对多种霉菌毒素污染时,其脱毒效果并未达到预期的水平。鉴于此,本研究选取了四种不同来源的多功能过氧化物酶并成功实现了这些酶在毕赤酵母中的高效表达。选取了其中表达量最可观的一条酶基因进行理性设计以提高其表达量、酶学性质等,旨在实现对霉菌毒素的高效降解,具体研究过程与结果如下所述: 本研究成功实现已经报道并成功实现异源表达具有酶活的四种不同来源多功能过氧化物酶在毕赤酵母中表达并通过摇瓶发酵筛选出表达量最好的Pleurotus sapidus来源的Ple进行理性设计。 基于Ple的蛋白质结构进行精确设计,完成了Y69F、L71I、R75D三个单点突变,成功使突变体Ple-gold展示出更好的催化能力及酶活性质,研究表明:突变体Ple-gold酶活达到2.981×10～4U/L,与野生型酶活相比提高了207.31%;酶学性质方面,野生型和突变体的最适反应p H均为4,最适反应温度均为37℃,而在热稳定性方面,野生型Ple在55℃条件下明显失活,而突变体Ple-gold在65℃下仍有4.8%的残余活性,p H稳定性方面,突变体Ple-gold在p H 2～11范围内孵育30 min,残余活性均在47%以上。总的来说,突变体Ple-gold的酶活、酶学性质相较野生型得到显著提升,符合理性设计的预期。 在应用方面,研究了野生型与突变体对黄曲霉毒素B1和玉米赤酶烯酮的降解,通过HPLC分析,突变体Ple-gold可做到对黄曲霉毒素B1的完全降解,对玉米赤酶烯酮降解率达到37.68%。经LC-MS分析,突变体Ple-gold成功将黄曲霉毒素B1、玉米赤酶烯酮降解为低毒产物。同时研究了多功能过氧化物酶对靛蓝的脱色能力,结果突变体Ple-gold实现对靛蓝的完全脱色,这也为多功能过氧化物酶不仅在霉菌毒素脱毒方面且在工业中的广泛应用提供了重要参考。 为进一步提高突变体酶的表达量,本研究成功构建突变体Ple-gold的二拷贝菌株,测定出二拷贝菌株的酶活为3.639×10～4U/L,较单拷贝酶活提高了22.07%。对二拷贝菌株进行高密度发酵,上罐发酵至110 h时,纯化后的酶上清液酶活达到1.273×10～5U/L,即成功通过多拷贝菌株的构建提高酶的表达量,为多功能过氧化物酶的产业化及工业应用奠定了基础。

摘要： 何为中药制剂？何为中药制剂？这是一些患者不明白的问题，在他们看来，中药就是中药，主要指汤剂。西药就是各种片剂或是胶囊剂，还有一些冲剂。站在医学角度上分析，中药制剂其实是将中医药理论作为指导，有效传承传统中药制剂方法，但又应用现代科学理论技术制作而成的药物。这一类药物其实是人们预防、治疗疾病的常用物质，是否准确应用药物，直接影响用药者的身体健康。

关键词： 绵羊   黄曲霉毒素B1   球虫病   生殖毒性   肠道菌群  

摘要： 谷物和动物饲料在世界范围内经常受到霉菌毒素污染,黄曲霉毒素是最常见的霉菌毒素之一,摄入后影响机体各器官的功能,严重威胁着畜禽的健康。球虫病是一种绵羊常发的传染性寄生虫病,主要导致幼龄动物腹泻和生长迟缓,极大地限制了绵羊养殖业的发展。黄曲霉毒素B1(Aflatoxin B1,AFB1)暴露已被证明能够破坏动物生殖系统功能,然而,联合球虫感染对反刍动物生殖系统的损害尚未被关注。因此,本研究以绵羊为大型动物模型,探究AFB1和球虫联合通过肠道-血液-生殖轴对绵羊生殖系统的毒性作用。 随机挑选100只35日龄健康断奶母湖羊,灌服地克珠利溶液1 mg/kg,每日一次连续两天,驱除可能感染的球虫。用药后第11天对每只绵羊进行直肠采样并显微镜检测,连续检测3天。最终选取16只体重在8-12 kg无球虫感染的健康雌性湖羊,随机分为对照组(Con)、AFB1暴露组(AFB1)、球虫组(E.o)和联合处理组(AFB1+E.o)。Con组灌服等量DMSO和生理盐水。AFB1组灌服AFB1 60μg/kg。E.o组灌服2×10～4孢子化卵囊(仅第0天)。AFB1+E.o组灌服AFB1 60μg/kg+2×10～4个孢子化卵囊(仅第0天),连续处理14天。主要研究内容与结果如下: 研究一:AFB1和球虫联合对绵羊子宫损伤的作用 首先,绵羊的生长性能及卵囊数量和粪便形态分析结果证明AFB1和球虫模型的成功建立。绵羊子宫形态学和组织学结果显示,AFB1和球虫单独或联合作用导致子宫内膜上皮细胞紊乱、炎性细胞浸润和充血。荧光定量PCR(RT-q PCR)结果显示,与Con组相比,AFB1和球虫处理显著下调绵羊子宫组织中雌激素受体ERα(p=0.021)和ERβ(p=0.021),和抗炎因子IL-10(p=0.016)的mRNA表达水平,上调促炎因子IL-6(p=0.003)和TNF-α(p<0.001)mRNA表达水平。以上结果表明AFB1和球虫联合作用对生殖系统的毒性作用可能与子宫激素的改变和炎症的诱发有关。 研究二:AFB1和球虫联合对绵羊肠道健康的影响 通过对绵羊肠道组织病理学观察发现,AFB1和球虫联合诱导肠道屏障结构的损伤。绵羊粪便16S rRNA测序分析发现,AFB1和球虫处理导致肠道菌群紊乱,其中类杆菌属(Bacteroides)、经黏液真杆菌属(Blautia)、优杆菌属([Eubacterium])、弯曲杆菌属(Campylobacter)、副拟杆菌属(Parabacteroides)、刺骨鱼属菌(Epulopiscium)、琥珀酸弧菌属(Succinivibrio)和脱硫弧菌属(Desulfovibrio)存在显著的组间差异。粪便代谢组学分析显示,AFB1和球虫联合组绵羊粪便代谢物与Con组存在显著差异,并且筛选出的14个共有的差异代谢物与类杆菌属(Bacteroides)、优杆菌属([Eubacterium])、刺骨鱼菌属(Epulopiscium)和肠屏障指标Claudin1、Claudin4和Occludin呈现显著正相关,与经黏液真杆菌属(Blautia)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、副拟杆菌属(Parabacteroides)、琥珀酸弧菌属(Succinivibrio)、脱硫弧菌属(Desulfovibrio)和ZO-1呈现负相关。以上结果表明,AFB1和球虫联合可能是通过干扰肠道菌群组成及其代谢物引起绵羊肠道屏障功能障碍。 研究三:AFB1和球虫联合对绵羊血液指标的影响 为进一步阐明AFB1和球虫单独或联合诱导的子宫损伤与肠屏障受损之间的关联机制,首先采用ELISA方法检测血液中的炎症因子的表达水平。AFB1和球虫处理显著上调促炎因子IL-6、TNF-α的表达水平(all p<0.05)和LPS的表达水平(all p<0.05),显著下调抗炎因子IL-10(all p<0.05)的表达水平。同时显著增强血液中雌激素受体ERα和ERβ(all p<0.05)的表达水平。进一步通过广泛非靶向代谢组学检测血液中代谢产物的变化。根据|Log2FC|≥1和P<0.05选择差异表达的代谢物,Con vs AFB1组鉴定出402种差异代谢物,Con vs E.o组鉴定出978种差异代谢物,Con vs AFB1+E.o组鉴定出1211个差异代谢物,这些差异代谢物均主要富集在氨基酸代谢途径。将富集在氨基酸代谢途径中的10个代谢物与血液炎症因子及激素相关指标进行皮尔逊相关性分析,发现N-乙酰-L-苯丙氨酸与血液指标之间存在显著的相关性,这表明肠道菌群及其代谢紊乱是由AFB1和球虫作用引起循环中炎症和激素改变的主要原因,其中氨基酸代谢可能是一个主要的促成因素。 研究四:AFB1和球虫联合对绵羊子宫损伤的机制 通过绵羊子宫组织转录组分析

关键词： 黄曲霉毒素B1   石胆酸   核受体   肝脏损伤   辅助因子  

摘要： 在温度和水分适宜的情况下,霉菌侵染农作物并产生次级代谢产物-霉菌毒素。黄曲霉毒素B1(Aflatoxin B1,AFB1)是曲霉属真菌产生的毒性极强的一种黄曲霉毒素。仔猪采食含有AFB1的饲料会导致器官受损、生长性能下降、甚至引发腹泻和死亡,给生猪产业造成巨大的经济损失。为了减少霉菌毒素对养殖业的危害,许多饲料及饲料原料都会进行脱霉处理。然而,这种处理会导致饲料适口性下降、营养物质含量减少、环境污染、以及脱霉不彻底,残留的霉菌毒素在仔猪体内蓄积仍可导致机体损伤。肝脏是机体主要的解毒器官,能够把有毒物质转化为低毒或无毒物质并随胆汁排出体外。研究表明,补充胆汁酸加速肝脏的代谢解毒过程,增强胆汁对胆管的冲刷,促进肝脏中毒素的排出,从而减轻毒素对机体的损伤。石胆酸(Lithocholic acid,LCA),作为一种重要的胆汁酸,在肝脏纤维化、肠道炎症和肠道吸收方面发挥调控作用。然而,LCA能否缓解AFB1诱导的仔猪肝脏损伤尚不清楚。因此,本研究以新生仔猪为研究对象构建AFB1损伤肝脏模型,探讨LCA对AFB1诱导仔猪肝脏损伤的作用及机制。主要研究结果如下: ***对AFB1诱导仔猪肝脏损伤的影响 本部分旨在明确AFB1诱导仔猪损伤肝脏,为后续机制研究提供基础。首先研究显示AFB1导致肝脏重量显著增加、胆囊内胆汁量减少、血液中中性粒细胞和单核细胞数量显著增多。添加LCA可缓解AFB1诱导的上述指标异常。此外,LCA缓解AFB1诱导的血浆中AFB1含量、AST/ALT/ALP水平显著升高、肝脏内炎性细胞聚集、胶原纤维沉积增多以及细胞死亡数量显著增多。通过RNA-seq进一步探讨LCA对AFB1诱导肝脏损伤的影响,发现AFB1导致肝脏解毒基因的表达显著降低。通过ATAC-seq分析发现AFB1导致全基因组染色质可及性增加,添加LCA逆转了染色质可及性增加。以上研究表明LCA缓解AFB1诱导的肝脏损伤。 ***通过核受体RORγ调控胆汁酸转运体表达缓解AFB1诱导的仔猪肝脏损伤 为了研究AFB1导致仔猪胆囊内胆汁量减少的作用机制,本研究对肠肝循环(血液、肝脏和回肠)部位的胆汁酸水平进行检测,结果显示AFB1处理导致血液和肝脏部位胆汁酸水平显著升高,回肠部位的胆汁酸水平显著降低。进一步研究AFB1导致机体内胆汁酸水平异常的机制,检测发现AFB1导致胆汁酸转运体SLC10A1和ABCB11的表达显著降低、启动子区染色质可及性降低,介导胆汁酸转运的补偿机制MRP3、SLC51A/B和ABCC2基因表达显著升高、启动子区染色质可及性增加。添加LCA缓解了AFB1的上述作用。为了进一步探究AFB1导致胆汁酸转运体表达异常的作用机制,通过ATAC-seq、RNA-seq和Western blot分析发现RORγ可能是调控SLC10A1、ABCB11表达的关键靶点。通过对临床数据分析发现,RORc基因表达与SLC10A1、ABCB11基因表达呈显著正相关。此外,RORγ与SLC10A1、ABCB11、NCOR1/2、SRC-1/3之间存在蛋白互作。通过Ch IP-q PCR和Co-IP检测发现AFB1导致NCOR1/2辅助RORγ抑制SLC10A1、ABCB11基因表达,添加LCA逆转了AFB1的上述作用。以上研究表明LCA通过核受体RORγ调控胆汁酸转运体表达缓解AFB1诱导的仔猪肝脏损伤。 ***对AFB1诱导仔猪肝脏炎症和细胞焦亡的影响 为了进一步探讨LCA对AFB1诱导仔猪肝脏损伤的影响,本研究对RNA-seq分析发现AFB1显著激活炎症反应、IFN-γ和TNF-α信号通路。此外,AFB1导致肝脏中TNF-α和IL-6表达显著升高、调控炎症反应的MAPK信号通路激活。炎症因子能够诱导经典细胞焦亡信号通路激活,通过检测发现AFB1导致NLRP3、ASC、Cleaved Casp1表达显著升高。同时AFB1导致细胞焦亡关键蛋白N GSDMD、炎症因子IL-18、IL-1β和Cleaved IL-1β表达显著升高。添加LCA逆转了AFB1的上述作用。以上研究表明LCA缓解AFB1诱导的仔猪肝脏炎症和细胞焦亡。 4.石胆酸对黄曲霉毒素B1诱导仔猪肝脏纤维化的影响 为了进一步探究细胞焦亡与肝脏纤维化的关系,对Casp1和肝星状细胞活化标记蛋白ACTA2进行共染,结果显示AFB1导致肝脏中ACTA2表达显著升高,Casp1和ACTA2不存在蛋白共定位,表明AFB1诱导肝星状细胞活化,但不发生细胞焦亡。此外,AFB1暴露导致肝脏促纤维化基因的表达显著升高、启动子区域染色质可及性增加,抑纤维化基因表达显著降低。本研究进一步检测分析发现NR1D1可能是调控肝脏纤维化的关键靶点。通过Ch IP-q PCR检测发现AFB1暴露导致NR1D1在COL1A1、

关键词： 黄曲霉毒素B1   间接竞争免疫分析法   双读值   智能手机   内过滤效应  

摘要： 黄曲霉毒素B1（AFB1）是由黄曲霉和寄生曲霉产生的一种真菌毒素,它对动物乃至人体器官都有很强的毒副作用,如肝肾毒性、致癌性、致畸性、免疫毒性和致突变性。AFB1普遍存在于谷物、水果、葡萄酒、坚果、调味品和豆制品等食品中,由于其热稳定性,它不会被正常的工业加工或烹饪破坏。鉴于AFB1的巨大危害性,100多个国家已经立法规定了农产品和食品中AFB1的最高限量,因此开发操作简便、灵敏度高的AFB1检测方法具有重要意义。 本文以基于酶联免疫分析法（ELISA）,结合比色分析法的可视化和荧光分析法的高灵敏性构建了三种免疫分析方法,实现了实际样品中AFB1含量的高灵敏和可视化分析。具体内容如下: 1.间接竞争ELISA（ic-ELISA）检测AFB1 基于抗原抗体的特异性结合,固定在酶标板上的AFB1完全抗原（BSA-AFB1）与样品中游离的AFB1竞相与单克隆抗体（Mc Ab）结合,再通过辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠抗体（HRP-Ig G）催化底物四甲基联苯胺（TMB）产生蓝色作为信号输出,建立了ic-ELISA。进行条件优化后,该方法对AFB1的最低检出限为0.12 ng/m L,检测范围为0.13-0.40 ng/m L,满足我国AFB1检出限的要求。与其他真菌毒素交叉反应率（CR）均<0.03%,特异性良好。玉米样品中的回收率在96.27%-106.53%之间,符合美国分析化学家协会（AOAC）的规定,证明了该方法的准确性和可靠性。 2.基于卤代吲哚酚（HIP）生成的双读数比色免疫分析法检测AFB1 该方法在ic-ELISA的基础上,用碱性磷酸酶标记的山羊抗小鼠抗体（ALP-Ig G）代替HRP-Ig G,在ALP的催化下,磷酸单苯酯（PP）脱磷生成苯酚。碱性条件下,苯酚与2,6-二溴对氯亚胺（DBQC）反应生成肉眼可见的蓝色HIP。此外,这种颜色信号可以通过智能手机转换为数字信号,从而实现对AFB1的定量检测。在最佳条件下,该比色免疫分析方法的肉眼检出限为0.70 ng/m L,智能手机检出限为0.013 ng/m L。实际样品加标的回收率在100.57%-105.49%之间,符合AOAC的规定,表明该方法用于实际样品中AFB1的实时检测是可行的。 3.基于4-氨基安替比林（4-AAP）和石墨烯量子点（GQD）的双模式免疫分析法检测AFB1 该方法依赖于HRP的催化作用,在过氧化氢（H2O2）存在下,HRP将邻苯二酚（CTC）氧化成邻苯二醌（BZQ）,BZQ与4-AAP偶联生成粉红色产物,粉红色产物与GQD之间的内过滤效应导致GQD的荧光猝灭,因此产生的颜色和荧光变化可作为双重信号显示AFB1的含量。在该双模式免疫分析法中,比色模式的检出限为0.016 ng/m L,检测范围为2.75-5.00 ng/m L,荧光模式的检出限为0.103ng/m L,检测范围为3.00-6.00 ng/m L,实际样品加标的回收率在92.85%-102.17%之间,符合AOAC的规定,表明该双模式免疫分析法具有良好的检测适用性。

关键词： 黄曲霉毒素B1   碳点   荧光免疫分析法   比色免疫分析法  

摘要： 黄曲霉毒素是由黄曲霉和寄生曲霉产生的次级代谢物,具有极大的危害。它广泛存在于食品、饲料成分、农产品和各种有机物质中,已分离和鉴定出10多种类型。其中,黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1,AFB1）毒性最大,导致大量食品和农产品污染,给人类生产和健康生活造成巨大损失。由于致突变性、致畸性和致癌性,AFB1被国际癌症研究机构（IARC）列为I类致癌物,严重威胁动物和人类健康。因此开发操作简便、灵敏度高的AFB1检测方法具有重要意义。 碳点（CDs）是一类新型碳纳米材料,具有高水溶性、低成本、低毒、优良的生物相容性等优点,所以本文以CDs作为荧光探针引入免疫检测分析,在建立AFB1的间接竞争酶联免疫检测方法（ic-ELISA）后,在ic-ELISA的基础上结合CDs构建AFB1检测的新型免疫检测方法,具体内容如下: ***1间接竞争ELISA方法的建立 辣根过氧化物酶标记的二抗（HRP-Ig G）催化底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）显色,溶液由无色变成蓝色,用硫酸终止反应后,通过读取450 nm处吸光度值进行分析,实现AFB1定量检测。所构建的ic-ELISA方法线性方程为:Y=221.722X–50.231,R2=0.993,对AFB1的检测范围是0.29～0.61 ng/m L,最低检测限（LOD）为0.45 ng/m L。在玉米中的加标回收率为100.33%～106.87%,变异系数小于5%,符合美国分析化学家协会（AOAC）的标准。 2.基于CDs的荧光免疫分析法检测AFB1 Cu2+可以猝灭的CDs的荧光,而焦磷酸钠（PPi）可以通过螯合Cu2+来恢复CDs的荧光,当碱性磷酸酶标记Ig G（ALP-Ig G）催化PPi的水解释放Cu2+后,CDs的荧光强度又会降低。通过CDs在460 nm处的荧光强度变化实现AFB1定量检测。所构建的荧光免疫分析法线性方程为Y=5.700 X+60.218,R2=0.992,对AFB1的检测范围为0.0625～4 ng/m L,最低检测限（LOD）为0.034 ng/m L。玉米样品加标回收实验中,回收率为97.91%～103.33%,此外,变异系数均小于10%,这些结果符合美国分析化学家协会（AOAC）的标准。 3.基于DAP和CDs的比率荧光和比色双模式免疫分析法检测AFB1 以2,3-二氨基酚嗪（DAP）和碳点（CDs）为基础,建立了AFB1的双模式免疫检测方法。在HRP-Ig G的催化下,邻苯二胺（OPD）被氧化生成具有黄色和强荧光的DAP,溶液由无色变成黄色。同时,DAP的吸收光谱与CDs的荧光发射光谱重叠,导致CDs的荧光被猝灭。利用DAP和CDs的荧光比值以及DAP的吸光度值变化实现AFB1定量检测。所构建的双模式免疫分析法中荧光法的线性方程为Y=-3.233 X+6.129,R2=0.991,LOD为0.013 ng/m L;比色法线性方程为Y=-0.694 X+1.391,R2=0.991,LOD为0.061 ng/m L。两种模式对AFB1的检测范围均为0.75～1.8 ng/m L;玉米样品加标回收实验中,荧光法的回收率为98.75%～104.25%,比色法的回收率为93.63%～104.63%,此外,变异系数均小于5%,这些结果符合美国分析化学家协会（AOAC）的标准。