关键词:
鸡肠道菌群
中药发酵
新城疫
抗病毒
摘要:
中药是我国的“天然医药宝库”,具有多成分、多途径、多靶点、不易产生耐药性的优势,可直接或间接作用于病毒的感染和致病全过程,发挥抗病毒的功效。以金银花为代表的多种中草药具有体内或体外抗新城疫病毒的功能,众多传统中药制剂应用于鸡新城疫的防治,体现出了一定的临床效果。但是,传统中药制剂中的大分子中间物质较多,有效成分含量偏低,导致吸收利用率低和药效不佳。中药具有抗病毒、改善免疫、解热镇痛等作用,益生菌具有降解大分子物质、促进消化吸收、改善制剂口感等作用,二者制成发酵制剂后,将实现药效作用的协同或叠加,为中草药的深入开发利用“打开一扇新的窗户”。本研究对鸡肠道菌群进行分析,分离生物活性更好的益生菌,对抗病毒中药进行发酵,以期产生新的活性物质,提高有效成分的释出,增强其抗病毒作用和对新城疫的疗效。研究结果如下。***白来航母鸡十二指肠、空肠、回肠和盲肠的微生物组成及多样性分析应用16S rDNA高通量测序技术,对SPF白来航母鸡十二指肠、空肠、回肠、盲肠的菌群结构进行分析,得到基因序列354295条、OTU 515个,分别归属于12个门、9个纲、10个目、16个科、14个属和8个种。SPF白来航母鸡肠道菌主要以厚壁菌门(Firmicutes,58.57%)、拟杆菌门(Bacteroidetes,19.60%)、放线菌门(Actinobacteria,17.71%)为主;在属的水平,乳杆菌属(Lactobacillus,42.39%)、梭菌属(SMB53,9.87%)、拟杆菌属(Bactroide,8.66%)、普雷沃菌属(Prevotella,3.95%)占优。在门、属、种三个水平,十二指肠菌种丰度均与空肠的菌落组成最相似,与回肠差异较大,与盲肠的差异最大。单个肠段的微生物多样性分析表明,盲肠的物种最丰富,simpson指数0.07,其次是十二指肠和空肠,回肠的物种最少。通过对4个肠段之间的多样性对比,我们发现,在考虑丰度的情况下,UniFrac多样性指数:盲肠与十二指肠0.741、与回肠0.656、与空肠0.646,说明其差异较大;空肠与十二指肠0.273、与回肠0.225;回肠与十二指肠0.163,差异最小。2.鸡肠道菌优势乳杆菌的分离及鉴定从鸡肠道和粪便中分离到17株细菌,用生化测定和16S rDNA方法鉴定出6种细菌,分别属于嗜酸乳杆菌3株、副干酪乳杆菌1株、非解乳糖链球菌1株、副血链球菌1株、肠膜明串珠菌肠膜亚种1株、唾液乳杆菌2株。对嗜酸乳杆菌14、副干酪乳杆菌11、唾液乳杆菌2-1-1和C1的生长情况进行测定,发现上述乳杆菌的指数生长期、稳定期和衰亡期分别为10~18h、24~36h和36h之后,嗜酸乳杆菌14和副干酪乳杆菌11的生长性能更佳,最高活菌数超过1.0×109CFU/mL。48h发酵液pH值3.7~4.0,前24h是乳杆菌产酸最快的时期,之后放缓;唾液乳杆菌产酸能力更强。4株乳酸菌均具有一定的抗酸作用,pH值3.5和2.5时,部分死亡,但pH值为1.5时,全部死亡;pH 2.5时,嗜酸乳杆菌14的抗酸活性最强,存活率10.1%~13.9%。唾液乳杆菌胆盐耐受性最好,在0.3%胆盐浓度的条件下,存活率接近0.1%,嗜酸乳杆菌14和副干酪乳杆菌11仅能耐受0.1%的胆盐。发酵上清液对大肠杆菌(Ecoli)CMCC44103具有抑制作用,80℃加热10min抑菌作用不变,但上清液pH值上调至5.0时,不再呈现抑菌作用,说明抑菌物质可能为酸或者在低pH值才发挥作用的物质。嗜酸乳杆菌、副干酪乳杆菌已被允许作为饲料添加剂使用,优先选为中药发酵菌株。3.肠道乳杆菌对中药的转化作用鸡源嗜酸乳杆菌、副干酪乳杆菌分别对金银花、栀子、板蓝根提取液进行发酵,HPLC法未发现绿原酸、栀子苷、R,S-告依春主要成分峰的新增或消失,但其它峰有出现峰面积的变化。建立复方中药的小试提取工艺,制备出金栀板青溶液(JZBQ)。金栀板青溶液接种5%乳杆菌发酵发现,中药对鸡源嗜酸乳杆菌轻微抑制,对副干酪乳杆菌无明显抑制作用,菌种生长情况良好,活菌数最高峰值均大于1.9×109CFU/mL,最适发酵时间36h。金栀板青溶液发酵后,绿原酸含量由0.18%提高1.8~2.4倍,其中,混合菌种发酵最佳,最适发酵时间36h。4.金栀板青发酵溶液对鸡的安全性金栀板青发酵溶液(FJZBQ)按185~15000mg/kg的剂量雏鸡灌服,无致死,不影响鸡的正常活动,无外在毒性症状,剖检未见明显病理变化,为无毒兽药(LD50>15000mg/kg);按3.75~15g/kg剂量,连续30天灌服,无致死和毒性表现,血红蛋白、淋巴细胞百分比、红细胞、白细胞与血小板计数无显著差异(P>0.05),但15g/kg剂量减缓增重;按每只鸡O.1mL的用量,非连续应用21天,无毒性