关键词： 中药制剂   质量标准   制定   质量控制  

摘要： 中药制剂的成分比较复杂,对其必须制定相应的质量标准,做好质量控制,才能保障其疗效和安全性。本论文主要是对中药制剂的质量标准制定的相关问题进行分析探讨,同时有针对性的介绍了质量控制的相关办法,力争能保障中药制剂的安全、有效及质量可控。

关键词： 降糖类中药制剂   非法添加   化学物质   检验方法  

摘要： 目的探讨降糖类中药制剂中非法添加化学物质的检测方法研究。方法选取C18(4.6 mm×250 mm,4 um)柱固定相,以0.2 mol/L磷酸二氢钠溶液:乙腈=40:60为流动相进行梯度洗脱,流速1.0 mL/min,检测波长240 nm,进样量:20 uL。紫外检测波长为240 nm。结果 6种降糖类中药制剂分离良好,RSD为0.3%-0.7%。结论此方法可以很好的检测降糖类中药制剂中非法添加化学物质,方法灵敏准确。

关键词： 黄曲霉毒素B1和B2   太赫兹   拉曼光谱   超材料  

摘要： 黄曲霉毒素是一类毒性极强的化合物,被世界卫生组织(WHO)的癌症研究机构划定为Ⅰ类致癌物。其中黄曲霉毒素B1的急性毒性为砒霜的68倍,致癌能力为二甲基亚硝胺的75倍,黄曲霉毒素B2与黄曲霉毒素B1化学结构类似,毒性与致癌性相对稍弱。目前对黄曲霉毒素检测的主要方法有薄膜层析法和液相色谱法,然而普遍存在着检测周期长、操作复杂、所需试剂繁多等问题,难以满足现代检测要求,因此亟需一种适用于黄曲霉毒素的快速简便、特异敏感和低耗的检测方法。太赫兹时域光谱技术作为一种新型的无损检测技术,具有光子能量低,波谱范围宽以及光谱信息丰富等优越特点,可以对物质进行定性或定量的无损分析,在食品及农产品安全检测方面具有潜在的应用价值。本文以粮油饲料中常见的两种黄曲霉毒素(Aflatoxin,AFT),黄曲霉毒B1(Aflatoxin B1,AFB1)和黄曲霉毒素B2(Aflatoxin B2,AFB2)为检测对象,以拉曼光谱技术为辅助手段,以太赫兹时域光谱技术为研究主线,建立了黄曲霉毒素B1和B2检测与识别的方法以及定性定量的分析模型。实验获得了AFB1和AFB2粉末纯品的拉曼散射光谱、溶液样品的表面增强拉曼光谱与AFB1和AFB2压片的太赫兹光谱特征。为进一步提高检测的灵敏度,我们开发了基于太赫兹超材料芯片的传感技术,利用表面等离子体共振增强了两种样品在太赫兹波段的差异性,实现了AFB1和AFB2的高灵敏、无标记和低剂量的快速检测,为粮油饲料中黄曲霉毒素的测定提供了一种新思路。本论文的主要研究内容如下:(1)利用拉曼光谱系统测试了500-2000 cm-1波段AFB1和AFB2粉末纯品的拉曼散射光谱与500-1600 cm-1波段AFB1和AFB2溶液的纳米银胶基底表面增强拉曼光谱,利用Gaussian09量子化学程序包中密度泛函理论对AFB1和AFB2的单个分子进行分子动力学计算,获得了AFB1和AFB2理论计算的拉曼散射光谱。分析发现AFB1和AFB2粉末纯品的拉曼散射光谱无法对其进行检测和识别;AFB1和AFB2溶液的拉曼增强光谱具有黄曲霉毒素的拉曼指纹特征,两种样品整体波形和出峰位置较为一致,但是存在可识别两种样品的拉曼光谱特征,因此拉曼光谱技术可以用于检测AFT,并可以对AFB1和AFB2进行有效的识别;密度泛函理论计算得到的振动光谱可以对实验结果进行有效解释,并明确了AFB1和AFB2拉曼特征峰的来源。(2)将AFB1、AFB2样品粉末和聚乙烯粉末按比例混合压片制样后,利用太赫兹时域光谱系统对压片进行透射实验,获得了两种样品压片在0-3.0 THz频段的时域光谱。利用平板介质理论提取了样品的吸收系数和折射率;利用有效介质理论对混合压片中AFB1和AFB2纯品的吸收系数、消光系数、折射率和介电常数进行了提取。通过分析0.5-2.5 THz频段样品混合压片的吸收和折射率光谱以及纯品的吸收系数、消光系数、折射率和介电常数εr光谱对样品进行检测和识别。(3)在太赫兹光谱技术定性鉴别AFB1和AFB2的基础上,选用超薄柔性基底上的非对称双劈裂环结构作为超材料传感器,测试并分析了在0.7-1.1 THz频段AFB1和AFB2溶液的特征透过光谱;根据空超材料共振频率下的相对透过强度和中心共振频率的偏移量不但可以定性的识别出AFB1和AFB2两种黄曲霉素,还可以对其含量进行定量鉴别。为了验证实验结果,利用CST软件有限元模块模拟非对称双开口劈裂环超材料传感器的LC本征共振模式和其传感效果,模拟结果与实验结果一致,验证了使用的太赫兹超材料传感器检测与识别AFB1和AFB2的有效性和实验测试结果的准确性。

关键词： 花生油   黄曲霉毒素B1   黄曲霉毒素总量   色选除杂   碱炼   吸附脱除   蒸馏脱除  

摘要： 花生油历来是我国居民喜爱的高端食用植物油,花生在生长和储藏期间极易吸湿霉变,致使黄曲霉毒素污染严重,作为其加工产物的花生油也存在被黄曲霉毒素污染的威胁,黄曲霉毒素具有“致畸、致癌、致突变”的三致毒性。因此采用有效的方法控制花生油中黄曲霉毒素污染,并对已经被黄曲霉毒素污染的花生油进行有效的脱毒工艺研究是非常必要。本文从花生仁的选料、毛油的制取以及花生油精炼三方面来研究花生油在加工过程中AFT的迁移规律以及脱除效果。（1）研究并优化了GB5009.22-2016《食品中黄曲霉毒素B族和G族的测定》中免疫亲和柱-高效液相色谱-柱后光化衍生-荧光检测器法的色谱条件,建立了一种检测时间短且准确度和精密度均符合检测标准的AFB1、AFB2、AFG1、AFG24种黄曲霉毒素。其加标回收率为86.0%96.4%,相对标准偏差在1.33%8.60%之间。（2）检测26个花生样品的AFT含量,对其中23个取自花生油厂的花生仁原料的检测发现,其中8个花生仁样品的AFB1含量超过国标20μg/kg的限量,超标率为34.78%。可见花生油厂收购的花生原料中AFT超标风险较高,对三个样品进行色选后,三个样品AFB1含量平均下降幅度为67.80%。由此可知在花生油加工过程中优选花生仁原料并严格进行色选,是防范花生原料中黄曲霉毒素超标的关键。（3）对AFT高、中、低含量不同的花生仁样品分别进行低温压榨、高温焙炒压榨和浸出制油,对9个花生毛油中AFT含量的检测结果显示,热榨、冷榨及浸出毛油中AFT含量平均值分别为13.97、18.06、4.71μg/kg,分别是原料花生仁AFT平均含量的27.10%、35.03%、9.14%。压榨毛油中AFB1和AFT含量明显高于浸出毛油。用品质较好的花生仁所制取的3个毛油中AFB1平均含量0.44μg/kg,仅为原料花生仁中AFB1含量的3.53%;用变色霉变花生仁所制取的3个毛油中平均含量为33.39μg/kg,为花生仁中含量的36.60%,含量超出国标限量1.62倍。花生热榨饼、冷榨饼及浸出粕中AFT含量分别为11.82～57.96、9.51～52.06、16.67～100.00μg/kg,平均值分别为30.25、25.83、54.62μg/kg,分别是花生仁中AFT平均含量的58.68%、50.10%、105.96%,浸出花生粕中AFB1和AFT含量明显高于压榨花生饼。三个样品所制得毛油中VE、甾醇含量均为:冷榨毛油>热榨毛油>浸出毛油。品质较好的三个花生毛油中VE、甾醇含量均高于霉变花生所制得的毛油。综上压榨花生毛油中AFT含量明显高于浸出毛油,但压榨工艺可有效保留VE和甾醇。因此必须对花生原料进行色选除杂进而防范花生压榨毛油中AFT含量超标,提高其VE,甾醇含量。（4）采用碱液质量分数6.58%、超量碱0.4%、碱炼温度55℃、碱炼时间20 min的碱炼工艺,在对AFB1含量为21.10～86.70μg/kg、AFT含量为22.76～88.25μg/kg、酸价（以KOH计）为5.09～11.37 mg/g的不同品质的花生毛油的碱炼脱酸过程中,碱炼油中AFB1和AFT降低至1μg/kg左右,达到国标限量和欧盟限量要求。通过单因素及正交试验,得到碱炼脱除极端酸价（31.96mg/g）花生油的最佳工艺条件,即:碱液质量分数:17.67%、超碱量:0.3%、时间:15 min、温度:60℃,可将花生油中AFT含量由:53.80μg/kg降至0.51μg/kg,脱除率高达99.1%。因此得出的两种碱炼脱酸工艺条件可有效脱除花生油中黄曲霉毒素。（5）当活性白土、Norit活性炭、硅胶以及飞洋9805活性炭四种吸附剂的添加量为1%时,除硅胶外,其他吸附剂均可以将AFB1含量脱除至国标限量要求以下。对花生油中AFT的脱除率分别为:86.4%、69.3%、41.9%、80.40%,活性白土与其他三种新型的吸附材料相比,对于花生油中AFT的脱除效果最佳。当活性白土添加量增加至4%时,AFB1与AFT的脱除率上升至最高,对花生油中AFT由31.2μg/kg降至2.32μg/kg,脱除率92.7%。AFB1由28.4μg/kg降至2.08μg/kg,脱除率为92.6%。对脱色花生油进行水蒸气蒸馏脱臭,当脱臭时间为100 min,温度260℃时,脱除率最高,为55.55%,当选用物理精炼脱除花生油中AFT时,吸附可将超标花生油中AFT脱除至安全含量,蒸馏脱臭脱除能力有限,因此主要考虑在吸附脱色的精炼环节对花生油中AFT进行脱除。

关键词： 黄曲霉毒素B1   核酸适配体   生物传感器   金纳米颗粒   核酸外切酶Ⅰ  

摘要： 黄曲霉毒素(Aflatoxin,简称AF)是由真菌黄曲霉和寄生曲霉所产生的毒性代谢产物,是自然界中已发现的理化性质最稳定的一类真菌毒素。黄曲霉毒素的基本结构为二呋喃环和香豆素,目前已发现20多种,如黄曲霉毒素B1(AFB1)、黄曲霉毒素B2(AFB2)、黄曲霉毒素G1(AFG1)、黄曲霉毒素G2(AFG2)等,其中AFB1毒性最强、污染范围最广。研究表明,AFB1具有强烈的致癌、致畸及致突变性,其毒性是氰化钾的10倍。1993年,国际癌症研究机构(IARC)已将AFB1定为Ⅰ类致癌物。目前,我国AFB1的检测方法主要以传统仪器法为主,包括色谱法、原子吸收光谱法、毛细管电泳、超临界流体色谱联用技术等。这些传统检测方法需要特殊的设备和专业人员、样品预处理耗时长、难以实时和现场检测,因此,寻找一种快速、灵敏、简便的方法对AFB1进行定量测定是至关重要的。本文建立了标记型和免标记型两种荧光适配体生物传感平台实现了对AFB1的检测:1.利用金纳米粒子(AuNPs)和适配体上标记的羧基荧光素(FAM)之间荧光共振能量转移效应构建了一种标记型传感平台实现对AFB1的定量检测。该方法对AFB1具有很强的选择性,且灵敏度较高,其线性范围为:5～500 ng/mL,相关系数为:0.9907,检测限为:2.3 ng/mL。2.利用核酸外切酶Ⅰ(Exo Ⅰ)的活性和荧光染料(SYBR Gold)只能够与完整的DNA链结合的特性,构建了一种免标记的荧光适配体生物传感平台。该检测平台对AFB1展现出非常好的灵敏度,其线性范围为:2～400 ng/mL,检测限为1.82 ng/mL。为了进一步证明它的实用性,我们对酱油中的AFB1进行检测,确定了该检测方法不受样品基质的干扰,成功地评估了该方法的有效性和实用性。

关键词： 麦芽   真菌毒素   黄曲霉毒素B1   杂色曲霉毒素   赭曲霉毒素A   电化学免疫检测   自组装  

摘要： 目的受基质本身及外在因素的影响,中药材在生长、采收、加工、储藏和运输过程中极易霉变而污染真菌毒素,影响药材质量和安全,威胁使用者的身心健康。其中,黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1,AFB1）和赭曲霉毒素A（Ochratoxin A,OTA）是中药材中检出率和污染水平较高的两种真菌毒素,且具有较强的肝肾毒性和致癌、致畸、致突变等作用。杂色曲霉毒素（Sterigmatocystin,ST）作为AFB1的前体物质,对AFB1的产生和残留具有较好的预示作用。所以,阐释中药材中ST与AFB1的产生关系,并建立灵敏可靠的分析方法快速检测中药材中真菌毒素的污染水平,对保证药材质量和安全具有重要意义。因此,本课题以“药食两用”麦芽为研究对象,考察其在储藏过程中ST与AFB1的产生关系,并建立灵敏的电化学方法快速检测麦芽中OTA的污染水平,为中药材中真菌毒素的监测提供技术支撑和理论依据。方法由于ST是AFB1前体物质,运用反式培养技术研究染菌与细菌生长最佳条件下AFB1生长情况与ST之间的关系。取生麦芽分两批培养20天,每隔两天取样打粉。并对样品提取溶剂,前处理方法,液相流动相比例进行优化,在最优条件下建立LC-MS检测方法进行检测,进而研究ST与AFB1之间生长关系。基于自组装原理运用巯基乙酸（Thioglycolic acid,TGA）制备自组装膜,并分别利用循环伏安法（Cyclic voltammetry,CV）和电化学阻抗法（Electrochemical impedance spectrum,EIS）对自组装膜（Self-assembly,SAM）进行表征。对自组装膜偶联时间、最佳浓度、偶联温度进行优化,最终获得稳定自组装膜最佳条件。利用制备的Au/TGA自组装膜,偶联牛血清白蛋白结合的OTA抗原（Bovine serum albumin-Antigen,BSA-Ag）,对其最佳时间、最佳浓度和最优温度进行考察,最后优化Au/TGA-BSA/Ag偶联抗体（Antibody,Ab）最佳偶联时间、浓度。在最优条件下建立Au/TGA-BSA/Ag-Ab电化学免疫传感器,并对OTA进行检测,建立标准曲线,进行麦芽样品加标回收检测。结果本研究确定了AFB1和ST在液质中的最佳流动相为含0.1%甲酸和5 mM乙酸铵的水溶液（A相）,含0.1%甲酸的甲醇溶液（B相）,建立了AFB1和ST的标准曲线:AFB1在0.1-50 ng/mL范围内,线性方程为y=55600x-1600（r=0.9999）,检出限为0.03 ng/mL;ST在0.25-100 ng/mL范围内,线性方程为y=64600x+4210（r=0.9993）,检出限为0.04 ng/mL。实验表明在麦芽产菌过程中ST含量与AFB1含量成正比。确定了Au/TGA最佳自组装膜的条件为:在温度为4℃,TGA的浓度为4mmol/L,与金电极偶联时间为90 min时,TGA在金电极上形成稳定的单分子膜。接着利用已建立的Au/TGA自组装膜,确定了Au/TGA-BSA/Ag-Ab传感器的最佳实验条件:在温度为37℃,EDC/NHS浓度比为2:1,活化时间20 min时,对Au/TGA活化效果最佳;然后偶联BSA-Ag,其最佳偶联条件为200μg/mL、45 min和25℃;最后偶联抗体,其最佳偶联条件为200μg/mL,偶联4h。应用在最佳条件下得到的Au/TGA-BSA/Ag-Ab传感器,建立OTA标准溶液的标准曲线,在OTA浓度范围为0.1-1 ng/mL,线性方程为y=0.2219x+0.1888（r>0.99）检出限为（LOD）0.08 ng/mL。并对麦芽样品进行加标回收,OTA的回收率为71.8-97.1%,RSD值小于3%,符合实验要求。结论本实验表明当ST含量达1μg/kg以上时,AFB1含量严重超标,监测ST含量对有效控制AFB1含量至关重要。利用Au/TGA自组装膜建立Au/TGA-BSA/Ag-Ab免疫传感器对麦芽基质进行检测重现性、稳定性和特异性良好,具有良好应用前景。

关键词： 黄曲霉毒素B1   荧光检测   核酸适配体   亲和性能  

摘要： 黄曲霉毒素B1(Aflatoxin B1，AFB1)是指由黄曲霉及寄生曲霉产生的次级代谢产物。AFB1是一类毒性极强的真菌毒素，具有严重的致畸、致癌、致突变作用。国际癌症研究机构已经将AFB1列为I类致癌物。AFB1的污染广泛存在于多种农产品的生长，加工，储藏及运输等各个阶段。世界各国每年因AFB1污染而造成的粮食和经济损失十分严重。当人体食用受AFB1污染的食品后，AFB1可直接在人体内产生毒性效应，危害人体健康。因此，AFB1的灵敏检测对保障食品安全、生态环境和人类健康具有十分重要的意义。传统的AFB1检测方法，如高效液相色谱法，薄层色谱法和酶联免疫分析等，存在操作步骤繁琐，样品前处理复杂，或抗体制备困难，稳定性差等不足。核酸适配体是指通过指数富集系统进化技术(systematic evolution of ligand by exponential enrichment，SELEX)筛选得到的，能够与靶分子特异性结合的一段DNA或RNA。与抗体相比，适配体具有可人工合成，稳定性高，易实现功能化修饰与标记，与靶分子结合后，构象改变等特点，在传感分析应用中更具优势。基于以上研究背景，本论文以可识别AFB1的核酸适配体作为亲和配体，系统表征了适配体的亲和性能，并发展了多种简单，快速，灵敏传感分析AFB1的新方法，主要研究内容包括以下几点:　　(1)以特定位点四甲基罗丹明（tetramethylrhodamine，TMR）标记的适配体为探针，采用荧光各向异性分析(fuorescence anisotropy，FA)技术系统表征了适配体的亲和性能，测定了适配体的亲和力，考察了适配体的结合位点及适配体对AFB1的选择性。TMR标记的适配体与AFB1结合后，构象发生变化，导致TMR与G碱基之间的相互作用发生变化，引起TMR的局部转动受到影响，因而，适配体探针的荧光各向异性值发生改变。根据适配体探针与AFB1结合前后，荧光各向异性值的变化，我们筛选出当TMR标记在含50个碱基的适配体(A50)的T26位点时，其对AFB1的FA响应更灵敏。当适配体被截短为只含26个碱基(A26)时，其与AFB1仍保持较高的亲和力。A50与A26适配体均为简单的茎环结构，茎环结构的稳定性对适配体与AFB1的结合影响较大。环状部位可能是适配体与AFB1的结合位点。适配体与AFB1，AFB2，AFM1，AFM2，AFG1，AFG2的交叉反应率分别为100％，61％，23％，21％，6.3％，6.5％。等温量热滴定分析也证实了适配体的亲和性能。圆二色光谱分析表明适配体与AFB1结合后的构象变化。适配体的亲和性能研究是构建基于适配体的AFB1传感分析方法的基础。　　(2)在研究内容(1)的基础上，以TMR标记的适配体为探针，发展了一种直接模式的荧光各向异性分析法，检测AFB1。我们详细考察了影响适配体与AFB1结合的因素，包括MgCl2浓度，pH，温度，缓冲溶液等。实验发现，缓冲溶液中MgCl2对适配体与AFB1的结合十分关键。在优化的实验条件下，实现了对AFB1的灵敏检测。AFB1的检出限是2nM，检测范围是2nM～1μM。适配体对其他几类常见的真菌毒素（赭曲霉素A，赭曲霉素B，玉米赤霉烯酮，伏马毒素B1及伏马毒素B2）无响应。本方法能够实现多种复杂基质（包括稀释的人血清，尿样，啤酒和红酒样品）中AFB1的检测，玉米面粉中AFB1的回收率为82％～117％。本方法在均相溶液中直接检测AFB1，无需分离，操作简单，成本低廉，仅需要荧光染料标记的适配体为探针，在实际样品的分析中具有较大的应用潜力。　　(3)发展了一种基于毛细管阵列式荧光扫描分析检测AFB1的方法。在特定位点的T碱基上标记荧光素(fluorescein，FAM)的适配体探针与AFB1结合后，荧光强度显著增加。通过采用毛细管阵列式荧光扫描分析，16个AFB1样品的荧光检测仅需1min，每个AFB1样品的用量仅需4～5μL。AFB1的检出限可达0.5nM。本方法操作简单，检测快速，所需样品量较少，适合AFB1的快速和高通量分析检测。　　(4)建立了一种基于适配体的直接模式的表面等离子体共振分析法(surface plasma resonance，SPR)，用于AFB1的检测。适配体被固定在传感芯片表面，用于特异性识别AFB1。适配体与AFB1结合后，SPR信号增大，当缓冲液流过芯片表面时，AFB1解离，导致SPR信号下降。SPR分析实验中，适配体与AFB1的反应是快结合和快解离的过程，适配体芯片无需特殊的再生溶液就可以再生。SPR分析表征出了适配体结合AFB1的动力学参数，测定得到适配体与AFB1的解离常数为12nM。本方法对AFB1的检出限可达0.4nM，能够实现对稀释的啤酒和红酒样品中AFB1的检测。

关键词： 牛磺酸   黄曲霉毒素B1   氧化应激   细胞凋亡   炎症  

摘要： 黄曲霉毒素B1(AFB1)是毒性最强的黄曲霉毒素(AF)之一,广泛存在于发霉的花生、玉米、小麦等农产品及饲料中,严重威胁着人类及动物的健康。AFB1在肝脏代谢过程中,生成有毒代谢产物以及氧自由基(ROS),造成肝脏结构及功能的损伤;同时,AFB1代谢产物主要由肾脏排出体外,可使肾脏发生不可逆损害;AFB1毒性作用也可累及脾脏,引发机体发生炎症反应,降低免疫力。牛磺酸是人和哺乳动物体内的条件性必需氨基酸,在多种原因导致的组织损伤中发挥着抗氧化、抗炎、增强免疫力等生物学功能,但其对AFB1中毒引起的肝、肾及脾脏功能损伤的作用尚不明确。本试验通过制备AFB1中毒大鼠模型,同时饮水中添加牛磺酸,探讨牛磺酸对AFB1中毒大鼠的保护作用及机制,以期为应用牛磺酸预防AFB1中毒提供理论依据。试验一将SD大鼠随机分为3组:采用250μg/kg B.W AFB1灌胃的方式制备动物模型,分别以灌胃相同剂量的生理盐水和AFB1溶剂(DMSO)的大鼠作为正常对照组和溶剂对照组。40天试验结束后,采集大鼠的肝脏、肾脏和脾脏,石蜡切片后显微镜下观察病理变化。试验结果表明:对照组大鼠肝脏、肾脏及脾脏结构正常;AFB1中毒大鼠肝细胞索紊乱,细胞发生颗粒变性及脂肪变性;肾小管上皮细胞肿胀,胞浆呈颗粒变性;脾脏红髓充血,白髓萎缩,红髓、白髓分界不清。对照组大鼠肝脏、肾脏和脾脏结构未见显著病理改变。说明40d连续灌胃AFB1造成了大鼠的肝脏、肾脏和脾脏损伤,成功制备了AFB1中毒大鼠模型,而单独添加溶剂DMSO对脏器结构无显著影响。试验二将SD大鼠随机分为7组:模型制备方法参照试验一进行,正常对照组、溶剂对照组、牛磺酸对照组大鼠分别灌胃相同剂量的生理盐水、DMSO以及2%牛磺酸,牛磺酸干预组大鼠在制备AFB1中毒模型的基础上,饮水中分别添加1%、2%、3%牛磺酸。40d试验结束后,收集大鼠血液、尿液,检测肝功能、肾功能及血液免疫球蛋白水平。试验结果表明:随着试验时间的延长,模型组大鼠采食量逐渐减少,从20d开始,较对照组下降显著(P<0.05);体重较对照组增长缓慢,从第10d开始,与对照组差异显著(P<0.05);肝脏、肾脏指数显著增加,脾脏指数显著下降(P<0.01);血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、乳酸脱氢酶(LDH)活性,尿素氮(BUN)、肌酐(CRE)、尿酸(UA)、胱抑素(Cys-c)水平,尿液ALP、微量白蛋白(m ALB)的水平均高于正常对照组大鼠(P<0.05或P<0.01);血清中免疫球蛋白A(Ig A)、免疫球蛋白M(Ig M)、免疫球蛋白G(Ig G)含量明显低于正常对照组大鼠(P<0.05);牛磺酸干预组大鼠食欲增加,从30d开始,与模型组相比,采食量增加显著(P<0.05);牛磺酸干预组体增重从试验第10d开始较模型组显著增加<0.05);肝脏、肾脏指数较AFB1中毒大鼠明显降低,脾脏指数显著增加(P<0.05);血清ALT、AST、ALP活性、LDH活性、BUN、CRE、UA、Cys-c水平、尿液ALP、m ALB水平显著升高(P<0.05或P<0.01);血清Ig A、Ig M、Ig G含量显著降低(P<0.05或P<0.01),其中2%和3%牛磺酸干预效果优于1%牛磺酸;牛磺酸对照组、DMSO对照组大鼠上述指标与正常对照组大鼠差异不显著。上述结果说明牛磺酸能缓解大鼠的AFB1中毒症状,改善AFB1导致的大鼠肝脏、肾脏和脾脏组织的病理损伤,提高大鼠的肝、肾功能及体液免疫机能,从而在一定程度上保护大鼠免受AFB1导致的毒性损伤。试验三在前期结果的基础上将大鼠随机分为5组:牛磺酸干预组选择2%牛磺酸添加到饮水中,其余各组大鼠处理同试验二。40d试验结束后,采集肝脏、肾脏和脾脏,检测抗氧化能力,肝脏线粒体功能,肝脏、肾脏细胞凋亡情况,肝脏、肾脏Nrf2信号通路和细胞凋亡通路相关因子m RNA表达水平,肝脏、脾脏炎性因子水平及TLR4及下游信号通路相关基因表达水平。试验结果表明:AFB1中毒大鼠肝脏、肾脏和脾脏中超氧化物歧化酶(SOD)、总抗氧化能力(T-AOC)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、谷胱甘肽(GSH)活性/含量显著降低,丙二醛(MDA)水平显著增加(P<0.05或P<0.01);肝脏、肾脏信号Nrf2通路关键因子Nrf2、NQO1、HO-1、GCLC、GSH-Px、SOD m RNA表达显著降低(P<0.05或P<0.01);肝脏线粒体膜电位(MMP)、线粒体解偶联蛋白2(UCP2)、肉毒碱棕榈酰转移酶(CPT-1)、细胞色素C氧化酶(COX)、NADPH细胞色素C还原酶(NCR)水平显著降低(P<0.05或P<0.01);肝脏、肾脏细胞凋亡率显著增加,Bax、B

关键词： 猪繁殖与呼吸综合征   中药提取物   抗病毒作用  

摘要： 猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome,PRRSV),俗称猪蓝耳,是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的一种急性、接触性、高度传染性疾病。该病主要的感染对象是妊娠母猪和仔猪,妊娠母猪表现为繁殖障碍,而仔猪及其各年龄猪则表现为严重的呼吸道症状和持续性的感染。当前国内对于PRRSV的防控主要还是依靠疫苗,主要有弱毒苗和灭活苗两种疫苗,但尚无针对PRRSV的特效抗病毒药物。国外目前对于该病的防控则主要采取净化,最经典的方法就是清群、建群,但这会耗费巨大的人力、物力。因此,急需寻找有效防控PRRSV的新方法和开发安全有效抗PRRSV的药物。中药种类繁多、资源丰富,并且具有毒副作用小、耐药性低等特点。有研究表明,从传统中药中能够提取到具有抗病毒作用的活性成分,其中一些活性成分对PRRSV具有显著的抑制作用。因此从中药中筛选出具有抗PRRSV活性的药物成为一大研究热点。本研究选取了百部、白花蛇舌草、半边莲等21种具有抗病毒活性的中药,采用传统水煎煮法制备成中药提取物,利用Marc-145细胞模型,筛选出具有体外抗PRRSV作用的提取物,并进一步研究其抗病毒作用机制。首先采用噻唑蓝比色法(MTT)确定中药提取物体外对Marc-145细胞的最大安全浓度(MNTC),以利巴韦林为阳性对照药物,采用直接灭活作用方式筛选出对PRRSV的最大抑制率高于50%的中药提取物,进一步研究初筛得到的中药提取物对PRRSV的阻断作用和抑制作用,并结合细胞形态观察,筛选出抗PRRSV的作用效果显著的提取物。结果表明,BJ提取物(由于后续需要对研究成果进行发表和申请专利,故试验中用代号表示)具有显著体外抗PRRSV的活性作用。采用薄层色谱法和高效液相色谱法对BJ提取物进行质量控制研究。BJ提取物薄层色谱(TLC)鉴别结果显示供试品和对照品色谱斑点清晰,可快速鉴别BJ提取物中的有效成分。高效液相色谱法(HPLC)含量测定结果显示所建立的方法灵敏度高,专属性强,重现性好,适用于BJ提取物的质量控制。以利巴韦林为阳性对照药物,分别采用荧光定量PCR方法和Western blot检测BJ提取物在不同时间点三种作用方式下对PRRSV N基因合成和N蛋白表达的影响,并采用Annexin/PI双染法研究BJ提取物对PRRSV所诱导的细胞凋亡的影响。BJ提取物对N基因影响试验中,结果显示,BJ提取物能够抑制N基因的合成,在24 h～72h内,BJ提取物组在三种作用方式下的N基因拷贝数均显著低于病毒对照组(P<0.01),说明BJ提取物能够阻断病毒吸附、抑制病毒复制,并具有直接杀灭病毒的能力。BJ提取物对N蛋白含量影响试验中,结果显示BJ提取物能够抑制N蛋白的表达,在24 h～72 h内,随着时间的增加,各组的N蛋白含量均有所增加,但BJ提取物组的N蛋白含量显著低于病毒对照组(P<0.05),该结果与基因水平检测结果一致。细胞凋亡检测结果显示,在24 h～72 h内,BJ提取物三种作用方式下的细胞晚期凋亡率与细胞对照组均没有显著差异,且总凋亡率显著低于病毒对照组(P<0.05),说明BJ提取物能够抑制PRRSV所诱导的细胞凋亡。本研究首次发现BJ提取物具有体外抗PRRSV的作用,其抗病毒作用机制是通过阻断病毒吸附、抑制病毒复制、直接杀灭病毒以及抑制PRRSV所诱导的细胞凋亡实现。并且,BJ提取物还通过抑制N基因合成和N蛋白表达,发挥其抗PRRSV作用机制。

关键词： 乳腺增生   外用中药制剂   临床前研究  

摘要： 目的观察外用中药制剂对乳腺增生的治疗作用并分析其作用机制。方法采用大鼠后腿内侧肌肉注射苯甲酸雌二醇及注黄体酮制造乳腺增生动物模型。各组大鼠在造模的基础上同时于造模大鼠乳腺部位分别外用赋形剂(空白组)、外用中药制剂(实验组)及三苯氧胺样品(对照组)。实验结束后测定三组大鼠体重、乳晕及乳头直径变化,血清雌激素(E2)及孕激素(P),观察第二对乳房组织病理切片。结果实验组及对照组分别与空白组大鼠体重、乳晕及乳头直径比较均有统计学差异(P<0.05),但实验组与对照组无明显差异;实验组及对照组分别与空白组比较,E2水平明显降低(P<0.05),P水平明显升高(P<0.05);实验组大鼠增生的乳腺小叶、腺泡数、腺泡腔直径、导管直径以及胞浆面积较空白组降低。结论此外用中药制剂可以通过降低血清雌二醇的水平达到治疗乳腺增生的目的。