关键词： 中药制剂   脑血管疾病   临床治疗   疗效  

摘要： 目的研究几种中药制剂在治疗脑血管疾病的临床疗效。方法选取在我院经过中药制剂治疗过的脑血管患者200位,分为四组,观察记录每组使用中药制剂的效果。结果使用复方丹参滴丸有效率90%,使用丹麦注射剂有效率为84%,使用三七注射剂有效率为82%,使用可达灵片有效率为86%。结论大多数脑血管疾病患者在使用了相关的中药制剂后都得到了较好的恢复,表明中药制剂在脑血管疾病的临床治疗中有显著效果。

关键词： 按病种付费   委员会   备案管理   个人负担   卫生健康   中药制剂   中药饮片  

摘要： 我国组建国家卫生健康委员会3月17日,第十三届全国人民代表大会第一次会议表决通过了《国务院机构改革方案》。该《方案》提出,组建国家卫生健康委员会、国家市场监督管理总局和国家医疗保障局。其中,组建国家卫生健康委员会,作为国务院组成部门。组建后的国家卫生健康委员会的主要职责是,拟定国民健康政策,协调推动深化医药卫生体制改革,组织制定国家基本药物制度,监督管理公共卫生、医

关键词： 小麦   储藏防腐   玉米   黄曲霉毒素B1   降解机制  

摘要： 粮食作物含有大量营养物质如淀粉、蛋白质、脂肪、矿物质等，所以在生长、收获、运输、储藏过程中极易受到霉菌的危害，一旦霉菌大量繁殖，就容易遭受到真菌毒素感染的风险，因此对粮食作物的防霉及脱毒技术一直受到人们关注。本文以小麦和玉米为研究原料，应用纳他霉素协同微波对小麦进行预处理，模拟储藏环境，通过传统真菌培养、单菌落ITS1-4分子鉴定和高通量测序技术对储藏小麦真菌种类和数量及小麦品质的变化进行分析;根据玉米中黄曲霉毒素B1降解研究现状，选取射频-热风联合技术对感染AFB1的玉米进行处理，研究处理过程中AFB1降解情况及相关品质的变化。主要结果、结论如下：　　（1）通过单因素分析了微波功率（200、400、500、640、800W）、加热时间（10、30、50、70、90s）和小麦初始含水量（11.32%、14.7%、17.85%和20.12%）对小麦中黑曲霉致死率的影响，并通过正交试验和小麦品质分析得出最佳工艺：微波800W，加热时间70s，初始含水量14.7%。在此条件下，微波对黑曲霉致死率99.85±1.12%，抑菌效果显著（P<0.05）;种子发芽率95±1%，粗脂肪含量10.21±0.06g/100g，粗蛋白含量30.83±0.49%，与对照相比，差异性并不显著（P>0.05）。说明微波对小麦霉菌具有良好的杀菌效果，并对小麦品质无不良影响。　　（2）纳他霉素（15mg/kg）协同微波（2450MHz，800W）处理的小麦在温度30℃、相对湿度75％加速储藏环境下储存35d，对微生物多样性和小麦品质进行分析。结果表明，储藏35d后，与对照相比，纳他霉素协同微波抑制真菌总数、优势霉菌曲霉和青霉菌菌落倍数为251976，1602.6，6114倍。对储藏品质分析，与对照相比，纳他霉素协同微波处理可有效延缓小麦储藏过程中水分含量、水分活度、脂肪酸值、脂肪酶活的增加及α-淀粉酶活、面筋持水率、过氧化氢酶活的降低;对加工品质分析，与对照相比，纳他霉素协同微波处理的小麦最终黏度和回生值相对升高，峰值黏度、最低黏度、衰减值相对降低，提高小麦亮度L*值3.21，降低b*值0.93。说明协同处理可以有效抑制小麦储藏期间霉菌的生长，并延缓小麦品质的劣变。通过品质和真菌菌落数相关性分析发现，与链格孢属、镰刀霉菌相比，不同抑菌处理的小麦品质与曲霉、青霉相关性更为显著（P<0.05），说明小麦在温度30℃，湿度75%储藏过程中，曲霉和青霉菌比镰刀霉菌、链格孢属更适合生长繁殖。　　通过ITS1-4DNA序列鉴定，储藏35d后，所有样品分离出共13种霉菌，黑曲霉是所有样品中比列最高的真菌。使用Illumina MiSeq测序来进一步研究所有样品的真菌多样性，发现纳他霉素协同微波处理的真菌OTU总数为15，低于对照样品（OTUs:24），微波（OTUs:17）和纳他霉素（OTUs:22）。对样品中属类真菌分布进行主坐标分析（PCoA），不同处理真菌菌群分布差异性较为显著（P<0.05），纳他霉素协同微波处理的主组成分分析PCoA值小于零。因此，通过对储藏小麦真菌多样性和品质分析，纳他霉素协同微波处理可以提供用于控制储藏小麦采后真菌化学抑制剂的替代物。　　（3）射频-热风联合处理玉米中的黄曲霉毒素B1（AFB1），分析不同初始水分含量的玉米（19.05%、22.25%、25.55%）、射频加热温度（55、65、75、85℃）和加热持续时间（10、15、20、25min）对玉米籽粒中黄曲霉毒素B1降解效果及玉米品质的影响。结果表明，射频-热风联合处理可有效降解黄曲霉毒素B1。在高水分含量下，加热温度和时间一定，初始含水量越高，黄曲霉毒素B1降解残留量越高;初始含水量一定，随着加热温度和时间增加，黄曲霉毒素B1降解残留量随之减少，且加热持续时间降解影响效果大于加热温度。射频-热风联合处理玉米籽粒，对其品质并无显著影响。在加热过程中，随着温度和时间增加，与对照相比，蛋白质、脂肪差异性不显著（P>0.05），黏度系数显著降低（P<0.05）;利用低场核磁共振（LF-NMR）探究发现，射频加热过程中水分迁移效果明显，且水分迁移特性与品质呈显著相关性（P<0.05）。

关键词： 霉菌毒素降解   黄曲霉毒素B1   玉米赤霉烯酮   脱氧雪腐镰刀菌烯醇  

摘要： 饲料霉菌毒素污染是影响畜禽健康养殖的主要原因之一。在饲料生产过程中,霉菌毒素污染的原因主要有饲料原材料污染、加工、运输和贮存不当等,在温度、湿度适宜的条件下,霉菌及其孢子极易生长和繁殖,同时产生多种毒素如黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、脱氧雪腐镰刀菌烯醇等。对动物的健康乃至动物性食品安全均构成了严重危害。本论文首先对广东省部分养鸡场的饲料霉菌毒素污染情况进行调查,同时对饲料生产过程中各环节的霉菌毒素进行监测,在此基础上,利用霉菌毒素吸附剂和降解剂对生产关键环节进行处理,从而有效控制饲料中霉菌毒素的含量,最后将处理过后的饲料在试验场进行饲喂,通过对肉禽料肉比和蛋禽综合产蛋率对饲料进行检验,并评估饲养成效。结果表明,从惠州、揭阳地区收集的37个样品中黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、脱氧雪腐镰刀菌烯醇的污染情况严重,所有样品中黄曲霉毒素B1超限率为75.6%,玉米赤霉烯酮超限率为70.2%,脱氧雪腐镰刀菌烯醇超限率为70.2%,根据样品种类区分,其中饲料成品和玉米超限率较高,豆粕样品超限率相对较低。根据以往对霉菌毒素处理经验所使用传统霉菌毒素吸附剂和新型霉菌毒素降解剂,对已知被霉菌毒素污染的饲料进行处理,通过对处理前后霉菌毒素含量的实验室检测,推测可行的霉菌毒素防控方法,继而通过对含有已知毒素浓度的饲料饲喂肉禽和蛋禽,分析肉禽日采食量和3-4周龄日增重以及蛋禽日采食量和综合产蛋率,验证已知霉菌毒素含量的饲料对动物的效果,结果表明经新型生物降解剂处理过后的饲料霉菌毒素含量大幅降低,动物饲喂后肉禽日增重和蛋禽产蛋率正常,可认为生物降解剂将霉菌毒素降解为无毒的其他产物,降解效果理想。

关键词： 姜黄   中药提取物   肝癌细胞   抑制率  

摘要： 目的:原发性肝癌(Primary carcinoma of the liver)简称肝癌,是全球十大肿瘤之一,每年有近60万人因此死亡。我国是肝癌的高发区,且其发病率有不断攀升的趋势。原发性肝癌起病隐匿,确诊时病情大多已经处于晚期,已失去手术根治的最佳时间,且该病手术后的复发率高,放疗、化疗、靶向治疗等其他非手术治疗手段虽可在一定程度上控制肝癌的发展,但同时这类治疗对患者的身与心造成的继发性伤害也较大。因此,探寻安全有效的抗肝癌药物具有重大的现实意义。姜黄、黄芪及绞股蓝是临床上常用的传统中药材,研究表明其均具有抗肿瘤作用,但是姜黄、黄芪及绞股蓝各自提取物的抗肿瘤细胞增殖作用均具有其局限性,因此,本课题遵循中医药配伍取效的特点,将姜黄、黄芪、绞股蓝等六味中药按不同比例组成配方,以期各药物相互作用,达到协同增效的效果,分别用95%、75%乙醇进行成分提取,并进行肝癌细胞增殖抑制、胞内分布、细胞凋亡的观察研究。方法:1.设立多个以姜黄为主要成分的配方,分别用95%、75%乙醇提取其中有效成分。2.以人肝癌SMMC-7721、SK-HEP-1和HepG2细胞及正常肝细胞L02为研究对象,用MTT法、细胞形态学观察法,观察95%乙醇提取物分别对3株人肝癌细胞作用48 h、72 h和96 h的增殖抑制情况及对正常肝细胞L02的毒性。观察75%乙醇提取物对肝癌细胞增殖抑制情况方法同上。比较两种不同浓度乙醇提取物的作用强弱,并筛选出对药物作用最敏感的细胞株和增殖抑制效果最好的提取物。3.用激光共聚焦扫描显微镜观测药物R1、R7在3株肝癌细胞内分布状态。4.应用流式细胞术分析药物R1、R7作用肝癌SMMC-7721细胞的凋亡作用。结果:1.成功分别用95%、75%乙醇制备出以姜黄为配方的提取物。***实验显示:95%乙醇提取的药物R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7对三株肝癌细胞的生长抑制作用具有一定的浓度、时间依赖性,药物R3、R4、R5对3株肝癌细胞增殖的抑制作用均明显低于其他四药,作用72 h后,药物R3对SMMC-7721、SK-HEP-1、HepG2细胞的IC50分别为203μg/ml、211μg/ml、220μg/ml,R4、R5的IC50均未测出;药物R1、R2、R6、R7作用三株肝癌细胞48 h后,抑制作用大小均为R1>R7>R6>R2,作用72 h及96 h后,对SMMC-7721细胞和HepG2细胞增殖的抑制作用大小均为:R1>R7>R6>R2,对SK-HEP-1细胞增殖的抑制作用大小均为:R1>R6>R7>R2,其中药物R6、R7对SK-HEP-1细胞增殖的抑制作用接近。75%乙醇提取的药物R1’、R2’、R6’、R7’对三种肝癌细胞在48 h、72 h、96 h均仅药物R1’测出IC50,且以SMMC-7721细胞对药物作用最敏感,R2’、R6’、R7’的IC50均未测出。两种不同容积乙醇提取的药物相比较,95%乙醇提取物的抗肝癌细胞增殖作用明显优于75%乙醇提取物,作用72 h及96 h,药物R1’对SMMC-7721细胞的IC50较R1对该细胞的IC50上升均大于1倍。以姜黄的配方提取物R1、R7具有良好的肿瘤细胞增殖抑制活性。肝癌SMMC-7721细胞对药物作用最敏感。药物R1、R2、R6、R7对L02正常肝细胞的毒性均较低。***7721、SK-HEP-1、HepG2细胞给药组的细胞核不仅被PI染料染成蓝色,同时出现了药物的绿色荧光,而未给药的空白组只有PI染色的蓝色荧光,由此可见,药物R1、R7主要进入到癌细胞的细胞核内发挥抗癌作用。4.以不同浓度(20μg/ml、15μg/ml、10μg/ml)的药物R1和R7作用SMMC-7721细胞48 h,凋亡率分别为19.89%、12.76%、8.86%和15.78%、11.80%、8.73%。说明药物R1和R7均能促进SMMC-7721细胞凋亡,且凋亡作用具有浓度依赖性,浓度越高,凋亡作用越强。结论:1.以姜黄为配方的提取物R1、R7具有良好的肝癌细胞增殖抑制活性,且对肝正常细胞L02毒性小;SMMC-7721细胞对药物作用最敏感。2.95%乙醇提取物的抗肝癌细胞增殖作用优于75%乙醇提药物。3.药物R1、R7主要进入到癌细胞的细胞核内发挥抗癌作用。4.药物R1、R7均能通过促凋亡机制发挥肝癌细胞增殖抑制作用。

关键词： 恶性肿瘤   三阴性乳腺癌   土贝母   整合素   中药提取物   转移  

摘要： 背景:乳腺癌是女性最常见恶性肿瘤之一,且其发病呈逐年上升趋势。乳腺癌中雌激素受体(estrogen receptors,ER)、孕激素受体(progesterone receptors,PR)及人表皮细胞生长因子受体-2(HER-2)皆为阴性的亚型,即三阴性乳腺癌(triple negative breast cancer,TNBC),该亚型复发转移率高,预后差。在中医理论中,“痰毒流注”是乳腺癌发生转移的重要病机。目的:本研究应用化痰散结解毒药土贝母鲜品二氯甲烷提取物(ETBM)作用于绿色荧光蛋白转染的TNBC裸鼠原位移植瘤及细胞系,以期了解土贝母脂溶性提取物对TNBC的疗效,并初步探索其机制。方法:研究应用绿色荧光蛋白转染裸鼠原位乳腺癌移植技术,通过实时监测了解ETBM对肿瘤生长及转移的作用。通过IncuCyte⑧细胞增殖实验及结晶紫染色法增殖实验,观察ETBM对TNBC细胞系增殖的影响并计算IC50。通过Transwell迁移、侵袭实验及划痕实验,检测ETBM对细胞运动性的影响。经数字基因高通量测序(Digital gene expression sequencing,DGE),检测ETBM处理与未处理细胞的差异基因,进行KEGG通路富集分析,推测ETBM可能影响的生物学功能。进而,应用qRT-PCR,western blot及IHC技术进行分子生物学验证,明确其如何影响整合素及相关蛋白的表达,并检测下游通路关键激酶,如焦点粘着激酶(Focal adhesion kinase,FAK)、Src 家族激酶(Src family kinases,SFKs)及蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)的磷酸化,以明确其对下游通路的影响。通过利用cBioPortal大数据平台对多个数据库中人乳腺癌样本突变情况,及对美国癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)中乳腺癌样本mRNA及蛋白表达数据进行挖掘,探索ETBM作用靶点在人乳腺癌患者中是否存在表达异常,明确临床应用价值。结果:通过动物实验发现ETBM高剂量组(ETBM-H)对TNBC裸鼠原位肿瘤生长有明显抑制作用,虽然其抑制原位瘤体积效果不如阳性对照药物紫杉醇,然经紫杉醇治疗的肿瘤虽然体积缩小,其荧光蛋白强度却有增加趋势,提示肿瘤活性并未降低。且ETBM对肺、淋巴结转移有一定的抑制作用,对照组肺转移发生率为90%,土贝母低剂量组(ETBM-L)为60%,ETBM-H为30%。土贝母高剂量组相比对照组可显著降低肺转移发生率(P<0.05)。根据荧光成像,观察到土贝母两个治疗组肺转移发生面积均较对照组减小。淋巴结转移方面,对照组淋巴结转移率70%,ETBM-L组为50%,ETBM-H组为40%。经紫杉醇治疗的小鼠死亡率10%,ETBM治疗组小鼠皆存活至实验结束,未表现出明显虚弱或痛苦。通过IncuCyte(?)及结晶紫染色法增殖实验,发现ETBM对多种TNBC细胞系具有增殖抑制作用,IC50在45-90μg/ml,而对激素受体阳性乳腺癌细胞MCF-7则生长抑制作用较弱,IC50为475.8μg/ml。在细胞形态上,TNBC细胞从长梭形变得更为椭圆,同时细胞内出现无GFP表达的空泡。通过Transwell小孔实验发现60μg/ml ETBM可明显抑制MDA-MB-231细胞的侵袭,迁移。划痕修复实验也验证了经ETBM处理后的细胞活动度明显降低。DGE测序发现ETBM在转录层面可调控诸多基因,如多种整合素(integrin,ITG)、Rho GTP 酶激活蛋白 5(ARHGAP5)、血管内皮生长因子-A(vascular endothelial growth factor A,VEGF-A)、胰岛素样生长因子-1 受体(insulin-like growth factor 1 receptor,IGF-1R)、血小板衍生生长因子受体 β(Platelet-derived growth factor receptors,PDGF-Rβ)等。根据KEGG通路富集分析,初步推测ETBM可通过调控焦点粘附通路中整合素家族及其下游因子而减弱细胞活动性。通过对细胞及动物标本进行qRT-PCR,western blot及IHC明确ETBM在细胞及裸鼠肿瘤中均可抑制ITGB1、ITGB8及ARHGAP5的表达,且有抑制其他整合素家族基因表达的趋势。并且在细胞内,ETBM下调了通路关键激酶,FAK、Src和AKT的磷酸化,提示其抑制细胞活动性的机制可能与调控整合素及下游通路相关。通过利用cBioPortal大数据平台对人乳腺癌样本突变情况进行探索发现,本研究所涉及的整合素分子在乳腺癌中均存在一定突变。通过对TCGA中乳腺癌样本mRNA及蛋白表达的提取,证明E

关键词： 中药制剂   不良反应   临床分析   报道  

摘要： 目的:总结并研究分析患者在中药制剂使用后的不良反应发生情况。方法:选择2016年10月-2018年4月期间在我院进行中药制剂治疗出现不良反应的患者作为样本研究资料,共有120例,对所有患者均进行中药制剂药物使用的回顾性分析,对中药制剂使用后出现不良反应展开临床分析及报道。结果:此次样本分析中,120例患者中药制剂使用后的不良症状出现,年龄分布情况为18岁及以下的未成年患者构成比为21.67%,共计26例;19岁至60岁的患者构成比为54.17%,共计65例;60岁以上的患者构成比为24.17%,共计29例。73.33%患者由于静脉注射制剂的使用引起不良反应;18.33%患者由于口服制剂的使用引起不良反应;8.33%患者由于外用制剂的使用引起不良反应。66例患者出现皮肤组织的不良反应;53例患者出现消化系统的不良反应;40例患者出现循环系统的不良反应;48例患者出现呼吸系统的不良反应;23例患者出现神经系统的不良反应;17例患者出现泌尿系统的不良反应。结论:中药制剂的临床使用,需要严格按照中医辩证理论进行,在充分了解中药成分的基础上合理用药,明确药物之间的相互作用关系,在根本上降低患者中药制剂使用后的不良反应发生情况,以此提升药物使用的安全性。

关键词： 黄曲霉毒素B1   黄曲霉毒素M1   肠道毒性   肠道蛋白质组  

摘要： 食品遭受霉菌毒素污染的现象在世界范围内普遍存在,不仅给农业生产带来巨大经济损失,还给人类健康带来威胁。在众多霉菌毒素中,黄曲霉毒素(aflatoxin,AF)是较常见且毒性较强的一类。在不同类型的黄曲霉毒素中,黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1,AFB1)是毒性最强的一种,主要污染谷物粮油类食品,黄曲霉毒素M1(aflatoxin M1,AFM1)是AFB1的衍生物,主要污染奶及奶制品。肠道作为机体免疫系统的第一道重要防线,是机体抵御肠腔内细菌、内毒素等病原体以及营养型抗原、毒素等外来污染物进入血液循环和组织器官的重要黏膜屏障。这种屏障功能依赖于完整的肠道上皮层结构,以及稳定健康的肠道内微生物区系结构。肠道细胞作为霉菌毒素早期暴露的细胞,暴露剂量往往高于其他组织细胞;另外肠道细胞属于蛋白质合成及代谢周转率较高且活性较强的细胞,容易成为霉菌毒素攻击的靶细胞,因此在最近的研究报道中,肠道组织及其功能已经逐渐成为研究霉菌毒素毒性作用的新靶点。随着人们生活水平的提高,“牛奶+谷物”的饮食模式已逐步成为常见的家庭膳食模式,在这种模式下,AFB1与AFM1在人体内共存并产生交互作用的潜在风险增加,但是与AFB1或AFM1单独作用相比,AFB1与AFM1共存后对人体健康危害风险是否改变,AFB1与AFM1联合毒性作用发生的分子机制及调控网络是什么等问题未得到解答。因此为了揭示AFB1与AFM1单独及联合作用对动物模型肠道健康的影响,解析毒性作用的蛋白组分子机理,筛选毒性作用靶蛋白开展本试验。本研究首先建立了单一剂量AFB1(0.3 mg/kg b.w.)、单一剂量AFM1(3.0 mg/kg b.w.)及单一剂量AFB1与AFM1联合(0.3 mg/kg ***1+3.0 mg/kg ***1)重复灌胃的ICR小鼠模型,并与灌胃毒素溶剂的小鼠做对照,每组10只小鼠,每天一次重复灌胃28天,期间记录小鼠健康状况及体增重。灌胃结束后处死小鼠,采集小鼠血液、肠道组织及肠道内容物。随后测定脏器指数,血液中的肠道损伤指标水平(血清中二胺氧化酶活性、D-乳酸含量、血清肠型脂肪酸结合蛋白含量及瓜氨酸含量),制作肠道组织切片观测小肠绒毛形态,检测肠道上皮细胞凋亡率,测定肠道杯状细胞数目,观测紧密连接蛋白定位变化规律;分析肠道内容物细菌群落结构变化规律,分析肠道组织蛋白质组变化规律,最后结合本试验结果及文献数据,探讨AFB1与AFM1单独及联合作用对小鼠肠道结构、细胞活力及其屏障功能的损伤途径,发掘AFB1与AFM1单独及联合作用对小鼠肠道细菌群落结构的改变规律,解析AFB1与AFM1单独及联合肠道毒性作用的分子机制。主要试验结果如下:一,AFB1与AFM1联合灌胃组小鼠血液中瓜氨酸含量显著低于对照组及单独灌胃组(p<0.05)。AFB1单独灌胃及其与AFM1联合灌胃组小鼠血液中二胺氧化酶活性显著高于AFM1单独灌胃组及对照组(p<0.05)。AFM1单独灌胃组及其与AFB1联合灌胃组小鼠血液中肠型脂肪酸结合蛋白含量显著高于对照组(p<0.05),且AFB1与AFM1联合灌胃组显著高于AFM1单独灌胃组(p<0.05);各处理组小鼠血液中D-乳酸含量均显著高于对照组(p<0.05),AFB1与AFM1联合灌胃组小鼠血液中D-乳酸含量显著高于单独灌胃组(p<0.05)。与对照组相比,AFB1单独灌胃组小肠全段(十二指肠、空肠及回肠)的绒毛长度显著降低(p<0.05),AFM1单独灌胃组小肠中后段(空肠及回肠)绒毛长度显著降低(p<0.05),AFB1与AFM1联合灌胃组小肠全段的绒毛长度显著降低(p<0.05),且对中后段的影响程度大于两毒素单独作用。AFB1与AFM1单独及联合灌胃未影响十二指肠绒毛隐窝深度,但AFM1单独灌胃组及其与AFB1联合灌胃组小鼠小肠中后段绒毛隐窝深度显著提高(p<0.05)。AFB1和AFM1单独及联合灌胃诱导小肠中后段细胞凋亡,且联合灌胃组细胞凋亡率明显高于单独灌胃组。AFB1和AFM1联合灌胃组结肠杯状细胞的数目显著降低(p<0.05)。另外,AFB1和AFM1联合灌胃组小鼠肠道上皮细胞Occludin1蛋白在细胞顶膜及细胞侧面膜顶端区域的分布减少,而在细胞质的分布增多,ZO-1蛋白在细胞质内发生由顶侧像基底侧的分布移位。二,在细菌群落的门水平、科水平及属水平,三个毒素处理组与对照组相比,小鼠肠道内容物细菌优势菌群均未发生明显排序变化,但不同的毒素处理,仍造成了不同分类水平下细菌菌群丰度的显著变化,其中AFB1灌胃组及其与AFM1联合灌胃组小鼠肠内致病菌或条件致病菌,如Facklamia属、Staphylococcus属、Corynebacterium属细菌丰度显著升高(p<0.05)。而AFM1灌胃组未

关键词： 抗AFB1-IgY   黄曲霉毒素B1   细胞毒性   功能紊乱   基因毒性   氧化损伤   降毒效应  

摘要： 黄曲霉毒素（Aflatoxins,AFs）是一类由真菌寄生曲霉菌、黄曲霉菌等产毒菌株产生的次生代谢产物,广泛存在食品和饲料中。其中,以黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1,AFB1）的肝毒性、基因毒性和免疫毒性最强。卵黄免疫球蛋白（Egg Yolk Immunoglobulin,IgY）又称卵黄抗体,存在于经特定抗原免疫禽类的蛋黄中,与哺乳动物血清IgG具有相同特性,能与抗原特异性识别结合。已应用于婴幼儿食品和畜禽饲料中,抵抗病毒和细菌性疾病的侵害。另对IgY研究发现,IgY还可以有效识别大分子蛋白毒素如蛇毒、细菌外毒素等,起到降低毒素毒性的作用。目前,卵黄抗体对小分子毒素的降毒效应缺少基础研究。本研究首次探讨IgY对小分子毒素的降毒效应和其机制。以小分子真菌毒素AFB1为研究对象,小分子真菌毒素ZEN设为对照,合成半抗原后偶联成人工全抗原,免疫蛋鸡制备得到高纯度和特异性IgY。建立细胞染毒模型探讨抗AFB1-IgY对AFB1诱导细胞毒性、功能紊乱和基因毒性的抑制作用;以及在其它细胞系中对AFB1诱导细胞毒性的抑制作用;同时建立体内AFB1诱导肝损伤模型和代谢实验,探讨抗AFB1-IgY降低AFB1诱发肝基因毒性和氧化损伤效应机制。本论文的主要研究成果及结论总结如下:⑴制备出高纯度和特异性抗AFB1-IgY采用加成法AFB1与乙醇酸（GA）合成半抗原AFB1-GA,ZEN与羧甲氧基胺半盐酸盐（CMO）反应合成半抗原ZEN-CMO,再通过活泼酯法将AFB1-GA和ZEN-CMO半抗原与载体蛋白（BSA和OVA）偶联制备AFB1-GA-BSA和ZEN-CMO-BSA人工抗原,免疫蛋鸡,收集鸡蛋。采用酸性条件下水稀释法和微孔过滤提取蛋黄水溶液,结合盐析法和大分子沉淀法纯化IgY,获得高纯度IgY,纯度为94%。实验发现抗原不同,蛋黄中抗体活性随免疫时间的变化情况也不尽相同,用AFB1-GA-BSA和ZEN-CMO-BSA免疫蛋鸡,均能产生IgY,但产生的活性和时间不同,AFB1-GA-BSA免疫蛋鸡产生IgY的抑制率较高,获得高活性IgY的时间相对较短。本实验中制备的抗AFB1-IgY对抗原AFB1的灵敏度较高,最低检测限LOD为0.06ng/mL,IC50为2.4ng/mL,检测线性范围为0.13～32.8ng/mL,对AFB2、交叉反应率均低于5%,而AFG1和AFG2交叉反应率均低于0.1%,反应出抗AFB1-IgY对AFB1有很好的特异性、识别和结合能力。制备的抗ZEN-IgY对抗原ZEN的灵敏度表现相对较低,最低检测限LOD为9.27ng/mL,IC50为83.76ng/mL,检测线性范围为13.78～508.85ng/mL,对玉米赤霉酮、α-玉米赤霉醇和β-玉米赤霉醇的交叉反应分别小于:85%,20%和20%;而对AFB1和赭曲霉毒素的交叉反应小于2%,反应出ZEN-IgY对ZEN有一定的识别和结合能力,但特异性较差。⑵体外抗AFB1-IgY对AFB1诱导细胞毒性、功能紊乱和基因毒性的抑制作用建立人正常肝细胞L-02体外染毒模型,研究抗AFB1-IgY对AFB1诱导细胞毒,功能紊乱(活性氧化产物和线粒体膜电位和基因毒性的抑制作用。结果显示分别添加0.125μM、0.25μM和0.5μM抗AFB1-IgY与100μM AFB1于培养基中与L-02细胞孵育48h后,细胞的存活率明显升高、凋亡数量下降、周期阻滞和线粒体膜电位变化得到缓解、活性氧化产物降低、DNA损伤改善。并且随着抗AFB1-IgY浓度的增加,相对AFB1处理组抑制凋亡蛋白BCL2和survivin的表达水平随之增加,而促凋亡蛋白caspase-3和BAX的表达水平随之降低,实验结果显示抗AFB1-IgY本身对细胞凋亡蛋白并没有调节作用,细胞的抗氧化蛋白CAT和SOD1的表达水平亦没有随着抗AFB1-IgY的增加活性增加。AFB1进入细胞终产物AFB1-DNA的浓度检测发现随着抗AFB1-IgY的添加,形成的AFB1-DNA加合物浓度逐步降低。综合以上实验结果:随着抗AFB1-IgY的添加,抗AFB1-IgY与AFB1的特异性识别结合后形成蛋白大分子复合物,此复合物不能被细胞所吸收,AFB1进入细胞量减少,随之降低AFB1诱导的细胞毒性、功能紊乱和基因毒性。⑶其它细胞系中抗AFB1-IgY对AFB1诱导细胞毒性的抑制作用基于AFB1主要靶器官肝脏、肠道和生殖系统,选取人肝癌细胞HepG2、人结肠癌细胞HTC-8和人孕早期滋养层细胞Swan 71作为研究对象,建立三种细胞AFB1的染毒模型,进一步补充、丰富抗AFB1-IgY对AFB1诱导细胞毒性的抑制作用数据。结果显示抗AFB1-IgY能降低AFB1对三种细胞存活率的抑制,及AFB1诱导HTC-8细胞的凋亡,

关键词： 硒   AFB1   空肠   细胞凋亡   死亡受体   内质网应激  

摘要： 黄曲霉毒素B(AFB)是一种由真菌黄曲霉和寄生曲霉通过聚酮途径产生的双呋喃香豆素衍生物,能诱发原发性肝癌、免疫抑制以及机体氧化应激。但是,以AFB首先接触的消化道作为研究对象的研究较少,且报道不一。硒元素作为人和动物机体内所必需的微量元素,在一定剂量范围内有抗氧化、抗癌症和增强机体免疫力的功效。目前有关硒缓解AFB对机体造成的毒害作用的研究越来越引起人们的关注。但有关AFB引起雏鸡空肠黏膜细胞中过度凋亡以及硒对其产生拮抗作用的分子机制尚不完全清楚。本研究以亚硒酸钠作为硒源饲喂摄食AFB的肉雏鸡,用组织病理学、TUNEL染色法、流式细胞术和qRT-PCR等方法,研究空肠组织形态的结构变化、细胞凋亡变化以及死亡受体通路和内质网通路上相关调控因子的动态变化。本试验选用1日龄288只科宝肉鸡,随机分为4组(72只/组),分别饲喂对照组日粮(0 mg/kg AFB,0.3 mg/Kg Se)、Se组日粮(0 mg/kg AFB,0.7 mg/Kg Se)、AFB组日粮(0.6 mg/kg AFB,0.3 mg/Kg Se)和AFB+Se组日粮(0.6 mg/kg AFB,0.7 mg/Kg)21天。其结果如下:组织病理学检验表明:仅在AFB组中观察到空肠绒毛尖端黏膜上皮细胞脱落,而对照组、Se组和AFB+Se组的肠绒毛则无明显的组织学损伤变化。在7、14和21日龄时,AFB组的绒毛高度、绒毛/隐窝比值和绒毛面积均显著或极显著低于对照组、Se组和AFB+Se组(p<0.01或p<0.05);与对照组相比,Se组和AFB+Se组的上述指标均无显著性差异。TUNEL染色法检测结果显示,相比于对照组,AFB组中TUNEL阳性细胞数量在7、14和21日龄时均极显著地增多(p<0.01)。与AFB组相比,AFB+Se组中TUNEL阳性细胞数量在14和21日龄时显著减少(p<0.05)。此外,在21天的试验周期中,对照组和Se组二者之间的TUNEL阳性细胞数量无显著性差异(p>0.05)。流式细胞术检测结果显示,相比于对照组,AFB组中空肠细胞凋亡率在7、14和21日龄时极显著升高(p<0.01);而与AFB组相比,AFB+Se组中空肠细胞凋亡率在14和21日龄时极显著降低(p<0.01);此外,在整个试验周期中,Se组与对照组之间,空肠细胞凋亡率无显著性变化(p>0.05)。实时荧光定量PCR结果显示,在死亡受体通路中,相较于对照组,AFB组中FAS,TNF-α,TNF-R1,CASPASE-3和CASPASE-8的mRNA表达量在7、14和21日龄时均显著提高(p<0.05或p<0.01);而FASL和CASPASE-10的mRNA表达量仅在14和21日龄时显著提高(p<0.05或p<0.01)。与AFB组比较,在AFB+Se组中FAS,FASL,TNF-α,CASPASE-3和CASPASE-10的mRNA表达量仅在14和21日龄时显著降低(p<0.05或p<0.01);而TNF-R1和CASPASE-8的mRNA表达量在7、14和21日龄时均显著降低(p<0.05或p<0.01)。在内质网通路中,与对照组相比,AFB组中GRP78和GRP94的mRNA表达量在7、14和21日龄时显著升高(p<0.05或p<0.01)。在AFB+Se组中GRP78和GRP94的mRNA表达量相比于AFB组在14和21日龄时显著降低(p<0.05或p<0.01)。此外,在整个试验周期中,Se组与对照组之间,FAS,FASL,TNF-α,TNF-R1,CASPASE-3,CASPASE-8,CASPASE-10,GRP78和GRP94的mRNA表达量均无显著性变化(p>0.05)。综上所述,日粮中0.6 mg/kg AFB可阻碍雏鸡空肠黏膜的发育,引起FAS、FASL、TNF-α、TNF-R1、CASPASE-3、CASPASE-8、CASPASE-10、GRP78和GRP94 mRNA的表达上调,导致空肠黏膜细胞过度凋亡,而饲料中添加0.4 mg/kg硒可缓解这些变化。这表明AFB可能通过诱导死亡受体FAS/FASL或TNF-α/TNF-R1从而激活上游的CASPASE-8或CASPASE-10,进一步激活下游的CASPASE-3,最终通过死亡受体通路导致细胞凋亡;同时,AFB也可刺激内质网产生内质网应激,激活UPR反应,释放出GRP78和GRP94,引起二者的mRNA表达上调,最终长期的内质网应激引起了细胞凋亡。而日粮中添加硒后能抑制AFB对上述两条通路的激活,这可能是AFB导致雏鸡空肠黏膜细胞过度凋亡以及硒对其拮抗作用的分子机制之一。