关键词：
免疫分析
化学发光
荧光
农药残留
重金属
黄曲霉毒素B1
摘要：
中药具有数千年的医药文化历史背景,因其良好的治疗效果和较低的毒副作用,在国际上备受关注。但是,中药在走向国际市场的道路上仍然面临诸多阻碍,主要原因是其质量不稳定。农药残留、重金属污染以及霉菌毒素污染等问题是影响中药质量安全的主要源头。为了确保中药的质量安全,促进中药的国际化发展,农药残留、重金属及霉菌毒素的检测正逐渐成为广大药学工作者的研究热点。近年来,针对中药中农药残留的检测方法主要基于色谱和质谱技术,如气相色谱法、高效液相色谱法、电喷雾解析电离质谱法及气相色谱-质谱联用技术等;针对中药中重金属的检测方法主要基于光谱和质谱技术,如原子吸收分光光度法、电感耦合等离子体质谱法、电感耦合等离子体原子发射光谱法及X射线荧光光谱法等;针对中药中霉菌毒素的检测方法主要基于色谱技术,如高效液相色谱法、免疫亲和柱-高效液相色谱法等。以上所述的分析方法均具有较高的灵敏度和准确度,非常适合作为确证方法在实验室使用。然而,这些技术具有操作复杂,仪器昂贵以及样品前处理耗时等不足之处,因此并不适合现场大批量样本的快速筛选和现场检测。化学发光（chemiluminescence,CL）和荧光（fluorescence,FL）是灵敏度较高的光谱技术,此外还具有线性范围宽、仪器要求低、检测时间短及操作简单等优势,非常适合用于中药中农药残留、重金属和霉菌毒素的现场快速筛查。本文将CL与免疫分析技术相结合,构建了一种用于检测中药中农药残留的免疫层析试纸条;将FL与免疫分析技术相结合,构建了两种基于免标记策略的免疫分析方法,分别用于检测中药中的重金属和霉菌毒素。具体研究内容如下:1、基于时间分辨化学发光免疫层析法同时检测甲基对硫磷和吡虫啉本研究提出了一种基于CL动力学分辨策略的多组分免疫分析方法,可用于同时检测中药中的两种农药残留。研究中采用一种新型双功能抗体（BfAb）作为唯一识别试剂,将其包被于试纸条的检测线,基于该新型BfAb的多个不同抗原结合位点,可在试纸条检测线上同时特异性捕获甲基对硫磷和吡虫啉。以CL动力学特征具有显著区别的辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP）和碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）作为CL信号探针,分别标记甲基对硫磷半抗原和吡虫啉半抗原,标记后的两种半抗原可与甲基对硫磷和吡虫啉同时竞争BfAb上的结合位点。加入共反应剂后,同时触发具有闪光和辉光两种动力学特点的CL反应。前者CL信号在2.5秒时达到峰值,后者CL信号随着时间的延长而持续增大,在300秒后两者之间的信号干扰几乎可以忽略不计,为了保证本方法的检测效率,选择300秒作为后者的信号采集时间。在此多组分CL免疫方法中,甲基对硫磷和吡虫啉的线性范围均为0.1-250 ng/mL,检测限均为0.06 ng/mL（3σ）。本研究构建的同时检测甲基对硫磷和吡虫啉的免疫层析试纸条,检测时长为22分钟。该方法已成功应用于当归和甘草的实际样品检测,回收率为95.6-117.0%。2、基于紫外降解技术构建免标记FL免疫分析方法特异性检测铜本研究构建了一种免标记FL免疫分析方法用于检测中药中的重金属（以铜为模型检测物）。首先,将样品中的铜离子(Cu2+)和乙二胺四乙酸二钠（EDTA）充分反应,形成Cu2+-EDTA络合物。以Cu2+-EDTA的单克隆抗体（McAb）作为分子识别试剂,免疫结合Cu2+-EDTA络合物。采用紫外（UV）光降解Cu2+-EDTA-McAb免疫复合物,将Cu2+高效解离出来。利用Cu2+对CdSe/ZnS量子点（QDs）FL的猝灭效果,对Cu2+进行高特异性定量检测,从而建立一种高效的免标记FL免疫分析方法。本研究中,Cu2+的检测范围为10-1000 ng/mL,检测限为0.33 ng/mL（3σ）。此方法无需采用任何标记技术,具备简单、高效、准确等诸多优点,而且该方法可有效避免其它阳离子的干扰。已成功用于西洋参和灵芝中铜的检测,回收率为81.9-128.6%,具有较大的应用潜力。3、基于自增敏策略构建免标记荧光免疫分析方法检测黄曲霉毒素B1本研究基于黄曲霉毒素B1（AFB1）的FL自增敏效应,构建了一种免标记FL免疫分析方法,可用于特异性检测中药中的AFB1。首先,将AFB1的McAb修饰在羧基化磁珠上,实现对AFB1的高效富集和快速分离。其次,将通过磁性分离得到的AFB1-McAb的免疫复合物置于365 nm UV暗箱中进行光衍生反应2小时,可显著增强AFB1的FL。然后,采集增强后的FL信号,实现AFB1的特异性检测。该免标记FL免疫分析方法中AFB1的检测范围为1.0-1000 ng/mL,检测限为0.21ng/mL（3σ）。该方法已成功用于黄芪和丹参的实际样品检测,回收率为95.4%-107.7%。本
欢迎来到三峡大学图书馆！
