关键词： 黄曲霉毒素B1   过氧化氢酶   异源表达   分子改造  

摘要： 黄曲霉毒素是一种由黄曲霉和寄生曲霉等真菌产生的小分子代谢产物,是一类结构相似的化合物,目前已经鉴定出超过20种不同的类型。其中,黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1,AFB1）的毒性最强,具有强烈的致癌、致畸和致突变作用,因此去除粮油食品中的AFB1尤为重要。AFB1的去除方法主要有物理法、化学法和生物法,与传统化学物理法降解黄曲霉毒素相比,生物法具有效率高、副作用小等优点。实验室前期研究表明过氧化氢酶具有降解AFB1的能力。为了使过氧化氢酶更好地满足工业生产和应用的需求,本论文在大肠杆菌中异源表达了索诺拉沙漠芽孢杆菌（Bacillus sonorensis）s262的过氧化氢酶基因,研究了重组酶的酶学性质及对AFB1的降解;并在大肠杆菌中对过氧化氢酶进行分子改造,选择酶活提高的正突变体进行酶学性质研究,AFB1降解的测定。主要研究成果包括: （1）优化过氧化氢酶基因的克隆及表达条件。成功克隆了菌株s262过氧化氢酶基因Kat A,其大小为1 458 bp。成功构建了质粒p ET28a-Kat A,并将其转入*** BL21（DE3）感受态细胞中,经过SDS-PAGE验证表达成功。重组过氧化氢酶分子量大小为58.4 k Da。对重组过氧化氢酶的表达条件进行优化,最适条件为:IPTG 0.8mmol/L,温度25℃,时间10 h。 （2）*** BL21重组过氧化氢酶的纯化及酶学性质研究。IPTG诱导表达后通过镍柱纯化获得重组过氧化氢酶,经过SDS-PAGE检测分子量大小为58.4 k Da,最适温度为50℃,50℃下测定其半衰期为2.5 h,最适反应p H为7.0。重组酶在p H 5.0-10.0的环境中处理1 h后,在p H 5.0-9.0范围内剩余酶活均达到40%以上。0.1mmol/L Fe2+、Zn2+和Cu2+可使酶活分别提高40%、8%和12%;K+对酶活抑制作用最强,可使酶活下降39%;Mg2+、Ca2+、Li+和Mn2+对酶活性也有抑制作用。Na+对酶活性的影响不大。其中通过双倒数作图法计算该酶动力学参数Vmax为（760.17±19.61）mmol/（min·L）,Km为（63.73±3.87）mmol/L。高效液相色谱法检测得出重组过氧化氢酶对AFB1降解率为61.44%,降解效果较好。 （3）对重组过氧化氢酶进行定点突变。根据各突变位点的结合自由能,选择结合自由能高的4个突变位点突变为8个菌株。根据突变位点设计特定引物,使用一步式PCR诱变试剂盒,对选定的位点进行突变。经测序后得到了突变成功8个菌株。其中突变体G394T过氧化氢酶活相比原始菌过氧化氢酶活提高34.14%。对突变体G394T过氧化氢酶进行纯化及SDS-PAGE检测,发现其分子量大小相较于原始菌有所下降。对其酶学性质进行测定,发现其热稳定性下降,耐碱性增强。金属离子对突变体过氧化氢酶的影响变弱。突变体G394T过氧化氢酶Vmax为421.94±72.46 mmol/（min·L）,相较于原始菌重组过氧化氢酶有所降低。突变体G394T过氧化氢酶Km为82.99±8.73mmol/L,是原始菌重组过氧化氢酶的1.3倍,说明酶与底物的结合能力减弱。通过对突变体G394T过氧化氢酶及原始菌过氧化氢酶降解AFB1的对比,降解48 h时突变体G394T过氧化氢酶的AFB1降解率为78.31%,是原始菌过氧化氢酶的1.27倍。

关键词： 四川省   医疗机构中药制剂   药品监管  

摘要： 近年来,随着我国医药产业快速发展,医疗机构中药制剂产业也呈现出蓬勃发展的态势。然而,医疗机构屡屡爆发中药制剂质量问题,对疾病预防与治疗领域中药效用的全面发挥产生了明显的限制作用。为了降低中药制药在医疗机构出现违规违法行为的概率,减少制假售假情况的发生,国家出台了一系列加强医疗机构中药制剂监管的政策。这些政策旨在规范医疗机构中药制剂的研发和审批程序,提高中药制剂的质量,推动医疗机构中药制剂的创新发展。但目前来看,医疗机构中药制剂的抽检合格率仍然较低,还需要进一步加强监管,提高医疗机构中药制剂的质量和安全性。 本文选取了四川省医疗机构中药制剂政府监管作为研究对象,并运用了协同治理理论、数字治理理论作为理论支撑,通过对四川省的药监局、市场监督管理局、卫健委等监管主体以及医疗机构工作人员等监督对象展开访谈调查,收集第一手资料,分析四川省中药制剂监管工作目前面临的问题,并分析问题产生的原因。之后,通过收集部分先进地区或城市关于医疗机构中药制剂监管的优秀做法,为四川省医疗机构中药制剂监管提供指导借鉴,最后提出对策建议。 通过上述分析,本文梳理出了四川省医疗机构中药制剂监管还存在各主体间配合度较低、监管方法不科学、监督检查力度不足、社会监督力量参与程度低的问题,并分析了其原因。然后,在借鉴了浙江、广州、泰州、佛山等先进地区医疗机构中药制剂监管的经验后,针对上述问题和原因,从健全医疗机构中药制剂监管运行机制、创新医疗机构中药制剂监管手段、增强医疗机构中药制剂监管队伍力度、完善社会监督参与机制四个方面提出了完善四川省医疗机构中药制剂监管工作的对策建议,以期为四川省进一步建立和完善医疗机构中药制剂监管体制提供建议和参考。

关键词： 动脉粥样硬化   环糊精   转录组   脂质代谢  

摘要： 目的: 通过C57BL/6J的ApoE-/-（载脂蛋白E基因敲除）小鼠高脂饮食的动脉粥样硬化（Atherosclerosis,AS）模型,探索中药制剂辅料HP-β-CD（HP-β-Cyclodextrin,羟丙基-β-环糊精）对动脉粥样硬化进入中后期的影响;基于肝脏组织的转录组学与Western Blot实验,结合Hep G2细胞实验,从蛋白与基因水平揭示其相关作用机制,拓展与深化环糊精抗动脉粥样硬化的作用机制。 方法: 1.文献研究:基于系统检索法收集Pub Med和Web of Science近30年的相关文献,形成基础数据库;采用文献计量法进行特征挖掘,应用VOSviewer软件进行聚类分析、呈现研究热点与趋势的可视化图谱,运用内容分析法进行客观描述及准确分析。 2.动物实验造模与给药:将ApoE-/-雄性C57BL/6J小鼠分为空白对照组（Control,n=10）,模型组（Model,n=11）,HP-β-CD给药组（CD,n=11）,经典动脉粥样硬化的高脂造模时间由12周延长至16周至中后期,同期模型组与HP-β-CD给药组尾静脉给药分别给予生理盐水与HP-β-CD溶液2mg/kg（给药频率为2次/周）,连续给药16周。 ***-β-CD对动脉粥样硬化中后期的影响:测量总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）以及高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）的浓度水平。对主动脉弓斑块大小进行成像、定量分析了全长主动脉斑块面积、对主动脉窦瓣膜的脂质沉积进行了测量,并观察了冠状动脉窦瓣膜的增生情况。 4.基于肝脏脂质代谢的相关机制研究:利用高脂饲料喂养16周达到AS中后期模型小鼠,分别收集空白对照组、AS模型组和CD给药组的小鼠肝脏进行转录组测序分析。从基因表达水平探究环糊精基于肝脏脂质代谢干预中后期动脉粥样硬化的相关机制研究。本研究进行了GO（Gene Ontology,基因本体）与KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,京都基因与基因组百科全书）的富集研究;通过对GO和KEGG的富集结果进行分析,筛选出与脂质代谢有关的生物学机制、分子功能以及信号传导路径后,使用RT-qPCR法和Western Blot检测相关差异基因和蛋白表达水平。使用氧化型低密度脂蛋白（ox LDL）对Hep G2人源肝癌细胞造成氧化应激作用,形成胆固醇代谢模型,以研究HP-β-CD对细胞层面脂类代谢异常的影响机制。 结果: 1.本研究共收集54篇文献,形成基础数据库。学术研究分布气泡图表明,该研究主要集中于美国。聚类分析结果显示,该领域研究较多的疾病是C型尼曼匹克症（Niemann-Pick Type C,NPC）,动脉粥样硬化、肥胖等。热点环糊精类型依次为HP-β-CD,a-CD、β-CD等。文献计量与内容分析显示,研究所覆盖脂类代谢疾病15种,其中NPC、糖尿病和肥胖症已在临床试验中得到研究。血脂异常和强直性脊柱炎在动物实验中的报道相对较多。细胞实验研究从多个角度揭示了干预脂质代谢疾病的分子机制。环糊精发挥药理作用的分子机制探索主要围绕脂质代谢展开。 2.对动脉粥样硬化中后期模型ApoE-/-小鼠尾静脉注射HP-β-CD,使TC、TG和HDL-C的水平表现出不同程度的降低效果。;对主动脉弓以及全长主动脉的斑块面积极显著减少（P<0.0001）;能够有效改善冠状动脉窦瓣膜上的脂质蓄积情况（P<0.05）。 3.基于肝脏脂质代谢的相关机制研究发现,AS模型组与空白对照组相比,差异m RNA有El、Lpl、Pltp、Cxcl1等。HP-β-CD给药组与AS模型组相比,差异m RNA有Cyp26a1、Angptl4等。RTq-PCR验证脂类代谢相关差异基因结果显示,相较于空白对照组,AS中后期模型组的形成显著提升了Pltp、Lpl、Soat1的基因表达（P<0.001,P<0.0001）,极显著地降低了EL的基因表达（P<0.0001）。相较于AS模型组,HP-β-CD给药组使EL的基因表达有所上升（P<0.05）,对Angptl4、Soat1的基因表达上升较为显著（P<0.01,P<0.001）。此外,相较于空白对照组,AS模型组显著地降低了Pparγ的m RNA表达水平（P<0.001）,对PPARγ的蛋白表达也有所下调（P<0.05）。在Hep G2胆固醇代谢模型中发现,相较于胆固醇代谢模型组（Model）,HP-β-CD对Pcsk9的m RNA表达水平的存在提高的影响,且随浓度的增强显著性增强（P<0.05,P<0.01）。 结论: 1.环糊精在脂质代谢疾病中的作用和机制有待进一步挖掘,其作为药物辅料的潜在降脂作用研究较少,其用作口服或注射制剂辅料时

关键词： 漆酶   理性设计   毒素降解   黄曲霉毒素B1   玉米赤霉烯酮  

摘要： 在当今全球食品安全领域内,霉菌毒素的污染问题日益引起人们的广泛关注。这些有毒代谢产物,不仅严重威胁到人类和动物的健康,还对农业生产和全球贸易构成了重大的经济负担。特别是黄曲霉毒素和玉米赤霉烯酮这两类霉菌毒素,由于其广泛的存在以及极强的毒性,成为了研究和控制的重点。 目的:为解决目前制约食品等领域发展的霉菌毒素污染问题,选取了枯草芽孢杆菌来源的Bs CotA漆酶并且通过理性设计提高酶活、稳定性,从而实现对霉菌毒素的降解效率的提高。方法:利用理性设计改造Bs CotA漆酶,获得了四个突变体漆酶,包括三个点突变体:CotAA344K、CotAA317T、CotAT36Y和突变整合体CotAgold,使用毕赤酵母进行异源表达,测定其酶学性质,并检测其对霉菌毒素的降解效率。实验结果:基于蛋白质结构进行设计的3个单点突变,均从不同程度上提高漆酶的稳定性。而将三个突变位点同时整合到一个漆酶突变体上时,三个突变位点间未发生显著拮抗作用,使得突变整合体CotAgold展示出最好的稳定性以及催化能力;CotAgold比酶活为99.4 U/mg,相比Bs CotA的比酶活提高了10倍,对于ABTS的kcat/KM达到了7.12×10～5 M-1*S-1,相比Bs CotA提高了1.9倍;突变体CotAgold的最适反应p H值为4,最适反应温度均为70℃,与野生型Bs CotA催化条件保持一致;CotAgold在p H值2～12范围内,孵育30 min,剩余酶活均在70%以上,相比野生型Bs CotA在酸性条件下的稳定性有明显提高;CotAgold在40-90℃范围内,孵育30 min,残留酶活均在90%以上,相比野生型Bs CotA在高温条件下的稳定性有明显提高;并在ABTS作为介体的条件下,漆酶CotAgold能完全降解黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮;相比之下,野生型漆酶Bs CotA的降解率仅为5%;LC-MS分析结果显示,CotAgold能够将这两种霉菌毒素降解为安全无毒的产物。 结论:通过蛋白质的理性设计得到了漆酶突变体CotAgold,表现出显著提高的p H稳定性以及热稳定性,蛋白表达量也有一定的提高,同时也能在介体的帮助下将霉菌毒素完全降解,其在霉菌毒素降解等领域具有良好的应用前景。

关键词： 黄曲霉毒素B1   猪流感病毒   病毒复制   脏器损伤   16S rRNA   肠道菌群  

摘要： 【背景】黄曲霉毒素B1（AFB1）是由寄生曲霉菌产生的次级代谢产物，广泛存在于世界各地受污染的食品和饲料中，被认为是影响人类和动物健康的主要风险因素之一。猪流感病毒（SIV）是目前世界上传播最为广泛的病毒之一，其复制易受环境和营养等多种因素影响。然而，饲料中AFB1污染与SIV感染的关系尚不明确。【目的】探究AFB1暴露对SIV感染的仔猪体内SIV复制、器官损伤和肠道菌群的影响，为研究霉菌毒素中毒机制奠定基础，也为探讨其他感染性疾病易感性增加原因提供参考。【方法】选取保育期雄性仔猪32头，随机分为4组（每组8头），在试验开始第1和第4天分别滴鼻接种低致病性SIV病毒稀释液，建立SIV感染仔猪（本体动物）模型。每天新鲜稀释AFB1，按照0、10、20和40μg·kg-1（饲料）浓度灌服给仔猪，持续21 d。分别在第7、14和21天饲喂前对仔猪进行称重，然后应用多种技术手段检测各组仔猪器官脏器指数、剖检变化和病理特征，并在此基础上，进一步使用免疫印迹分析肺部SIV的核衣壳蛋白（NP）的表达情况以及16S rRNA检测肠道菌群变化，阐明AFB1暴露对SIV感染、脏器损伤和肠道菌群的影响。【结果】暴露于40μg·kg-1 AFB1的仔猪较对照组仔猪（无AFB1）体增重显著降低（P<0.01）,NP蛋白表达以及肺脏指数显著升高（P<0.01），而脾脏指数显著降低（P<0.01）。剖检结果显示，暴露于40μg·kg-1AFB1仔猪的脾脏、肝脏和肺脏损伤严重。H.E染色也表现出相似的结果，与SIV对照组相比，40μg·kg-1AFB1处理组仔猪脾脏出现淤血，红白髓界限不清；肝组织出血、炎症细胞浸润；肺脏小肺泡融合成形态不规则的大肺泡，肺泡间质增厚，炎性细胞浸润增多；此外，肠绒毛形状不规则，结缔组织松散，有淋巴细胞浸润。16S rRNA测序结果显示，暴露于40μg·kg-1AFB1显著提高了仔猪肠道放线菌门和梭状芽孢杆菌的相对丰度，降低了乳酸菌属和拟杆菌属的丰度。【结论】AFB1暴露降低了SIV感染仔猪的体增重，促进SIV复制，加剧了肺组织等器官损伤，并引起肠道菌群紊乱，该发现为研究AFB1的毒性作用机制提供理论参考依据。

关键词： 姜黄素   AFB1   肝细胞   氧化应激   代谢组学  

摘要： 黄曲霉毒素B1(AFB1)广泛存在于畜禽饲料和谷物中,当畜禽摄食被AFB1污染的谷物及饲料后,极易引起畜禽肝脏的结构损伤及功能障碍,且存在畜禽副产物食用安全隐患。姜黄素(Curcumin)作为一种天然抗氧化物质,对AFB1诱导的氧化应激具有潜在的保护作用。目前,对于姜黄素缓解AFB1诱导的肉羊肝细胞的损伤干预作用及机理尚未明晰。本试验以苏尼特胚胎羊肝细胞作为研究对象,利用氧化应激及代谢组学探讨姜黄素对AFB1诱导羊肝损伤的保护作用,为姜黄素保障副产物安全及提高副产物利用率方面提供有益的探索,同时也为姜黄素防治AFB1性肝损伤奠定理论依据。 本文采用组织块剪碎消化法提取苏尼特胚胎羊原代肝细胞,并进行细胞传代培养后,经糖原染色(PAS)鉴定肝实质细胞,采用CCK-8法绘制肝细胞生长曲线及测定AFB1的最佳染毒剂量和测定姜黄素的最佳活性剂量。将细胞进行分组,分为对照组(C组)、AFB1组(A组)、姜黄素组(CC组)、先AFB1处理后姜黄素处理组(F组),采用相关试剂盒测定细胞内谷草转氨酶(AST)水平、谷丙转氨酶(ALT)水平、超氧化物歧化酶(SOD)活性、T-AOC活性和丙二醛(MDA)含量。随后基于非靶向细胞代谢组学方法测定对照组(C组)、AFB1组(A组)、先AFB1处理后姜黄素处理组(F组)苏尼特胚胎羊肝细胞中的代谢物,并对显著差异差异代谢物及相关通路进行分析,主要结果如下: 根据CCK-8结果显示,AFB1最佳毒性剂量为8.64μmol/L。同时显示姜黄素在10～20μmol/L区间内活性最佳。因此本试验选择浓度为8.64μmol/L的AFB1工作液和10μmol/L的姜黄素工作液作为试验处理浓度。肝功能指标结果显示,AFB1处理提高了AST、ALT水平,说明本试验成功构建了肝细胞损伤模型。氧化指标结果显示,AFB1处理增加了MDA含量,降低了T-AOC和SOD活性,姜黄素处理后呈现相反趋势,表明姜黄素可以提高细胞活力,并且通过抑制AFB1诱导的氧化应激减缓细胞损伤。另外代谢组学结果显示三个比较组中共筛选出29种显著性差异代谢物,大多数的显著差异代谢物以有机酸及其衍生物为主,且在A和F处理组中有较高表达。在29种显著性差异代谢物中有亚精胺、黄曲霉毒素B1、肌苷、鸟嘌呤、鸟苷、磷酸烯醇式丙酮酸、阿托品、香豆甾醇这8种显著差异代谢物能够在数据库中匹配,共富集于17个KEGG通路,主要参与苯丙素的生物合成、ABC转运蛋白、嘌呤代谢及核苷酸代谢等代谢途径。根据三个比较组中的显著差异代谢物的表达情况,起调节作用的代谢途径为ABC转运蛋白和苯丙素的生物合成途径,通过改变香豆甾醇及亚精胺这两种代谢物的水平,从而调节ABC转运蛋白和苯丙素的生物合成发挥作用。 综上结果表明,姜黄素可改善AFB1诱导的肝损伤,通过改变香豆甾醇和亚精胺这两种代谢物的水平,以调节ABC转运蛋白和苯丙素的生物合成发挥作用。从而对AFB1诱导的肝细胞损伤起到保护作用。

关键词： 电化学发光   侧流免疫层析试纸条   黄曲霉毒素B1   高灵敏   快检  

摘要： 黄曲霉毒素是一种由黄曲霉和寄生曲霉等真菌产生的有害次生代谢产物,其中黄曲霉毒素B1（aflatoxin B1,AFB1）是毒性最强的致癌物质,严重损害人和动物的生命健康。因此,农产品和食品中AFB1污染的快速检出对保障我国食品安全,助力国家经济发展具有重要意义。现有AFB1检测技术如高效液相色谱法、酶联免疫法等主要侧重于实验室检测,虽然检测准确度高,但过程操作复杂,专业性强,难以满足现场快速检测需求。随着侧流免疫层析试纸条技术的飞速发展,基于胶体金或荧光探针的AFB1试纸条快检方法也相继建立,具有易于制备、成本低、简单便携等优点。然而,AFB1在超低浓度下即具强毒性,快检技术灵敏度的提升对于超痕量AFB1的检出至关重要。现有试纸条与拉曼、光热等技术的联用快检技术在一定程度上提升了AFB1快检性能,但灵敏度的进一步提升仍面临重要挑战。电化学发光（electrochemiluminescence,ECL）是将电信号转化为光信号的新兴分析技术,具有灵敏度高、可控性好、发光体特异性高和线性检测范围宽等优势。因此,将ECL技术与侧流层析免疫试纸条结合有望构建简单便捷可靠的超高灵敏AFB1快检技术。基于此,我们研制了ECL试纸条,成功应用于玉米样品中AFB1的快速高灵敏分析检测。具体内容如下: 1.电化学发光/比色双信号试纸条的研制及其AFB1高灵敏快检研究 将碳油墨涂覆到图案化的聚氯乙烯衬底表面制备三电极体系,再将试纸条与其集成,开发了一体化的ECL试纸条;制备了Ru-PEI/Ti3C2Tx@Au复合纳米材料作为ECL和比色双功能信号探针,将其与抗AFB1抗体偶联后形成anti-AFB1-Ru-PEI/Ti3C2Tx@Au复合体,结合竞争免疫法实现AFB1的定量分析。当有AFB1目标物存在时,试纸条上的检测线不仅表现出紫红色的比色信号,衬底电极与便携式电化学发光仪联用后可同步采集ECL发射信号。当AFB1浓度越大,竞争到工作电极上的信号探针越少,从而实现1 pg/m L～100 ng/m L浓度范围的AFB1的双信号线性检测。在比色模式下,AFB1检测限为32 pg/m L,在ECL检测模式下检测限为319 fg/mL,表现出高灵敏、高特异性且稳定性高。该ECL试纸条在玉米样品AFB1加标回收实验中具有良好的回收率,证明该方法可用于实际食品样品的AFB1快检分析。 2.电化学发光成像试纸条的研制及其AFB1可视化高灵敏快检研究 因ECL成像具有可视化优势,将其与免疫层析试纸条结合,研发了兼容智能手机的ECL成像试纸条,建立了AFB1双信号高灵敏可视化快检新方法。通过类似方法制备图案化三电极体系,合成了Ru-PEI@Si O2@Au复合纳米颗粒作为比色和ECL成像双信号探针,通过在试纸条检测线上发生竞争免疫反应,产生ECL成像和比色双信号,通过智能手机拍摄进行信号采集和图像处理,实现了对AFB1的快速定量分析,在ECL成像模式下检测限为12 pg/m L,与单一比色模式相比,灵敏度提升了近10倍。此外,该ECL成像试纸条成功用于玉米实际样品中AFB1的快速检出,与确证法对照评估,检测结果无显著性差异,证明该方法可靠。该方法进一步提升了ECL试纸条的便携性,有望用于目标物的现场快速检测。

关键词： 赭曲霉毒素A   黄曲霉毒素B1   荧光适配体传感器   功能性纳米材料   DNA纳米结构   无标记探针   比率型传感器  

摘要： 真菌毒素是一类由特定真菌群所产生的高毒性次生代谢物,其中赭曲霉毒素A(OTA)和黄曲霉毒素B1(AFB1)作为分布最广泛、毒性最强的两种毒素,对人类和动物都存在着严重的危害。目前广泛应用的真菌毒素检测手段虽能准确鉴定这些毒素,却面临着成本高、耗时长等挑战。因此,构建快速、高灵敏的OTA和AFB1分析检测方法具有重要意义。本课题利用适配体的高亲和力和高特异性,结合功能性纳米材料优越的性能,同时借助DNA纳米结构的稳定性以及杂交链式反应(HCR)和催化发夹自组装(CHA)等扩增技术,构建新型荧光DNA传感器用于灵敏、简便检测食品中的OTA和AFB1。具体研究内容如下: 1.合成一种新型三维多孔氮硫共掺杂多孔碳(3D N-S-C)片状材料作为荧光适配体传感器的能量受体,HCR作为信号扩增策略,构建用于检测OTA的荧光适配体传感器。与棒状和球状的N-S-C材料相比,片状3D N-S-C材料构建的荧光适配体传感器相对荧光强度最大。同时该荧光传感器对OTA具有良好的稳定性,在0.01～500 ng/mL范围内,传感器的检出限(LOD)低至2.7 pg/mL。此外,将本传感器的检测方法与高效液相色谱法(HPLC)进行对比分析,结果传感器的潜在适用性得到良好验证。 2.制备新型的中空碳掺杂氮纳米球(HCNS)作为猝灭材料首次应用于荧光法检测AFB1,同时设计一种独特且具有刚性的H型DNA纳米结构,构建一种高灵敏的荧光适配体传感器,实现对AFB1的高效检测。在H型DNA纳米结构的构成中,由两条互补链C1和C2组成H型结构的骨架。由羧基荧光素(FAM)标记的S1-FAM作为信号探针,通过碱基互补结合到骨架两侧形成完整的H型DNA纳米结构。当AFB1存在时与适配体特异性结合,此时H型DNA纳米结构较高的稳定性,使传感器保持较高的信号响应。荧光适体传感器在最佳检测条件下的检测范围为0.05～500 ng/mL,LOD低至0.023 ng/mL。该传感器成功应用于花生、玉米粉、小麦、红酒、红茶样品中的AFB1检测。此外,通过对质控样中AFB1的检测,进一步验证传感器的适用性。 3.设计一条双端标记的互补DNA单链,可以同时与两种不同的适配体链结合。将具有纳米分支结构的金纳米花(AuNFs)和猝灭基团(BHQ1)作为荧光适配体传感器的荧光能量受体,用于猝灭荧光能量供体FAM和Cy3的荧光。基于荧光共振能量转移(FRET)效应构建一种双信号输出的荧光适配体传感器,实现对OTA和AFB1的同时检测。与金纳米颗粒(Au NPs)相比,AuNFs具有较尖锐的分支结构,这种结构为AuNFs提供更大的比表面积。在最佳实验条件下,AFB1和OTA的LOD分别为0.014 ng/mL和0.027 ng/mL,LOQ分别为0.046 ng/mL和0.089 ng/mL。用传感器进行实际样品分析,样品中AFB1和OTA的加标回收率分别为94.1%～111.7%和98.7%～112.2%。该传感器成功应用于实际样品,为高灵敏、同时检测真菌毒素提供了一种新思路。 4.将具有高稳定性、生物相容性的金纳米团簇(AuNCs)作为荧光适体传感器的内参比信号,而无标记荧光染料N-甲基卟啉二丙酸IX(NMM)和SYBR Green I(SGI)作为荧光适配体传感器的响应信号,在传感器制备过程中引入HCR和CHA进行信号扩增,构建一种用于同时检测OTA和AFB1的双扩增双比率型传感器。在传感器的最佳检测性能下,OTA和AFB1的线性范围在0.05～200 ng/mL之间,OTA和AFB1的LOD分别为6.7 pg/mL和8.6 pg/mL。同时,以花生、大豆和玉米为研究对象,对传感器进行加标回收实验,加标样品中OTA和AFB1的回收率分别在96.9%～107.9%和97.9%～104.4%之间,且RSD均小于15%。