关键词： 黄曲霉毒素B1   适配体   试纸条   快速检测  

摘要： 传统的黄曲霉毒素B1（AFB1）仪器分析方法,样品前处理步骤复杂、耗时长、不适合现场操作,而基于抗原抗体的胶体金免疫层析法虽然简单灵敏,但成本较高,且需要低温储运。核酸适配体试纸条是一种以核酸适配体结合侧向层析技术而研发的快速检测方法,在药物分析、食品安全、疾病诊断等领域都展现了很好的应用前景。目前核酸适配体试纸条一般采用适配体互补链竞争方式,由于核酸互补结合力常常大于适配体与靶标结合力,在适配体试纸条开发过程中,经常遇到核酸适配体的互补链选择困难问题。实验通过检测线（T线）处固定抗原代替互补链,此时适配体/靶标与适配体/抗原具有相同的结合力,用此同等竞争原理的思路解决了互补链选择困难问题,并且在控制线（C线）处固定适配体的全长互补链,竞争已经与靶标结合的适配体,形成T线/C线处双竞争模式,大大提高了检测的灵敏度与准确性。实验主要进行了以下几个方面的内容:1、论文首先设计了一种利用Cy5标记的适配体检测AFB1的试纸条,分别对各组件样品垫、硝酸纤维素膜（NC膜）、吸水垫和PVC底板进行了详细的优化选择。最后选择出一套适合荧光适配体试纸条的组件方案,即样品垫:上海杰一GL-b04型号（厚度为0.75）;NC膜:SartoriusCN140;吸水垫:H-4型号（厚度为0.3 mm）;底板:J-A6型号。组件的选择试验为试纸条获得高精确结果奠定了基础。2、通过优化检测条件与步骤,建立了AFB1荧光适配体试纸条检测的方法。最后选择结合性能好的AFB1-BSA抗原作为T线处的固定物,固定最佳浓度为252μg/mL;选择结合性能好的适配体完全互补序列作为C线处的固定物,固定最佳浓度为3μM;选择结合性能好的12个Poly（A）长度连接臂的荧光适配体,适配体最佳浓度为0.01μM;running buffer为含7.5%BSA的PB缓冲液（pH=7.4）。3、完成适配体试纸条检测性能的评价。试纸条的检测限为0.1 ng/mL,检测范围为0.1-1000ng/mL,批间批内稳定性好,对于其它霉菌毒素、抗生素、磺胺类药物、杀虫剂以及金属离子等靶标有很好的特异性,在食用油、谷物、饲料等11种样品基质中的添加线性良好,相关系数均大于0.95,并且检测结果与进口ROMER的ELISA试剂盒的结果具有非常好的一致性（y=1.0446x+2.1453,R2=0.9989）。本文研究不仅证明了基于适配体技术双竞争法原理试纸条的可行性,也为其它靶标的适配体试纸条的开发工作提供很好的参考借鉴。

关键词： 赭曲霉毒素A   黄曲霉毒素B1   伏马毒素B1   多孔硅   适配体   检测  

摘要： 真菌毒素具有极强的毒性,是谷物中常见污染物,会使谷物霉败变质、产品品质下降,对人和动物有致畸、致癌、致突变等作用。目前检测真菌毒素的方法较多,但是存在很多缺点,如:设备昂贵、步骤繁琐、检测成本高、对于痕量毒素残留检测灵敏度不够等。多孔硅比表面积大,结合位点多,当应用于检测毒素时,可以检测到浓度更低的毒素,而且多孔硅价格相对便宜,操作相对简单,因此本文基于多孔硅-核酸适配体技术应用芯片扫描仪建立了 一种检测谷物中真菌毒素的方法。本文应用电化学刻蚀方法,以P型单晶硅为材料,制备多孔硅。为增加多孔硅的稳定性,在多孔硅表面旋涂一层Ti02。利用多孔硅表面修饰的环氧基来共价结合修饰了荧光基团的核酸适配体和修饰了荧光猝灭基团的互补链的杂交链,当毒素通过时,核酸适配体会与毒素结合而和互补链分开,荧光值因此增加。通过测量加入毒素后的荧光增加值即可以定量检测OTA、AFB1和FB1。应用本文建立的方法,通过优化反应条件,分别建立了三种毒素的检测标准曲线,其中赭曲霉毒素A的检测线性范围在0.01～10ng/mL,检测线为0.01ng/mL,线性方程:y=241.3997x+1858.7973 (R2=0.9935);黄曲霉毒素B1的检测线性范围在0.001 ～1ng/mL,检测线为 0.001ng/mL,线性方程:y=339.8828x+1888.4533 (R2=0.0.9960);伏马毒素B1的检测线性范围在0.01～10ng/mL,检测线为0.01ng/mL,线性方程:y=595.8202x+2772.2389 (R2=0.9899)。以OTA为例,检测不同谷物中的加标回收率。本方法测得的加标回收率分别为:小麦为92.69±3.26%～101.80±2.80%,大米为 86.06±1.29%～100.66±1.44%,玉米为85.74士2.75%～99.92±1.63%,总回收率在80%～110%之间,表明本方法测得的不同谷物中加标回收率有效。在单组份检测OTA、AFB1和FB1的基础上,根据最优反应条件,建立了同时检测三种毒素的方法,实现了对多元毒素的定量检测,其中OTA的检测线为0.1 ng/mL,AFB1的检测线为 0.01 ng/mL, FB1的检测线为 0.001 ng/mL。将本文实验方法与ELISA方法测得的加标回收率相对比,结果显示两种方法有较好的相关性,表明本文中的方法具有一定的可行性。

关键词： 木犀草素   叶酸   正常食管上皮细胞   Eca109细胞  

摘要： 目的(1)用木犀草素(Luteolin,Lut)及叶酸(Folicacid,FA)干预经黄曲霉毒素B1(Aflatoxin B1,AFB1)染毒的人正常食管上皮细胞,观察其对细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡、亚甲基四氢叶酸还原酶(methylene tetrahydrofolate reductase,MTHFR)基因、叶酸受体 1(folate receptor 1/a,FOLR1/FRa)基因表达及MTHFR基因启动子区甲基化状态的影响,探索Lut及FA干预对AFBi毒性的保护作用及其机制,为Lut的临床应用及其与FA对预防、控制AFB1对人正常食管上皮细胞的毒性作用提供一定的实验基础和理论依据。(2)Lut干预食管癌Eca109细胞,探讨Lut诱导人食管癌Eca109细胞凋亡的作用及其作用机制。方法(1)AFB1染毒处理对人正常食管上皮细胞生理学的影响:用Cell Counting Kit-8试剂盒(CCK-8)测定AFB1对人食管正常上皮细胞增殖的影响;流式细胞术(flow cytometry,FCM)检测细胞周期变化及细胞凋亡情况。(2)Lut及FA对AFB1染毒处理的人正常食管上皮细胞的干预作用的研究:用Lut及FA干预AFB1处理的人类正常食管上皮细胞,CCK8法检测细胞生长状况,FCM检测细胞周期变化及细胞凋亡情况。(3)Lut及FA对经AFB1染毒的人正常食管上皮细胞MTHFR、FOLR1基因影响的研究:Real-time PCR检测MTHFR、FOLR1 mRNA的表达情况;Western blot检测MTHFR、FOLR1蛋白表达情况;MassArray甲基化定量检测细胞MTHFR基因启动子区甲基化水平。(4)Lut对人食管癌Eca109细胞生理学的影响及其作用机制的研究:四甲基氮唑蓝(Methyl Thiazolyl Tetrazolium,MTT)法检测Lut对Eca109细胞增殖的影响;FCM检测食管癌细胞周期和凋亡情况;Real-timePCR 检测食管癌 Eca109 细胞 CDK2、CyclinA、Caspase9 及 Caspase3mRNA 的表达情况;Western Blot检测食管癌Eca109细胞CDK2、CyclinA、Caspase9及Caspase3蛋白表达水平。结果***1染毒处理对人正常食管上皮细胞生理学的影响:(1)用13μM、25μM、50μM、100μM、200μMAFB1处理人类正常食管上皮细胞24h、48h、72h,均可以抑制细胞增殖;(2)FCM周期检测结果显示,AFB1主要作用于人正常食管细胞的G0/G1期及S期,50μM、100μM、200μM AFB1处理细胞24h,G0/G1期细胞比例明显升高(p<0.05),S期细胞比例明显降低(p<0.05),细胞被阻滞在G0/G1期;(3)100μM、200μMAFB1组细胞凋亡比例明显高于空白对照组(p<0.05),50μMAFB1组早期凋亡细胞比例明显升高(p<0.05)。***及FA对经AFB1染毒的人正常食管上皮细胞的干预作用的研究:(1)Lut及Lut联用FA干预组细胞抑制率明显低于染毒对照组(p<0.05),FA单独干预的效果不明显(P>0.05);(2)Lut、Lut联合FA干预组G0/G1期细胞比例较染毒组明显降低(P<0.05),S期的细胞所占比例明显高于染毒对照组(P<0.05);FA干预效果不明显;(3)Lut、Lut联合FA干预组细胞凋亡率明显低于染毒对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。***及FA对经AFB1染毒的人正常食管上皮细胞MTHFR、FOLR1基因影响的研究:(1)Real-time PCR检测结果显示:AFB1染毒24h上调人正常食管上皮细胞MTHFR、FOLR1mRNA的表达(P<0.05)。经Lut干预后,细胞MTHFR、FOLR1 mRNA的表达明显减少(P>0.05)。用20μM、200μMFA进行干预,细胞MTHFRmRNA的表达未受明显的影响(P>0.05);而200μMFA组FOLR1 mRNA的表达明显下降(P<0.05),20μM FA组下调效果不及200μM FA组(P<0.05)。Lut联用FA干预能明显减弱AFB1对MTHFRmRNA表达的上调影响(P<0.05),Lut联用20μMFA组与Lut联用200μM FA组对经AFB1染毒的人正常食管上皮细胞FOLR1 mRNA表达产生不同的调节作用(P<0.05);(2)实验结果显示,AFB1染毒上调人正常食管上皮细胞MTHFR蛋白的表达(P<0.05),下调FOLR1蛋白的表达(P<0.05)。经Lut干预后,细胞MTHFR蛋白表达减少、FOLR1蛋白表达增加(P<0.05)。20μM、2

关键词： 硒   AFB1   雏鸡   空肠   细胞周期   G2/M调控分子   分子机制  

摘要： 黄曲霉毒素B1（AFB1）是由黄曲霉、寄生曲霉等产生的真菌毒素,广泛存在于发霉的原料和饲料中。AFB1能诱发原发性肝癌、免疫抑制以及机体氧化应激。但是,以AFB1首先接触的消化道作为研究对象的研究较少,且报道不一。目前有关硒拮抗AFB1对机体的危害也越来越引起人们的关注。本实验室前期研究表明肉鸡摄食含AFB1的日粮可致空肠细胞G2/M期阻滞,而日粮中添加亚硒酸钠可以保护这一损伤。但有关AFB1对雏鸡空肠黏膜细胞周期阻滞以及硒对其拮抗作用的分子机理还未见相关的研究报道。本研究以亚硒酸钠作为硒源饲喂摄食AFB1的肉雏鸡,用组织病理学、免疫组织化学、流式细胞术和实时荧光定量PCR等方法,研究空肠组织形态结构变化,细胞周期及G2/M期相关调控因子的动态变化。试验选用240只1日龄科宝肉鸡健雏,随机分为4组,每组60只,分别饲喂对照组（硒的正常含量为0.332mg/kg）日粮、AFB1组（0.6 mg/kg AFB1）日粮、+Se组（在对照组日粮中添加亚硒酸钠为硒源的0.4mg/kg硒）日粮、AFB1+Se组（在AFB1组日粮中添加以亚硒酸钠为硒源的0.4mg/kg硒）日粮共21天。其结果如下:组织病理学检测结果表明,AFB1组中肠绒毛尖部黏膜上皮细胞脱落,绒毛高度和绒毛/隐窝比值均显著或极显著低于对照组、+ Se组和AFB1+ Se组（p<0.01或p<0.05）;与对照组相比,+Se组和AFB1 +Se组的空肠则无明显的组织学损伤变化。流式细胞术检测结果显示,在7日龄时,AFB1组G0/G1期细胞数量百分比显著低于AFB1+Se组（p<0.05）,而在21日龄时,则显著低于对照组（p<0.05）。在7、14和21日龄时,AFB1组G2/M期细胞数量百分比均分别显著或极显著高于其它三个组（p<0.01或P<0.05）;而+Se组、AFB1+ Se组G2/M期细胞百分比与对照组间无明显差异（p>0.05）。免疫组化检测结果显示,在7、14和21日龄时,AFB1组中p53和p21的积分光密度值均分别显著高于其它三个组（p<0.01）,而+Se组则与对照组无明显差异（p>0.05）。在整个试验中,AFB1组中的p-cdc25C、CyclinB和PCNA积分光密度值均显著或极显著低于对照组、+Se组和AFB1+Se组（p<0.01或p<0.05）,而+Se组则与对照组无明显差异性（p>0.05）。实时荧光定量PCR结果显示,与对照组相比,AFBt组中的ATM、Chk2、p53和p21 mRNA表达量在整个试验中均显著或极显著增加（p<0.01或p<0.05）;而Cdc25、Cyclin B3、Cdc2、Mdm2和PCNAmRNA表达量,除了第7日龄的Cdc25和14日龄的Cdc2mRNA表达量无明显变化外,其余在整个试验中显著或极显著降低（p<0.01或p<0.05）。与AFB1+Se组比较,AFB1组中ATMmRNA表达量在第14、21日龄显著或极显著增加（p<0.01或p<0.05）,Chk2、p53和p21mRNA表达量在整个试验中显著或极显著增加（p<0.01或p<0.05）,Cdc25、CyclinB3mRNA表达量在第21日龄显著或极显著降低（p<0.01或p<0.05）,Cdc2mRNA表达量在第7日龄显著降低（p<0.05）,Mdm2mRNA表达量在第7、14和21日龄显著或极显著降低（p<0.01或p<0.05）,PCNAmRNA表达量在第14、21 日龄显著性降低（p<0.01）。此外,+Se组中ATM、Chk2、p53、p21、Cdc25、Cdc2、CyclinB3、Mdm2和PCNAmRNA表达量较对照组无显著性变化（p>0.05）。综上所述,日粮中0.6mg/kgAFB1可阻碍雏鸡空肠黏膜发育,G2/M期阻滞,ATM、p53、p21、Chk2 mRNA 或蛋白表达上调,Cdc25、Cdc2、Cyclin B、Mdm2 和 PCNA mRNA或蛋白表达下调,而饲料中添加0.4 mg/kg硒可缓解这些变化。说明AFB1可能通过激活ATM-Chk2-Cdc25-Cyclin B/cdc2 和 ATM-Chk2-p53 信号通路导致空肠黏膜细胞 G2/M 期阻滞,而硒能抑制AFB1对上述两条通路的激活,这可能是AFB1对雏鸡空肠黏膜细胞G2/M期阻滞以及硒对其拮抗作用的分子机理。

关键词： 提取物   抑制作用   基因互作   抑菌活性   菜豆灰霉病   弯孢叶斑病   病原真菌   金黄色葡萄球菌   中药提取   病原菌   抑菌率  

摘要： 随着时代的发展,人们健康意识的逐渐提高,环境与农产品的安全性受到了广泛重视,而且对农药残留的限制也要求的很严格。近年来,化学农药被大量使用于农业生产中,由于多数在自然环境中不易降解,蓄积能力强,导致污染了环境,使病虫害产生了抗药性,破坏了生态平衡,农作物及畜产品中农药残留量超标,危害了人体健康。而最值得注意的是生产这些化学农药过程中三废的排放问题,按我国1998年生产化学农药约18万t计,年排放的三废超过

关键词： 不良反应   用药安全   中药制剂   调查分析  

摘要： 目的调查分析使用中药制剂的不良反应,为临床不良反应预防提供指导。方法回顾分析68例中药制剂不良反应患者的临床资料,统计其年龄、性别、给药方式、用药类型以及临床表现等资料。结果 40-59岁患者使用中药制剂的不良反应发生率较高,为52.94%,60岁以上患者发生率为22.06%,20-39岁为19.12%,20岁以下发生率为5.88%。静脉给药途径的不良反应发生率为75.0%,其次为口服,占比19.12%。丹参注射液发生不良反应的构成比最高,为20.59%,其次为鱼腥草注射液和双黄连注射液,占比均为17.65%。累及器官(系统)主要为皮肤及附件损害(47.06%),神经系统(17.65%)和消化系统(14.71%)。结论应加强对中药制剂不良反应的监督管理,减少不良反应发生,保障临床用药的安全性。

关键词： 中药   制剂药品   不良反应  

摘要： 目的:研究中药制剂的不良反应,从而提高药品的质量,优化药品的使用。方法:对241份不合格药品质量报告进行检查,在检查结果中,分析药品的不良反应情况。不同药品的主要用途是不同的,在分析时可采用分类检查的方式。结果 :引起不良反应的药物主要是感染药,其余还有很多涉及皮肤和神经系统的药物不良反应。结论 :在临床用药中,需要明确药物不良反应,合理用药可以减少很多不良反应发生的风险,提高用药质量。

关键词： 中药制剂   脂微球   药代动力学   组织分布  

摘要： 目的:利用现代靶向制剂技术，以青蒿素为模型药物，脂微球为载体，研制青蒿素肝靶向脂微球缓释制剂，为未来肝癌的治疗提供新思路、新技术和新制剂。　　方法:采用高效液相色谱法测定青蒿素脂微球和其生物样品中青蒿素的含量;采用高压均质法制备青蒿素脂微球，应用质量源于设计理念，通过Plackett-Burman实验设计和Box-Behnken效应面法优化制备工艺;对青蒿素脂微球的外观形态、粒径分布、Zeta电位、包封率、载药量、PH值等指标进行评价，并对其初步稳定性进行考察;采用透析法考察脂微球和原料药溶液的体外释放度;分别给大鼠尾静脉注射脂微球和原料药溶液，对其药代动力学特征进行比较;分别给小鼠尾静脉注射脂微球和原料药溶液，考察其心、肝、脾、肺、肾各组织在体内的分布特征，并对其靶向性进行初步评价。　　结果:青蒿素脂微球的最佳处方和制备工艺为:蛋黄卵磷脂质量百分比为1.12％、F68质量百分比为0.76％、药物质量百分比0.04％、甘油质量百分比2.0％、大豆油质量百分比10％、油酸钠质量百分比0.03％、均质压力为80MPa、均质温度40℃、均质次数12次;青蒿素脂微球在透射电子显微镜下观察呈圆球形，平均粒径为170nm，包封率为93.1％，载药量为14.53％，Zeta电位为-33.63mV，PH值为7.96;稳定性的初步考察结果表明:脂微球在加速稳定性试验中40℃条件下不稳定，在长期稳定性试验中4℃时脂微球12个月内稳定，粒径、Zeta电位、包封率等均合格。而在25℃时第9个月脂微球出现絮凝状态，振摇可恢复。第12个月时发生分层，出现沉淀且不可逆，表明脂微球应低温储存;青蒿素原料药的体外释放符合First order kinetics模型，而青蒿素脂微球的体外释放符合Weibull模型，表明青蒿素脂微球与青蒿素原料药的体外释放行为存在较大差异，且青蒿素脂微球具有明显缓释作用;青蒿素溶液的药动学行为符合三室模型，t1/2β为0.297h，药-时曲线下面积AUC为8.544mg/L*h。而脂微球的药动学行为符合双室模型，t1/2β为1.124h，药-时曲线下面积AUC为23.704mg/L*h，其生物利用度大大提高;小鼠尾静脉注射脂微球后，肝脏分布最多，肝脏的相对摄取量Re为5.56，靶向效率Te为13.09，体现出良好的靶向性。　　结论:青蒿素脂微球的处方合理，制备工艺科学可行，质量稳定。将青蒿素制备成脂微球，可使药物富集于肝脏病变部位，起到靶向和缓释作用。

关键词： 中药制剂   质量标准   质量控制   指纹图谱   药效学   代谢组学  

摘要： 中药制剂具有成分复杂多样和整体治疗性等特点,其质量控制问题是关乎其疗效、安全性和稳定性的关键问题。由于历史的原因和中药制剂的特殊性,目前我国中药制剂质量标准不够科学合理,并且无法与临床疗效相紧密结合。本文初步分析了影响中药制剂质量的因素和质量控制的现状,讨论了中药制剂质量控制改善的可能途径和新方法,力求保证制剂安全、有效及质量可控。

关键词： 中药提取物复方制剂   新城疫病毒   抑制作用   免疫效果   质量控制  

摘要： 鸽新城疫(newcastle disease,ND)又称鸽瘟或鸽Ⅰ型副粘病毒(pigeon paramyxovirus type 1,PPMV-1),是由新城疫病毒(newcastle disease virus,NDV)引起的一种急性、热性、败血性和高度接触性传染病。为预防和治疗该疾病的发生,大量使用抗生素和化学类药物,导致耐药性和药物残留问题的出现。而且随着生态养殖和绿色食品等概念的提出,我国规定在饲料和食品中严禁使用兽医临床中抗生素类药物和化学类药物。中药具有抗病毒作用效果好、毒副作用小和无耐药性等优点,不但能提高机体免疫力,还能促进生长,提高生产性能等。本研究在中兽医药理论指导下,以金银花、黄芩、连翘、贯叶连翘等10余味中药提取物进行中药提取物复方制剂,研究中药提取物复方制剂的抗病毒能力、免疫增强能力和质量控制标准。结果如下:1.中药提取物复方制剂高剂量(含生药2 g/mL)预防、治疗组和中剂量(含生药1 g/mL)预防、治疗组的血凝效价显著降低(P<0.01),其中中药提取物复方制剂中剂量组(含生药1 g/m L)的效果显著。2.中药提取物复方制剂能够提高NDV疫苗抗体效价,中药提取物复方制剂中剂量组(含生药1 g/mL)的抗体效价差异显著(P<0.05);中药提取物复方制剂中剂量组法氏囊器官指数差异显著(P<0.05);免疫器官内淋巴细胞排列紧密,且淋巴细胞数量高于阳性对照组。3.以黄芩苷为检测成分,利用TLC和HPLC检测方法对中药提取物复方制剂进行质量控制研究。TLC结果显示,黄芩苷供试品和标准品在相应的位置上出现了颜色相同的斑点,阴性对照品中无干扰现象;HPLC结果显示,黄芩苷在浓度为10～200μg/mL之间时线性关系良好,黄芩苷的含量为3727.41 mg/g,在供试品中的黄芩苷峰保留时间与标准品中的峰是一致的,且阴性对照品无干扰现象。中药提取物复方制剂对新城疫病毒具有较好的抑制作用,能够显著提高NDV疫苗抗体效价和法氏囊器官指数,免疫器官内淋巴细胞排列紧密且数量增多。所建立的黄芩苷TLC和HPLC检测方法,专属性强,可快速准确地对中药提取物复方制剂中黄芩苷进行检测。