关键词： 黄曲霉毒素B1   电化学DNA传感器   Po PD修饰电极   三维纳米阵列电极  

摘要： 电化学DNA传感器具有快速、无需标记、灵敏度高等优势,为黄曲霉毒素B(AFB)的监测提供了新的机遇。然而,已报道的AFB电化学DNA传感器存在DNA固定量少、传感器制备过程繁琐和灵敏度差等问题,其根本原因在于DNA固定方法不当、DNA与AFB特异性结合差、电极性质不够好等。因此,本文采用自组装法将巯基化的单链DNA(HS-ss DNA)直接修饰在电极表面,达到简化操作的目的;而且首次对与AFB特异性结合的DNA序列进行了优化研究;本文还引入聚邻苯二胺修饰电极(PoPD/MGE)和三维纳米阵列电极(3DNEEs),利用PoPD聚合物膜活性基团多和3DNEEs表面积大的优势,为DNA的固定提供更多的活性位点,从而提高传感器的性能。具体工作如下:通过Au-S键的强相互作用将巯基化的单链DNA直接组装在MGE表面,构建了DNA/MCH/MGE传感器,该传感器的构建方法较其他方法简单、高效,。对传感器组装过程中的条件以及测试体系进行了优化。采用阻抗谱法对AFB的浓度进行了检测,通过分析传感器的界面组成建立等效电路,对阻抗谱进行拟合。得到传感器的工作区间为5.0×10-10.0×10-8 g/mL,检测限为2.1×10-10g/m L(S/N=3)。本文首次对与AFB特异性结合的DNA序列进行了优化研究。结果表明,用本文优化得到的DNA序列构建的传感器的检测限可达到6.4×10-12 g/m L(S/N=3),明显低于其他研究者所用的DNA序列。传感器的特异性研究结果表明,本文所构建的传感器可以实现对AFB的特异性检测。本文采用电聚合法在MGE表面修饰PoPD聚合膜,利用戊二醛的交联作用固定DNA,构建了DNA/GA/PoPD/MGE传感器。通过对AFB浓度的检测,得到传感器的工作区间为5.0×10-12.0×10-8 g/m L,检测限为3.4×10-12 g/m L(S/N=3)。可以看出,PoPD聚合膜的引入提高了传感器的检测灵敏度。采用模板法制备了金3DNEEs,采用扫描电子显微镜(SEM)和能量色散X射线分析仪(EDX)对其形貌和组成进行了表征。结果表明,制备的纳米线取向一致、分布均匀,并且具有较高的纯度。采用自组装法构建了基于3DNEEs的AFB阻抗型DNA传感器,对3DNEEs表面DNA的固定量进行了计算,结果表明,3DNEEs表面上DNA的固定量比相同几何面积的MGE上DNA的固定量大一个数量级。对AFB的浓度进行了检测,得到传感器的工作区间为1.0×10-12.0×10-8 g/m L,检测限可达到8.0×10-13 g/mL(S/N=3)。该传感器的构建方法简单、高效,而且3DNEEs特殊的三维结构和大的表面积为DNA的固定提供了更多的活性位点,与其他研究者构建的无标记的AFB电化学DNA传感器相比也具有明显的优势。用该传感器对玉米样品中AFB的浓度进行了检测,得到AFB的平均回收率为102.6%。

关键词： 真菌毒素   食品安全   定量检测   快速检测   表面等离子共振  

摘要： 真菌毒素是真菌生长过程中产生的次级代谢产物,广泛存在于食品及饲料中,严重危害人和动物的健康。因此,建立快速灵敏的真菌毒素检测方法对于食品和饲料的安全监管具有重要的意义。免疫学检测方法基于抗原抗体的特异性结合,灵敏度高且简单易操作。本研究建立了适于真菌毒素的免疫学快速检测方法。由于ELISA方法具有检测时间短、前处理简单、低成本、高灵敏度等优点,具有广泛的应用前景,本课题建立了适用于黄曲霉毒素B1(AFB1)的高灵敏ELISA检测方法;由于等离子共振传感器有免标记,实时监测,高灵敏等优点,建立了适于黄曲霉毒素B1定量检测的等离子共振传感器方法;此外,为了获得理想的检测结果,制备了玉米赤霉烯酮免疫亲和柱,该免疫亲和柱可作为有效的样品前处理净化手段,结合其他检测方法可实现玉米赤霉烯酮高灵敏检测。1、通过基质辅助激光解离飞行时间质谱对合成偶联产物AFB1-BSA进行鉴定,监控其是否制备成功;该抗原用于ELISA检测中,测得AFB1单抗的效价为1:8 000,建立的间接竞争ELISA实验方法IC50值为0.224 ng/mL,该抗体对AFB1结构类似物有较高的交叉反应,适用于检测黄曲霉毒素类物质;应用此抗体建立间接竞争ELISA方法,对加标花生样品进行测定,回收率为103.45-132.29%,变异系数为0.74-9.07%,与LC-MS/MS验证试验测定结果相一致。2、优化了金膜表面自组装单层膜形成条件(裸金片浸泡温度及时间)、抗原进样流速、耦合缓冲液、抗原浓度、反应缓冲液、抗体反应浓度和洗脱条件等参数,确定了等离子共振传感器定量检测黄曲霉毒素B1的最佳条件:金片浸泡于4℃、1 mM的巯基十一烷酸乙醇溶液中12 h,抗原进样流速为20μL/min,耦合缓冲液为离子浓度10 mM,pH 4.5的醋酸钠缓冲液,抗原浓度为30μg/mL,固定时间为12.5 min;反应缓冲液为HBS缓冲液,抗体浓度为15μg/m L,反应时间为15 min,流速为20μL/min。该方法对AFB1的最低检测限为0.312 ng/mL,线性范围是0.625-10 ng/m L。与AFB2、AFG1、AFG2和AFM1的交叉反应率分别为72%、33%、43%和48%,表明此方法除了可检测AFB1外,还可用于黄曲霉毒素总量的检测。3、对制备的玉米赤霉烯酮免疫亲和柱的性能进行评价。该免疫亲和柱对ZEN的平均柱容量为580 ng/0.3 m L凝胶;柱空白为0;1 mL甲醇可以将添加标准品洗脱95%以上;连续使用5次后柱容量将下降到初始柱容量的50%。该免疫亲和柱对其它五种玉米赤霉烯酮类似物有较高的交叉反应率,对ZAN、α-ZOL、β-ZOL、α-ZAL和β-ZAL交叉反应率分别为68.4%、63.6%、113.9%、74.4%和90.1%,可用于同时对玉米赤霉烯酮类真菌毒素的富集前处理。当向玉米粉样品中添加的ZEN标准品浓度分别为200 ng/g、500 ng/g和1000 ng/g时,回收率为90.87-121.65%,变异系数为7.00-14.27%,说明此免疫亲和柱可用于实际样品的快速前处理净化。

关键词： 粗多糖   提取工艺优化   单味药材   中药制剂  

摘要： 多糖又称多聚糖(polysaccharide),是由结构不同的单糖通过脱水缩合形成糖苷键,并且通过糖苷键彼此连接在一起而成的链状聚合物。另外多糖具有抗氧化活性,降血糖、降血脂活性及免疫活性等多种生物活性。化学成分含量上的变化通常被认为是中药制剂工艺发生实质性改变的首要表现,在一定程度上可作为评价中药制剂工艺有无实质性改变的一种有用的检测手段。鉴于此,本课题以20种单味药材作为研究对象,考察提取工艺对药材中粗多糖转移的影响,归纳总结出较优工艺,同时对生产上5个以粗多糖作为主要指标性成分的中药复方制剂进行验证分析,探索优化前后工艺与中药复方中药材粗多糖含量的关系,望能为以后实际生产上工艺的优化提供实验依据。以粗多糖的含量作为评价指标,首先通过考察前处理、料液比和提取次数三种不同的影响因素对20种单味药材粗多糖提取含量的影响,优化20种单味药材粗多糖的提取工艺;比较优化工艺与原有工艺提取所得药材粗多糖含量,以探索提取工艺对单味药材粗多糖提取含量的影响;并且总结工艺与药材粗多糖提取含量中的关系规律;另外,本实验对5个包含以上单味药材及指标成分为粗多糖含量的中药复方制剂进行验证分析,对按照原有工艺和优化工艺提取的粗多糖含量进行比较,同时研究处方中重点药材粗多糖含量在全方中的贡献率,探索优化前后工艺与中药复方中药材粗多糖含量的关系。结果显示:在粗多糖含量测定方法的研究中,粗多糖含量测定方法稳定可行,专属性良好,且回收率均在96.00～102.00%之间,符合药典相关规定。在20味药材提取工艺影响因素的研究中,前处理、料液比、提取次数3种不同提取工艺影响因素对20种中药材粗多糖提取含量的影响大小不一,对20种中药材粗多糖提取含量的影响大小为前处理>提取次数>料液比。同时发现,优化工艺能明显提高根及根茎类药材粗多糖的提取量。另外,药材粗多糖提取量百分率的大小与药材饮片性状有关。在提取过程中,饮片提取有效面积越大,饮片表面越疏松,越有利于粗多糖转移到提取溶剂中。在优化工艺对5个中药制剂粗多糖提取含量的影响的研究中,5个中药制剂经过优化提取工艺提取制剂全方粗多糖,制剂全方粗多糖含量提高率分别为:制剂A:89.13%;制剂B:92.22%;制剂C:136.43%;制剂D:68.56%及制剂E:34.43%。由此可见,优化全方粗多糖提取方法可有效提高全方指标性成分即粗多糖含量,从而验证了以上20味中药材可通过优化提取工艺的方法,可提高粗多糖提取含量的结论以及该优化工艺在中药复方中有相同的适用性,从而可对企业实际生产有实际的指导作用。综上所述,本实验通过优化20种单味药材的提取工艺,从中总结归纳出工艺对20种单味药材的影响规律,并且提出优化工艺的建议。同时利用5个复方制剂对此优化工艺进行验证,得出通过优化提取工艺提高药材指标性成分即粗多糖,对中药复方具有普适性,对企业实际生产具有指导意义。

关键词： 姜黄素   黄曲霉毒素B1   亚慢性中毒   肉鸡   免疫功能  

摘要： 黄曲霉毒素(Aflatoxins,AFT)是一类来自霉菌的剧毒性化学物质,以黄曲霉毒素B1(AFB1)的含量最高且毒性最强,由AFB1引起的畜禽中毒对当前畜牧业发展的造成严重威胁。姜黄素(Curcumin)近年来作为一种天然食品添加色素广泛被使用,研究发现姜黄素是一种多效药,具有抗炎、抗氧化、抗病毒感染以及增强机体免疫功能等方面均有良好的药理作用,应用于临床多种疾病的治疗。本研究选取72只1日龄艾拔益加健康肉雏鸡,随机分为6组,分别饲喂空白对照组日粮、姜黄素对照组日粮(450mg/kg姜黄素)、AFB1组日粮(5mg/kg AFB1)及姜黄素添加日粮(分别在AFB1组日粮中添加150mg/kg、300mg/kg和450mg/kg姜黄素构成姜黄素I组、Ⅱ组和Ⅲ组日粮)28d,再以空白对照组日粮继续饲喂7d。第28d和35d时各组取6只鸡剖杀进行取材,通过各组肉鸡的临床眼观变化和剖检观察、三种免疫器官(胸腺、脾脏、法氏囊)脏器指数变化和组织病理学观察及对免疫器官组织中浆细胞数量计数及其核浆面积比的检测。采用实时荧光定量PCR技术,检测各组肉鸡三种免疫器官组织中细胞因子IL-2和IFN-γ的表达水平,分析姜黄素对AFB1亚慢性中毒损伤的免疫器官的保护作用,以及解释姜黄素对AFB1引起的免疫功能下降的缓解作用[29]。丰富对家禽霉菌毒素中毒解毒方法的研究资料,为姜黄素在畜牧业生产实践中的应用提供科学实验依据。结果如下:胸腺:试验第28d和第35d,与空白对照组相比,AFB1组肉鸡胸腺脏器指数均极显著降低(p<0.01),皮质区的细胞核碎片和髓质区的淤血明显增多,浆细胞数量及其核浆面积比极显著降低(p<0.01),胸腺组织中IL-2和IFN-γ表达水平极显著降低(p<0.01);与AFB1组相比,姜黄素I组、Ⅱ组和Ⅲ组肉鸡胸腺脏器指数均增加、胸腺组织学损伤均有不同程度缓解、胸腺组织中浆细胞数量及其核浆面积比均有增加,胸腺组织中IL-2和IFN-γ表达水平均不同程度提高。与28d相比,第35d三个姜黄素干预组肉鸡胸腺上述各项指标均有不同程度增加。脾脏:试验第28d和第35d,与空白对照组相比,AFB1组肉鸡脾脏脏器指数均极显著降低(p<0.01),脾脏红髓区淤血严重,动脉周围淋巴鞘淋巴细胞数减少,脾脏组织中浆细胞数量及其核浆面积比极显著降低(p<0.01),脾脏组织中IL-2和IFN-γ表达水平极显著降低(p<0.01);与AFB1组相比,姜黄素I组、Ⅱ组和Ⅲ组肉鸡脾脏脏器指数均增加、脾脏组织学损伤均不同程度缓解、脾脏组织中浆细胞数量及其核浆面积比均有增加,脾脏组织中IL-2和IFN-γ表达水平均不同程度提高。与28d相比,第35d的姜黄素干预组肉鸡脾脏各项指标均有不同程度增加。法氏囊:试验第28d和第35d,与空白对照组相比,AFB1组肉鸡法氏囊脏器指数均极显著减小(p<0.01),法氏囊淋巴滤泡髓质区淋巴细胞数量减少,细胞核碎片增多,法氏囊组织中浆细胞数量及其核浆面积比极显著降低(p<0.01),法氏囊组织中IL-2和IFN-γ表达水平极显著降低(p<0.01),与AFB1组相比,姜黄素I组、Ⅱ组和Ⅲ组法氏囊脏器指数均增加、胸腺组织学损伤均不同程度改善、法氏囊组织中浆细胞数量及其核浆面积比均有增加,法氏囊组织中IL-2和IFN-γ表达水平均不同程度提高。与28d相比,第35d的姜黄素干预组肉鸡法氏囊各项指标均有不同程度提高。研究结果表明:在含5mg/kg AFB1日粮中添加姜黄素后,可明显缓解胸腺、脾脏和法氏囊由AFB1引起的组织病理损伤、提高免疫器官的脏器指数和浆细胞数量及其核浆面积比,并通过提高IL-2和IFN-γ表达水平缓解AFB1引起的免疫抑制作用。本试验中日粮添加450mg/kg姜黄素对5mg/kg AFB1的拮抗保护作用最优。

关键词： 玉米赤霉烯酮   黄曲霉毒素B1   解淀粉芽孢杆菌   枯草芽孢杆菌   生物降解  

摘要： 玉米赤霉烯酮（Zearalenone,ZEN）和黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1,AFB1）,是由真菌产生的具有强烈毒的次级代谢产物。饲料及食品中的真菌毒素污染严重威胁着人类和动物的健康,因此,探求安全、高效、无毒副作用的清除真菌毒素污染的方法成为研究热点。本研究旨在从发霉饲料和草食动物粪便中筛选出高效降解ZEN和AFB1的微生物,并探索降解特性、机理以及降解产物的致毒活性。试验一降解ZEN菌株的筛选、鉴定及评价以ZEN为唯一碳源和能源,初筛分离到40株存活菌株,复筛从种兔粪便中筛选到菌株H6,降解率最高,达85.37%。结合形态学、生理生化特性和16S rRNA基因测序分析鉴定菌株H6为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。菌株H6以6%接种量发酵培养后,其发酵液在37℃、180 r/min、72 h时,对1μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、15μg/mL和20μg/mL ZEN降解率分别为95.60%,91.38%,93.64%,88.60%和85.80%,其中在12 h和24 h时,对1μg/mL降解率分别为86.69%和89.34%,对20μg/mL的降解率分别为76.67%和84.14%。对于1μg/mL ZEN,在37℃、180 r/min、72 h时,菌株H6上清液和菌悬液的清除率为68.93%和28.70%,而经蛋白酶K、蛋白酶K+SDS和热处理后的上清液几乎无降解活性,80%硫酸铵沉淀的胞外蛋白和聚乙二醇6000浓缩8倍上清的降解率分别为:59.68%和93.80%。ZEN降解产物在MCF-7细胞上的增值率显著降低。LC-MS分析ZEN降解产物分子量为398。以上结果表明从种兔粪便中筛选到的解淀粉芽孢杆菌H6（Bacillus amyloliquefaciens H6）对于1～20μg/mL ZEN均具有较高的降解活性,发挥降解作用的主要是菌株分泌的胞外酶,浓缩上清液具有较好的降解效果,ZEN被降解成分子量为398的无雌激素作用的物质。试验二降解AFB1菌株的筛选、鉴定及评价以香豆素为唯一碳源和能源,初筛分离到42株存活菌株,复筛从羊粪便中筛选到菌株S1,降解活性最高,降解率达61.36%。结合形态学、生理生化特性和16S rRNA基因测序分析鉴定菌株S1为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。菌株S1以10%接种量发酵培养后,其发酵液在37℃、180 r/min、48 h和72 h时,对1μg/mL AFB1的降解率分别为46.21%和80.26%。菌株S1上清液在72 h内对AFB1（1μg/mL）的降解率为55.86%,而经蛋白酶K、蛋白酶K+SDS和热处理后的上清液降解活性几乎消失。硫酸铵沉淀的胞外蛋白对AFB1（1μg/mL）的降解率为30.21%33.13%,而聚乙二醇6000浓缩8倍上清的降解率为85.65%。菌株S1发酵液与AFB1（200μg/mL）在37℃、180 r/min条件下共培养72 h,AFB1降解率为80.64%。降解后的AFB1在鸡胚肝原代细胞中IL-6、TNF-α和Bax的表达量显著降低（p<0.05）。以上结果表明从羊粪便中筛选到的枯草芽孢杆菌S1（Bacillus subtilis S1）对于AFB1具有较高的降解活性,主要发挥降解作用的是菌株分泌的胞外酶,浓缩上清液具有较好的降解效果,AFB1降解后对鸡胚肝原代细胞的损伤作用减弱。

关键词： 离子液体   分散液液微萃取   赭曲霉毒素A   黄曲霉毒素B1   高效液相色谱  

摘要： 真菌毒素污染是我国粮食数量和质量损失的原因之一,其污染途径较广,在农作物收割、不良干燥、包装、贮存以及运输过程中都有可能受真菌毒素的污染。常见的真菌毒素如粮食中的黄曲霉毒素、赭曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、伏玛菌素,水果中的展青霉素、链格孢霉毒素等大部分真菌毒素具有“致癌、致畸、致突变”作用,对人或动物有严重的危害。必须对重点真菌毒素进行检测和严密的监控。通常采用联合免疫技术与高效液相色谱等仪器方法进行真菌毒素的精准测定,这类方法检测真菌毒素灵敏度较高,重复性好,准确度高,单个样品分析时间在1h之内。该类方法成本较高且抗体不易保存。目前前处理技术正朝着微型化、经济环保的方向发展。离子液体-分散液液微萃取（Ionic liquid dispersive liquid-liquid microextraction,IL-DLLME）具有操作简单、检测速度快、成本低、富集效果好等优点,同时因离子液体替代了传统的高毒性氯化物使得IL-DLLME对环境以及人体的伤害更小,尤其是在灵敏度以及环境友好方面具有突出优势。近几年关于IL-DLLME在农产品和食品真菌毒素的检测报导较少,因此研究IL-DLLME在食品中真菌毒素的检测具有重要的现实意义。本研究主要针对农产品和食品中重点真菌毒素黄曲霉毒素和赭曲霉毒素,进行了高灵敏、精准检测的研究。实验主要研究了超声波、涡旋辅助萃取方式,将低毒环境友好的离子液体作为DLLME的萃取剂,结合高效液相色谱检测液态食品如食用油、果汁中的重点真菌毒素黄曲霉毒素B1以及赭曲霉毒素A。选择质地偏硬、均匀的固体颗粒为实验样品,利用温控辅助IL-DLLME对粮食中的黄曲霉毒素B1与赭曲霉毒素A进行同时检测。以含一定水分,质地较软,大小形态不均匀的固体食品为样品,进一步将QuEChERS（quick,easy,cheap,effective,rugged and safe）与IL-DLLME联合,检测葡萄干中的赭曲霉毒素A,并进行了方法学验证。具体结果如下:1、将IL-DLLME与高效液相色谱法结合,建立实验室快速检测液态食品中真菌毒素的方法。以非极性液态食品（食用油）中的黄曲霉毒素B1、极性液态食品（葡萄汁）中的赭曲霉毒素A为目标物,分别对萃取剂及萃取剂体积、分散剂及分散体积、水相pH值、离子强度、辅助方式、萃取时间等影响萃取效果的因素进行了研究。该方法检测食用油中的AFB1平均回收率为86.54%103.92%,相对标准偏差2.86%5.13%,最低检出限为0.03μg/kg,最低定量限为0.13μg/kg,富集倍数为9.90～10.57。该方法检测加标回收率以及实际样品测定结果与SN/T3868-2014检测结果无显著性差异,葡萄汁中的OTA平均回收率为83.88%105.32%,相对标准偏差5.64%7.83%,最低检出限为0.05μg/kg,最低定量限为0.17μg/kg,富集倍数为8.92～9.95,实际样品检测OTA含量未超过欧盟限量标准。本方法、操作简单、成本低、有机试剂用量小,适用于实验室快速检测液态食品中真菌毒素。2、建立了温控辅助萃取IL-DLLME高效液相色谱法同时快速检测粮食中的黄曲霉毒素B1和赭曲霉毒素A的新方法。采用单因素实验对萃取剂类型及体积、水相pH、溶解温度、冰浴时间等影响萃取效果的因素进行了研究。该方法检测粮食中的AFB1平均回收率为84.94%94.98%,最低检出限为0.03μg/kg,最低定量限为0.11μg/kg,富集倍数为4.47～5.64,相对标准偏差低于7.53%;OTA平均回收率为92.65%111.49%,最低检出限为0.08μg/kg,最低定量限为0.15μg/kg,富集倍数为5.01～5.64,相对标准偏差低于6.38%。实际样品检测中AFB1含量与OTA含量均低于国标限量标准,与国标中免疫亲和柱层析净化高效液相色谱检测结果无显著性差异。且本方法操作简单、成本低、有机试剂用量小。3、建立了QuEChERs结合IL-DLLME高效液相色谱法快速检测葡萄干中OTA的新方法。采用单因素实验对净化剂类型及其用量、提取剂pH、离子液体类型及用量、离子强度、萃取时间等影响萃取效果的因素进行了研究。该方法检测葡萄干中的赭曲霉毒素A在0.02～20μg/kg范围内有良好的线性关系（R=0.9998）,最低检出限为0.02μg/kg,最低定量限为0.08μg/kg。加标回收率为86.29%94.52%,富集倍数为7.83～9.90,相对标准偏差低于5%。实际样品检测OTA含量与欧盟标准免疫亲和柱层析净化高效液相色谱检测结果无显著性差异。且本方法操作简单、成本低、有机试剂用量小。

关键词： 凡纳滨对虾   肝胰腺   黄曲霉毒素B1   副溶血弧菌   抗氧化酶   组织病理学   转录组  

摘要： 本论文分别从生理生化和分子水平探讨了致病性副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)和黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1)对凡纳滨对虾(Litopanaeus vannamei)肝胰腺的影响。选取初始体质量(2.2±0.24)g的健康凡纳滨对虾270尾,将其随机分为2组,分别以0 CFU/mL和5×10～7 CFU/mL剂量的致病性副溶血弧菌进行浸浴攻毒实验。在实验第6、12、24和36 h取肝胰腺,进行抗氧化酶活性及免疫相关基因表达测定。结果显示,感染副溶血弧菌后,实验组对虾肝胰腺中超氧化物歧化酶(SOD)活性显著高于对照组(P<0.05),而过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)和谷胱甘肽-S转移酶(GST)活性随感染时间的增加呈现先上升后下降的趋势,CAT活性于12 h时达到最大值,而GSH-PX和GST分别在6 h和24 h时达到最大值,此结果表明副溶血弧菌感染对凡纳滨对虾的肝胰腺抗氧化酶活性有显著影响,对其机体免疫防御系统有明显的破坏作用。Rab蛋白(Rab)和干扰素-维甲酸联合应用诱导细胞凋亡相关基因(Grim-19)表达水平显著高于对照组(P<0.05),抗菌肽crustin和酚氧化酶原(ProPO)基因的表达水平呈现先升高后降低趋势,分别在12和24 h时达到最大值,分别为11.4倍和28.2倍,而GST基因表达水平在12～36 h显著低于对照组(P<0.05)。mTOR信号通路中真核细胞始动因子4E结合蛋白(4EBP)基因的表达水平显著高于对照组(P<0.05),真核细胞翻译启动因子1(eIF4E1A)和真核细胞翻译启动因子2(eIF4E2)基因的表达水平呈现先升高后降低的趋势,分别在12和6 h时达到最大值,分别为2.6倍和1.6倍,核糖体S6蛋白激酶(P70s6k)基因的表达水平显著低于对照组(P<0.05)。上述结果表明,凡纳滨对虾感染致病性副溶血弧菌后,肝胰腺抗氧化酶活性及免疫相关基因的表达均受到显著影响。选取初始体质量(2.40±0.13)g的健康凡纳滨对虾300尾,将其随机分为2组,分别投喂含有0 mg/kg(对照组)和15 mg/kg(实验组)黄曲霉毒素B1(AFB1)的饲料8d,分别取对照组和实验组对虾的肝胰腺进行抗氧化酶活性、显微结构和转录组的测定。利用Illumina双端测序得到约400万高质量读本(reads),de novo组装产生103644个注释基因,其中差异基因有1024个,主要功能包括过氧化物酶代谢、信号转导、转录控制、凋亡、蛋白水解、细胞内吞、细胞粘附和细胞连接等。实验组对虾肝胰腺显微结构明显改变,出现R细胞数量显著减少,萎缩;星状多边形管腔结构消失;肝胰腺上皮层与肌皮层分离;空泡异常肥大,核固缩,细胞裂解和坏死等症状。抗氧化酶(SOD,CAT,GST,GAH-PX)活性显著升高(P<0.05)。上述结果有助于理解黄曲霉毒素B1对对虾肝胰腺的损伤机制,可为对虾免疫及分子毒理学的研究提供理论依据,所获得的大量转录本可为未来对虾基因组学的研究提供参考,为新基因的发现提供丰富的数据资源。

关键词： AFB1   硒   盲肠扁桃体   黏膜免疫   雏鸡  

摘要： 黄曲霉毒素B1(AFB1)是在污染的食品和饲料中最常见的真菌毒素,可以对人和动物产生肝毒性、基因毒性以及免疫抑制等危害。硒是人和动物生长所必需的微量元素,具有抗癌、抗氧化、抗应激、提高生产性能和机体免疫力以及拮抗某些毒物或有毒元素等功能。盲肠扁桃体是禽类最大的肠相关性淋巴组织并在黏膜免疫发挥着至关重要的作用。目前关于硒拮抗AFB1对机体的毒性作用逐渐引起人们的重视,并取得了一定的研究成果,但有关AFB1对盲肠扁桃体免疫毒性作用及硒对其解毒作用还未见报道。本实验选用1日龄科宝健雏252只,随机分为4组,每组63只,分别饲喂对照组(硒含量为0.3mg/kg)日粮、AFB1组(0.6 mg/kgAFB1)日粮、+Se组(在对照组日粮中添加亚硒酸钠为硒源的0.4mg/kg硒)日粮、AFB1+Se组(在AFB1组日粮中添加以亚硒酸钠为硒源的0.4 mg/kg硒)日粮共21天。用光镜、电镜技术、流式细胞术、SABC免疫组化染色和qRT-PCR等方法研究日粮中AFB1致雏鸡盲肠扁桃体免疫损伤及硒对其拮抗作用。光镜结果显示,AFB1组的肠绒毛结构与对照组无显著性差异,但淋巴小结内淋巴细胞数量减少并出现空洞,且显微定量分析显示小结内淋巴细胞数量较对照组和AFB1+Se组显著降低(p<0.01),而+Se组则与对照组相比无明显差异性(p>0.05)。电镜结果显示,AFB1组中可见部分吸收细胞微绒毛脱落,线粒体嵴断裂,胞质电子密度降低,髓样小体出现,细胞连接消失。AFB1+Se组和+Se组的组织结构和超微结构与对照组无明显差异。流式细胞术检测结果表明与对照组相比,在7、14和21日龄,AFB1组的CD3+、CD3+CD4+和CD3+CD8+T淋巴细胞比率均显著降低(p<0.05或p<0.01)。AFB1+Se组T淋巴细胞亚群比率与AFB1组相比显著升高(p<0.05或p<0.01)(7日龄CD3+CD8+T淋巴细胞比率除外)。与对照组相比,AFB1组CD4+/CD8+值仅在21日龄显著降低(p<0.05)。AFB1+Se组CD4+/CD8+值与AFB1组相比无明显差异(p>0.05)。+Se 组 T 淋巴细胞亚群(CD3+、CD3+CD4+和 CD3+CD8+)比率和CD4+/CD8+值与对照组间无明显差异(p>0.05)。实时荧光定量PCR结果显示AFB1组中IL-2、IL-4、TNF-α和IFN-γ mRNA表达量在14和21日龄时显著低于对照组和AFB1+Se组(14日龄的IL-4 mRNA表达量除外)(p<0.05 或p<0.01)。在 7、14 和 21 日龄,+Se 组细胞因子(IL-2、IL-4、TNF-α和IFN-γ)mRNA表达量与对照组间无明显差异(p>0.05)。AFB1组中IgG、IgM和pIgR mRNA表达量在14和21日龄时显著低于对照组(14日龄IgGmRNA表达量除外)(p<0.05或p<0.01),而IgAmRNA表达量在整个试验期间显著低于对照组(p<0.05 或p<0.01)。AFB1+Se组的 IgA、IgG、IgM 和pIgRmRNA表达量在14和21日龄时显著高于AFB1组(14日龄IgGmRNA表达量除外)(p<0.05或p<0.01)。+Se组IgA、IgG、IgM和pIgR mRNA表达量与对照组间无明显差异(p>0.05)。免疫组化检测结果显示AFB1组IgA+细胞数量在7、14和21日龄均显著低于对照组和AFB1+Se组(p<0.01);AFB1+Se组(7日龄除外)IgA+细胞数量与对照组比较无明显差异(p>0.05)。而+Se组IgA+细胞数量与对照组间无明显差异(p>0.05)。结论:日粮中含有0.6 mg/kgAFB1可引起盲肠扁桃体病理性损伤,IgA+细胞数量和IgA、IgG、IgM和pIgR mRNA的表达下降,T淋巴细胞亚群(CD3+、CD3+CD4+和CD3+CD8+)比率和CD4+/CD8+值改变以及免疫相关细胞因子(IL-2、IL-4、IFN-γ和TNF-α)mRNA表达减少,从而损伤盲肠扁桃体免疫功能,而饲料中添加0.4 mg/kg硒可改善AFB1所致的盲肠扁桃体病理损伤以及免疫功能损伤。

关键词： 寄生虫病   中药复方防治   中药提取物   药效学实验   安全性  

摘要： 目的：制备中药复方T最佳提取物，为中药复方T在防治寄生虫病运用提供依据。　　方法：①以感染寄生虫Z的动物L为实验动物，建立药效学评价方法，对8个中药复方进行杀虫试验筛选。②选择不同溶媒提取中药复方T并进行安全性试验。③建立复方T的紫外分析方法，对提取方法、粉碎度、溶媒用量、提取时间和提取次数等单因素进行考察，优选出各单因素水平，采用L9（34）正交设计实验优选出复方T的最佳提取工艺。④制备1g/ml的中药复方T最佳提取物。⑤以乙酸乙酯-丙酮-氨水（10:3:1）为展开剂，碘化铋钾试液为显色剂，采用薄层色谱法对中药复方T最佳提取物进行定性鉴别。⑥选用流动相：甲醇-0.01moL/L硫酸铵溶液（40:60），用磷酸调pH值至4.0;检测波长247nm，采用高效液相法测定复方T最佳提取物中指标成分H的含量。⑦对1g/ml的中药复方T最佳提取物进行药效学实验评价。　　结果：筛选出中药复方T粗提物在20g/ml,4h对动物L的寄生虫Z杀灭率达100％,动物L也出现23.33%的死亡率;选取提取溶媒Ⅱ时，中药复方T的毒性降低，4h杀虫率为100%，48h动物L的死亡率为0;复方T提取物的紫外最大吸收波长是240nm，方法学考察的各项RSD值均小于2％;复方T最佳提取物制备工艺为：粉碎过80目筛网，选用溶媒Ⅱ，回流法提取3次，每次60min，溶媒用量每次为10倍;中药复方T提取物建立的薄层色谱条件乙酸乙酯-丙酮-氨水（10:3:1）可行，对照品和对照品药材、供试品溶液的指示斑点一致，Rf值为0.65;药效学实验中药复方T最佳提取物在15mg/L，4h时对寄生虫Z的杀灭率为100％，观察96h期间实验动物无异常情况。　　结论：中药复方T最佳提取物对动物L的寄生虫Z病安全有效，为开发新药提供了依据。

关键词： 黄曲霉毒素B1   氧化损伤   遗传损伤   DNA损伤   相互作用  

摘要： 黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1,AFB1）是目前已知的真菌毒素中毒性最强、对人类威胁最大的一种毒素。由于其极强的致癌性,并且其化学结构稳定高温下难以被破坏分解,AFB1的暴露最终将会导致各类急性或亚慢性中毒的发生。虽然AFB1的致癌作用及其相关机理已被证实,但其对生物体造成的氧化性、遗传性损伤及其相关机制的研究并不十分明确,这并不利于对黄曲霉毒素（Aflatoxins,AFT）的毒性机制的深入研究,同时也对AFB1的防御体系建立造成了一定的阻碍。本实验对AFB1产生的氧化性、遗传性毒害作用及相关分子作用机制进行了研究,为全面评估AFB1的毒性同时为阐明其他类别的黄曲霉毒素的毒性机理提供一定的借鉴,同时也为黄曲霉毒素的降解脱毒或防御体内中毒提供更多的参考。本实验首先选用40只雄性小鼠,在亚慢性条件下进行连续50天3种不同剂量（0.09375、0.375、1.5mg/kg b.w./day）的AFB1染毒,对血清及脏器中各氧化损伤指标、肝细胞凋亡及其相关信号通路等进行研究,以评估其造成的氧化性损伤及分子机制;对肝脏中DNA链断裂、交联,细胞微核及精子畸形等指标进行考察,以评估其遗传毒性及分子机制。并研究体外条件下AFB1与DNA之间的相互作用机制及其与遗传毒性的相关性。具体的结果如下:（1）经过50天的AFB1染毒后,AFB1对小鼠机体能够造成明显的脏器损伤、血清中谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）水平的显著性升高。各染毒组小鼠体重随染毒剂量的增加而降低,且肝脏、肾脏、睾丸三种器官重量也出现下降趋势,表明该三种脏器受到AFB1染毒的影响。AFB1对机体造成的病理性损伤具体为:低剂量时以炎症效应为主,高剂量时则导致肝细胞局部坏死、肾小球肿胀及肾小管上皮细胞坏死等情况。（2）亚慢性条件下,AFB1能够对小鼠肝脏产生明显的氧化性损伤。不同剂量的染毒组均能够导致肝脏中活性氧（ROS）的升高,中、高剂量组肝脏中超氧化物歧化酶（SOD）、还原型谷胱甘肽（GSH）水平下调表明其抗氧化系统受到损伤,无法启动清除过量的ROS,但低剂量组小鼠肝脏启动其抗氧化机制,免于机体受到过量ROS的损伤。中、高剂量组小鼠肝脏中脂质、蛋白、DNA均受到ROS的攻击,造成氧化性损伤,机体处于氧化应激状态,但低剂量AFB1组小鼠体内的生物大分子物质并不受到显著性的损伤。（3）AFB1产生的氧化性损伤除导致细胞坏死外,凋亡也是一种可能的方式,且肝细胞凋亡率随AFB1浓度的增大而升高,在本试验范围内具有剂量-效应关系。低剂量时AFB1对细胞造成的影响主要以炎症、局部细胞坏死为主,而较大剂量时则以细胞凋亡为主。AFB1介导的肝细胞凋亡分子机制可能与上调Bax、Caspase-3、P53蛋白,下调Bcl-2蛋白的表达有关。AFB1亚慢性染毒诱导的氧化性损伤中存在细胞凋亡的相关分子机制。这提示我们,若能从细胞凋亡的角度入手,更好的对其调控,将有可能为遏制AFB1的氧化毒性提供新的途径。（4）亚慢性条件下的AFB1暴露能够引起雄性小鼠肝细胞DNA链断裂、DNA-DNA交联、DNA-蛋白质交联形成,同时导致精子畸形率升高、微核形成及染色体损伤的增多。该五项指标除DNA-DNA交联外,其余各项指标均随AFB1剂量的增大而升高,并且具有剂量-效应关系,这说明AFB1不仅对体细胞而且对生殖细胞也具有遗传毒性,能产生致突变作用。（5）当较大剂量的AFB1暴露于小鼠时（1.5mg/kg）,DNA-DNA交联率并不随AFB1浓度的增大而升高。这一结果表明,当AFB1浓度增大到一定程度时（1.5mg/kg）,其引发的各种DNA损伤形式中DNA-DNA交联的比例下降,推测其他形式的DNA损伤（如DNA链断裂、DNA-蛋白交联等）所占比重增大。AFB1产生遗传毒性的机制可能是机体氧化应激所产生大量ROS等自由基直接对DNA造成攻击,或是ROS介导的氧化应激间接导致DNA氧化损伤所形成的。（6）AFB1不需经过代谢,能够直接与DNA之间发生相互作用,形成二元复合物。同时DNA能够明显淬灭AFB1的内源荧光,其淬灭类型为静态结合动态淬灭的方式。两者的结合常数为4.12×103 L/mol;相互作用力主要为氢键和疏水相互作用;结合模式为沟槽结合。AFB1的结合导致DNA的构象有轻微的改变,但并没有对其构型造成较大的影响。分子对接结果说明,AFB1与DNA的结合位于小沟槽区,且AFB1的O6和O3原子能够和DA-17、DG16这两个碱基形成三个较强的氢键。这提示我们,AFB1对DNA造成的损伤可能存在新的作用方式,这种方式可能与其毒作用机制有关。综上所述,亚慢性AFB1的暴露能够对小鼠的氧化、遗传系统造成一定程度的损伤,并且其作用机制都与机体处于氧化应激状态、大量ROS的生成有关,这对于其