关键词： 慢性鼻炎   中药制剂   鼻腔冲洗   穴位注射   临床疗效  

摘要： 目的:本研究通过观察中药鼻腔冲洗加穴位注射治疗慢性鼻炎(肺脾气虛型)的临床疗效，寻求慢性鼻炎的多元化治疗方法，发挥中医药优势，同时为治疗慢性鼻炎的研究提供理论与临床依据,使中医药治疗慢性鼻炎的方法在耳鼻咽科中得到丰富，探求一种更好的治疗慢性鼻炎的中医护理方法。　　方法:本研究对象主要来自2017年12月至2018年12月之间贵州中医药大学第二附属医院耳鼻喉咽喉科门诊符合纳入标准的100例慢性鼻炎(肺脾气虚型)患者，按照随机分组原则，分为治疗组50例、对照组50例。治疗组采用中药制剂鼻腔冲洗加穴位注射，对照组采用常规治疗方法即:西药制剂鼻腔冲洗加穴位注射，其鼻腔冲洗液遵医嘱使用下列几种药物进行配制:0.9％生理盐水(NS)200ml、庆大霉素注射液8万单位、注射用地塞米松磷酸钠5mg;穴位注射药物使用0.9％生理盐水(NS)2ml，每天1次，连续治疗14天(两个疗程)。在治疗前后对两组患者采用症状体征评分表进行评分、视觉模拟量表(visual analogue score，VAS)进行临床疗效评定，同时用健康调查简表SF-36(中文版)对两组患者进行生活质量评估,评估中药鼻腔冲洗加穴位注射对慢性鼻炎患者的疗效及生活质量的影响。治疗期间通过观察患者不良反应,进行不良反应及安全性评价。　　结果:1.两组症状体征评分结果:与对照组相比，治疗组症状体征明显改善(P＜0.01)，提示治疗组在缓解患者鼻塞、流涕、鼻黏膜充血和鼻甲肿胀等鼻部症状体征方面要优于对照组;2.对两组治疗后VAS评价,结果显示两组治疗均有效。治疗组较对照组改善更明显，两组间比较有显著统计学意义(P＜0.01)，证明治疗组对于缓解患者鼻塞、流涕效果要优于对照组;3.治疗组总有效率达88％，而对照组的总有效率为72％，两组比较有显著性差异(P＜0.01)，提示治疗组治疗慢性鼻炎的疗效优于对照组:4.通过应用健康调查简表SF-36(中文版)进行生活质量评估，结果提示治疗组对慢性鼻炎患者的生活质量的改善优于对照组。5.通过两组患者复发率调查，治疗组复发率均低于对照组(P＜0.05)。6.不良反应及安全性评价方面提示两组治疗方案安全性高。　　结论:运用中药鼻腔冲洗加穴位注射治疗能明显改善慢性鼻炎(肺脾气虚型)患者鼻腔局部症状，提高患者的生活质量，具有一定的临床应用价值，是一种有效改善慢性鼻炎鼻部症状的非手术途径，并具有安全、不良反应少、耐受性良好的优势。

关键词： 番茄红素   黄曲霉毒素B1   小鼠肾损伤   氧化应激和细胞凋亡   Nrf2信号通路  

摘要： 黄曲霉毒素B(AFB)是一种常见的霉菌毒素,可蓄积在肾脏并引起肾损伤,氧化应激和细胞凋亡是AFB诱导肾损伤的重要病理机制。番茄红素(LYC)具有肾脏保护作用,可增强肾脏抗氧化和抗凋亡能力,但LYC对AFB肾毒性的干预作用尚不清楚。本研究以LYC可干预AFB诱导的肾损伤为理论假说,以雄性昆明小鼠为受试对象,首先将小鼠暴露于梯度剂量的AFB 30 d,建立AFB诱导小鼠肾损伤的亚慢性中毒模型,通过观测小鼠体重、肾脏系数、结构及功能,筛选出后续LYC干预试验所用AFB适宜剂量;而后将80只雄性昆明小鼠分为对照组(CG)、AFB组(AG)、LYC干预组(ALG)和LYC对照组(LG),观测肾脏结构与功能、氧化应激状态、细胞凋亡以及Nrf2信号通路相关因子的表达,旨在评估LYC对AFB暴露小鼠肾损伤的干预作用及机制。试验结果如下:(1)与CG相比,AG小鼠体重及肾脏重量显著下降(p<0.01);与AG相比,ALG小鼠体重升高,但无显著差异(p>0.05),肾脏重量显著升高(p<0.05),且ALG小鼠体重及肾脏重量较CG亦无显著差异(p>0.05),表明LYC可缓解AFB暴露诱导的小鼠生长发育障碍。(2)肾脏显微结构观察显示,CG小鼠肾小球、肾小囊及肾小管结构完整,细胞形态和排列有序紧密,无明显病变;AG小鼠肾小球萎缩,肾小囊上皮细胞增生,部分肾小管上皮细胞脱落、核丢失,肾小管腔狭窄;ALG小鼠肾小球轻微萎缩,部分肾小管上皮细胞细胞核丢失,肾小管腔大小正常,但病变情况较AG明显减轻;LG小鼠肾脏结构较CG无明显差异。肾脏超微结构观察显示,CG小鼠肾脏细胞亚细胞结构完整,细胞核与线粒体形态与结构正常,粗面内质网丰富,细胞质质地均匀;AG小鼠肾脏细胞核体积变小,核膜模糊不清,核孔变大,线粒体肿胀,线粒体嵴减少,部分线粒体呈空泡化,溶酶体增多,粗面内质网减少,胞浆质地不均匀;ALG小鼠肾脏线粒体肿胀,但损伤情况较AG明显减轻,亚细胞结构基本恢复正常;LG小鼠肾脏细胞形态较CG无明显差异,表明LYC能够缓解AFB诱导的肾脏结构损伤。与CG相比,AG小鼠血清SCR、BUN及尿液中NAG、β-Mg含量显著升高(p<0.01);与AG相比,ALG小鼠上述指标含量显著降低(p<0.01),表明LYC能够缓解AFB诱导的肾脏功能损伤。(3)与CG相比,AG小鼠肾脏T-AOC水平、GSH含量、SOD和CAT活性显著降低(p<0.01),MDA、HO和ROS含量显著升高(p<0.01);与AG相比,ALG小鼠肾脏T-AOC水平、GSH含量、SOD和CAT活性显著升高(p<0.01),MDA、HO和ROS含量显著降低(p<0.01);LG小鼠肾脏T-AOC较CG显著升高(p<0.05),MDA含量较CG显著降低(p<0.05),表明LYC能够抑制AFB暴露引起的小鼠肾脏氧化应激。(4)电镜观察可见,CG小鼠肾脏细胞核膜结构完整,核质均匀分布;AG小鼠呈现核质聚缩,核质溶解,核膜结构不完整且模糊不清的典型凋亡特征;ALG小鼠细胞核形态正常,凋亡特征较AG明显较少。与CG相比,AG小鼠肾脏MMP及Bcl-2蛋白表达显著降低(p<0.01),Cyt-c、Caspase-3、Caspase-9及Bax的蛋白表达/活性及Bax/Bcl-2显著升高(p<0.01);与AG相比,ALG小鼠肾脏MMP和Bcl-2蛋白表达显著升高(p<0.01),Cyt-c、Caspase-3、Caspase-9及Bax的蛋白表达/活性及Bax/Bcl-2显著降低(p<0.01),表明LYC可抑制AFB暴露引起的肾脏细胞凋亡。(5)与CG相比,AG小鼠肾脏Nrf2 mRNA表达显著升高(p<0.05),Nrf2胞核和胞质蛋白含量显著降低(p<0.01);与AG相比,ALG小鼠肾脏Nrf2 mRNA表达、Nrf2胞核和胞质蛋白含量显著升高(p<0.01);LG小鼠Nrf2 mRNA表达、Nrf2胞核和胞质蛋白含量较CG显著升高(p<0.01)。与CG相比,AG小鼠肾脏NQO1、CAT、SOD、GSS、GCLC和GCLM mRNA及蛋白表达显著降低(p<0.05,p<0.01);与AG相比,ALG上述指标mRNA及蛋白表达显著升高(p<0.05,p<0.01);LG上述指标mRNA及蛋白表达较CG显著增加(p<0.05,p<0.01),表明LYC可激活Nrf2信号通路,上调肾脏组织抗氧化酶的表达,缓解AFB对抗氧化系统的抑制作用。结论:LYC可有效缓解AFB诱导的小鼠肾损伤,且与氧化应激的缓解、线粒体细胞凋亡途径的抑制及Nrf2信号通路的激活有关。

关键词： 中药制剂   空肠营养   重症胰腺炎   临床效果  

摘要： 目的 对中药制剂配合空肠营养治疗重症胰腺炎的临床效果进行观察并分析.方法 选取我院2017年6月至2018年6月收治的重症胰腺炎患者160例,将其按照治疗方法的不同分为对照组(80例,使用空肠营养方法进行治疗)和治疗组(80例,使用中药清胰汤方剂配合空肠营养进行治疗),对两组的治疗效果进行整理和分析.结果 两组患者在治疗后病情均有一定程度上的好转,但治疗组的治疗总有效率明显高于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05).结论 在对重症胰腺炎患者实施临床治疗时,使用中药制剂配合空肠营养的治疗方法能够取得更加显著的临床疗效,有较高使用价值.

关键词： 黄曲霉毒素B1   免疫层析分析   纳米抗体   酶联免疫技术   随机突变  

摘要： 黄曲霉毒素B1（AFB1）分布广泛,可以致癌、致畸和致突变,且在食品中检出率较高,严重威胁人类和动物的健康。酶联免疫分析技术和胶体金免疫层析技术因其特异性强、高通量、简单快速、低成本等优点成为检测黄曲霉毒素的常用方法之一。然而,随着人们对食品安全和质量的要求越来越严格,这两种免疫学分析方法由于其检测灵敏度偏低的局限性,已经无法满足某些实际应用的需求。因此如何提高这两大免疫学检测方法的灵敏度已成为当前亟待解决的主要问题。驼源性纳米抗体作为目前体积最小的基因工程抗体,具有稳定性高、生产周期短、产量高,易于遗传信息改造、成本低等优点,已经被广泛应用于食品安全检测等领域。为了提高酶联免疫分析技术和胶体金免疫层析技术的检测灵敏度,本文以驼源性纳米抗体为主要实验材料,紧紧围绕着提高检测信号的灵敏度和改进免疫学元件亲和力两个策略进行了如下研究:1生物素化纳米抗体的制备及应用的研究（策略一:提高检测信号的灵敏度）通过化学生物素法和酶催化生物素法标记纳米抗体,得到了三种生物素化纳米抗体,即G8-L-Biotin（长臂）、G8-S-Biotin（短臂）和G8-Biotin（酶催化法）。分别建立了基于这三种抗体的BAS-ELISA(Biotin（strept）avidin system enzyme-linked immunosorbent assay),得到其IC50为7.71 ng/mL（G8-L-Biotin）、3.85 ng/mL（G8-S-Biotin）和1.30 ng/mL（G8-Biotin）。由此可见,基于G8-Biotin建立的BAS-ELISA其灵敏度比基于其它两种抗体建立的方法学（BAS-ELISA）的灵敏度分别提高了6倍和3倍。以G8-Biotin和生物素链霉亲和素系统建立了检测谷物中AFB1的BAS-FLEIA(Biotin（strept）avidin system plus fluorescent enzyme-linked immunosorbent assay),该方法的半抑制浓度(IC50)为0.26 ng/mL,检测限（LOD）为0.03 ng/mL,线性范围(IC20-IC80)为0.09-0.74 ng/mL,与其它四种真菌毒素（DON、FB1、OTA、ZEN）未见有明显的交叉反应,加标回收率为96-112.8%、变异系数为3.28-9.07%。2纳米抗体-纳米荧光素酶（G8-Nluc）的融合表达、活性分析及其应用的研究（策略一:提高检测信号的灵敏度）制备了纳米抗体-纳米荧光素酶（G8-Nluc）融合蛋白,选择CTZ-Native、CTZ-400a和CTZ-H三种CTZ类似物作为纳米荧光素酶的底物,对G8-Nluc中纳米荧光素酶的活性进行分析,结果显示,纳米荧光素酶具有良好的活性,初始发光强度（RLUmax）的顺序是CTZ-H（2.3×10～6）>CTZ-400a（1.5×10～6）>CTZ-天然（2.5×10～5）,与其他两种类似物相比,CTZ-H显示出最强的信号,因此选择CTZ-H作为纳米荧光素酶的最佳反应底物;为了增加反应的最大发光强度和延长反应的半衰期,确定了最佳的缓冲液（pH=8.0,含有1%Tergitol NP-10的10 mM PBS,0.25 mg/mL BSA和8.80 mM ***2）,与商业化Glo-lysis和Passive lysis缓冲液相比,该缓冲液配方最大发光强度分别提高了1.50倍和1.80倍,最大发光强度的半衰期延长了2.50倍和9倍,可用于基于纳米荧光素酶及其融合蛋白的高通量免疫测定。以G8-Nluc融合蛋白为检测探针,建立了谷物中AFB1的一步生物荧光酶联免疫分析法BLEIA（bioluminescent enzyme immunoassay）。该方法的IC50为0.41ng/mL,线性范围为0.10-1.64 ng/mL。基于G8-Nluc融合蛋白的BLEIA的灵敏度比基于G8纳米抗体的经典两步ELISA(IC50=8.14 ng/mL)灵敏度提高约20倍,玉米和燕麦的加标回收率分别为98-113%和91-106%,变异系数分别为2.56-9.47%和4.00-8.25%,与其它四种真菌毒素（DON、FB1、OTA、ZEN）未见有明显的交叉反应。3基于五价纳米抗体单体的免疫层析检测技术及其应用的研究（策略二+策略一:改进免疫学元件亲和力+提高检测信号的灵敏度）构建了G8-CTB原核表达载体pET25b-CTB-G8,并将其转化到*** BL21（DE3）感受态细胞中,表达纯化后获得了G8-CTB五聚体的单体;采用种子增长法制备花状纳米金（AuNFs）溶液,将G8-CTB与花状纳米金AuNFs（Gold nanoflowers,AuNFs）进行偶联,制备

关键词： 黄曲霉毒素B1   白藜芦醇   Nrf2信号通路   基因表达   MAC-T细胞   牛乳腺上皮细胞  

摘要： 黄曲霉毒素因其分布广毒性强,一直以来对畜牧生产都是一个不可忽视的威胁。而对于奶牛来说,黄曲霉毒素不仅毒害奶牛自身同时也可通过牛奶间接威胁人类健康。白藜芦醇在近二十年间被科研人员进行了大量的研究,且已表现出对动物健康有一定的积极作用。本试验以MAC-T细胞作为研究对象,结合黄曲霉毒素B1(AFB1)和白藜芦醇对乳腺上皮细胞的作用效果进行一系列研究。旨在了解白藜芦醇是否能够抵御AFB1在乳腺上皮细胞上的毒害作用,以及最佳作用条件。分别用不同浓度的AFB1和不同浓度的白藜芦醇处理MAC-T细胞。通过对每个处理下的细胞活力、形态以及抗性因子的表达等方面来评估其作用效果,挑选出恰当的处理浓度进行下一步研究。本试验使用AFB1处理MAC-T细胞24 h,结果显示大于等于4 mg/L的处理使细胞活力显著下降。同样在大于等于4 mg/L AFB1处理时,MAC-T细胞表现出总抗氧化能力和线粒体膜电位的显著下降。但AFB1对细胞形态没有明显作用。通过qPCR检测炎性因子及Nrf2信号通路基因转录水平,可见TNF-α、IL-1β和IL-6均没有明显的浓度相关性变化,Nrf2和Keap1基因的转录没有显著增加,相反其下游抗应激基因NQO1的转录量随AFB1浓度增加而增加;IL-8在大于等于6 mg/L AFB1处理下发生显著上调表达。在10 mg/L时HSP70发生显著下调表达。本试验使用白藜芦醇对MAC-T细胞进行相同的检测,发现随着白藜芦醇的浓度增加其细胞毒性也随之增大,在浓度达到30 mg/L时显著下降。而白藜芦醇使细胞总抗氧化能力增加,在40 mg/L时达到显著且线粒体膜电位发生显著超极化。值得注意的是,白藜芦醇在试验中表现出抑制细胞增殖的现象。同时不同浓度的白藜芦醇处理MAC-T时,以10 mg/L为界,细胞骨架产生两种截然相反的变化,即,低浓度下促进细胞边缘片状伪足的形成,高浓度下抑制细胞边缘片状伪足形成。与上一试验中AFB1处理结果类似,白藜芦醇对炎性因子的转录调节并不一致。TNF-α显著下调表达;IL-1β随处理浓度增加而显著增加;IL-8在处理浓度超过40 mg/L时发生上调表达。但是IL-6则在低处理浓度下表达上调高处理浓度下下调表达。对于Nrf2信号通路中的基因转录,在大于20 mg/L的白藜芦醇作用下均发生显著增加。综合前两个试验的结果对AFB1和白藜芦醇交互作用剂量进行选择,进一步确定了4 mg/L AFB1与10 mg/L的白藜芦醇得作用剂量组合。试验结果证实了白藜芦醇可以缓解AFB1在MAC-T细胞上的细胞毒性,包括减少MAC-T细胞在AFB1作用下增加的ROS,调节线粒体膜电位和抑制细胞凋亡。并且通过qPCR测定Nrf2信号传导途径中mRNA转录物的表达,白藜芦醇也显示出良好的调节作用。因此,证明白藜芦醇对MAC-T细胞中的AFB1的毒性具有干预作用。结论:本研究表明白藜芦醇可以改善AFB1对MAC-T细胞的损伤;但是需要控制白藜芦醇的使用剂量,高剂量的白藜芦醇依旧存在毒性。因此,使用时必须控制白藜芦醇剂量。

关键词： 牛磺酸   脾脏   抗氧化   NF-kB炎症通路   AFB1中毒大鼠  

摘要： 黄曲霉毒素B1(AFB1)是毒性最强的一种霉菌毒素,能广泛污染粮食与饲料,严重影响了畜禽业的发展。畜禽摄入AFB1后出现中毒现象,表现为免疫力降低,肝、脾和肾等器官损伤,其中脾脏损伤会引发机体发生炎症反应,降低免疫力。牛磺酸是人和大多数哺乳动物体内的一种条件性必需氨基酸。大量研究证明,牛磺酸具有抗氧化、抗炎、增强免疫力和保护机体等作用。但牛磺酸对AFB1中毒引起的脾脏功能损伤的作用尚不明确。本试验通过灌胃法制备AFB1中毒大鼠模型,同时饮水中添加不同剂量牛磺酸,检测血清和脾脏中抗氧化、免疫和炎性相关指标及炎症通路相关因子mRNA的表达,探讨牛磺酸对AFB1中毒大鼠脾脏功能的影响,以期为牛磺酸在畜牧业生产中预防AFB1中毒的应用提供理论依据。选取健康SD大鼠77只,随机分为7组,自由进食的基础上每组给予不同处理:C组(灌胃生理盐水,饮用自来水)、T组(灌胃生理盐水,饮用2%牛磺酸水)、DMSO组(灌胃DMSO,饮用自来水)、M组(灌胃AFB1,饮用自来水)、M+T1组(灌胃AFB1,饮用1%牛磺酸水)、M+T2组(灌胃AFB1,饮用2%牛磺酸水)、M+T3组(灌胃AFB1,饮用4%牛磺酸水)。试验期间观测大鼠精神状态及体重变化;试验结束后制作石蜡切片HE染色观察脾脏组织形态学变化;利用比色法和ELISA法测定血清和组织中脾脏免疫功能以及脾脏组织中氧化指标;利用荧光定量PCR法检测脾脏炎症通路相关基因mRNA表达水平。试验结果显示:1.牛磺酸可抑制AFB1中毒大鼠体重下降、改善脾脏组织的出血、淤血、核溶解等病理变化。2.牛磺酸可抑制AFB1中毒大鼠脾脏组织中过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、GSH-PX、T-AOC含量/活力的降低,阻止MDA含量的升高。3.牛磺酸可抑制AFB1中毒大鼠血液及脾脏组织中免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白M(IgM)和免疫球蛋白G(IgG)含量下降,阻止大鼠血液中白介素1β(IL-1β)、白介素6(IL-6)、肿瘤因子α(TNF-α)含量升高。4.牛磺酸可抑制AFB1中毒大鼠脾脏NF-kB炎症通路相关因子TLR4、CD14、MyD88、NF-κB、MaPk14、Nfkbia(IkBa)和Rela(p65)的mRNA表达量显著升高。试验结果表明:牛磺酸可明显改善AFB1中毒大鼠脾脏功能,其机制与提高脾脏抗氧化能力以及抑制NF-kB信号通路介导的炎症发生有关。

关键词： 动脉粥样硬化   血管损伤   高脂血症   抗氧化   肝损伤  

摘要： 动脉粥样硬化(AS)是冠心病、脑梗死、外周血管病的主要原因。脂质代谢障碍为动脉粥样硬化的病变基础,近年来,该病发生逐渐增多,严重者会危及生命,临床治疗以降血脂为主,西药虽能减缓病程,但肝损伤、肌溶症等不良反应时有发生。因此,开发有效的中药是解决AS主要途径。试验通过饲喂高脂饲料,建立动物高血脂动脉粥样硬化模型。以黄芪、三七、川芎、地龙为主要组分中药的复方中药制剂为研究对象,采用低(0.2 g/mL)、中(0.4g/mL)、高(0.8 g/mL)三个剂量组,分别经口给药饲喂AS模型家兔,并与模型对照组、空白对照组、阳性对照组(立普妥)比较,给药6周后,进行TC、TG、LDL-c、HDL-c、ApoA1、ApoB、T-aoc、MDA、SOD、CAT、GSH-px、NO、ET-1、AST、ALT等指标检测,通过与模型组比较,考察复方中药制剂抗AS效果,结果如下:1、复方中药制剂对血管内皮损伤具有很好的保护效果。各试验组血管内膜切片表面光滑,细胞排列比较整齐,同时各剂量组NO水平均升高,其中中剂量组(P<0.01),低、高剂量组(P<0.05);各剂量组ET-1水平均降低(P<0.01),其效果与阳性组药物无显著差异。2、复方中药制剂能够维持血脂稳态。各剂量组TC、TG、LDL-c水平及AI、CRI指数均降低(P<0.01),而ApoA1水平,中、高剂量组均升高(P<0.01),相反各剂量组ApoB水平降低(P<0.01)。3、复方中药制剂具有很好的抗氧化作用。T-aoc水平,中、高剂量组升高(P<0.05),各剂量组SOD、GSH-px水平均升高(P<0.01),而CAT水平,仅中剂量组升高(P<0.01),MDA水平,各试验组均降低(P<0.01)。4、复方中药制剂具有良好保肝作用。各剂量组ALT、AST水平均无显著差异(P>0.05);5、复方中药制剂具有较好的抗凝和溶栓作用。各剂量组,PT、PF4与TXB2水平均降低(P<0.01),而t-PA和AT-Ⅲ水平均升高(P<0.01);另外,高剂量组,体外凝血质量和溶栓时间降低(P<0.01),而凝血时间延长(P<0.01),同时溶栓质量也升高(P<0.01)。

关键词： 戴明循环   中药制剂   质量管理   应用   成效  

摘要： 目的:观察戴明循环在中药制剂质量管理方面的应用及成效。方法:我院2018年1月中药制剂质量管理中实施戴明循环管理,比较我院2017年1月至2017年12月100份中药制剂样本(即为对照组)与2018年1月至2018年12月100份中药制剂样本(即为观察组)出现的问题。结果:观察组100份中药制剂样本不合格率明显低于对照组,数据差异明显(P<0.05)。结论:药制剂质量管理中戴明循环管理效果明显优于常规护理管理。

关键词： 天然低共熔溶剂   溶解性   LC-MS/MS   小檗碱   肠道吸收  

摘要： 目的:中药提取物纯化后常发生活性丢失现象,可能与纯化后各成分在药学、药动学或药效学层面协同作用丢失有关。药物的溶解性显著影响其肠道吸收。值得关注的是,某些中药成分的溶解性在提取物中显著高于其单体形式,即可能与提取物中成分间协同作用有关。中药提取物中存在有机酸、糖、氨基酸、尿素和胆碱等小分子初级代谢产物。人为地将某些小分子初级代谢产物按一定比例混合后可制备获得具有显著增溶作用的天然低共熔溶剂(NADES)。但在中药提取物中这些初级代谢产物的实际组成、含量、比例关系以及据此比例关系能否形成具增溶作用的NADES并不清楚。为此,本论文拟首先建立多种小分子初级代谢产物的定量分析方法,确定各产物在多种中药提取物中的实际含量及比例关系,然后确定按该组成及比例关系能否获得NADES,继而研究其对某些中药成分溶解性及肠道吸收的影响,以阐释这些中药小分子初级代谢产物的药学及药动学协同作用。方法:(1)建立测定有机酸(苹果酸、绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、阿魏酸)、糖类(木糖醇、葡萄糖、果糖、蔗糖)、氨基酸(脯氨酸、丙氨酸、甘氨酸)、尿素以及胆碱等植物初级代谢产物的LC-MS/MS分析方法,并基于定量下限、线性范围、精密度及准确度、加样回收率、稳定性、重复性等指标进行方法学验证;(2)基于内标法,采用已建立的LC-MS/MS分析方法测定多种常见中药(黄连、葛根、黄芩、人参、银杏叶、甘草、丹参)提取物中上述初级代谢产物含量;(3)以黄连提取物为例,依据主要小分子初级代谢产物的组成及比例关系,采用加热法确定是否形成NADES;确定所制备NADES对代表性活性成分小檗碱溶解性的影响;基于离体肠囊实验,确定该NADES对小檗碱体外肠吸收的影响;基于小鼠整体药动学实验,确定该NADES对小檗碱体内肠吸收及暴露水平的影响。结果:(1)建立了三种快速、灵敏、准确的LC-MS/MS定量分析方法,可分别用于定量测定中药提取物中有机酸、糖类及氨基酸、胆碱和尿素等初级代谢产物含量;(2)应用已建立的LC-MS/MS方法,发现被测中药提取物中以蔗糖、苹果酸、胆碱等为主要初级代谢产物;(3)依据黄连提取物中初级代谢产物组成及比例关系,成功制备出一种NADES,可将小檗碱溶解度提高至20 mg/m L;将该NADES按等比系列稀释后(50%、25%、12.5%、6.25%、3.125%),对小檗碱溶解能力随稀释比例增加显著下降,但仍显著高于纯水;该NADES对小檗碱体外肠吸收具有显著的浓度依赖性促进作用;整体药动学实验结果显示,该NADES能显著改善小檗碱在小鼠门静脉及肝脏暴露水平。结论:(1)建立了三种快速、灵敏、准确的中药提取物中初级代谢产物的LC-MS/MS定量分析方法;(2)基于该LC-MS/MS方法,发现被测各中药提取物以蔗糖、苹果酸、胆碱等为主要初级代谢产物;(3)根据黄连提取物中测得初级代谢产物组成、含量及比例关系成功制备了一种NADES;该NADES对小檗碱溶解性、肠道吸收及体内暴露水平具有显著的改善作用。

关键词： DNA纳米技术   电化学发光传感器   功能化纳米材料   黄曲霉毒素B1   狂犬病毒寡核苷酸  

摘要： 近年来,电化学发光生物传感技术在食品以及生物检测领域越来越受到人们的关注。与传统方法（酶联免疫吸附测定法、荧光分析法、比色法）相比,电化学发光生物传感技术具有灵敏度高、操作门槛低、时空可控性强、线性范围广等特点。但是电化学发光技术也存在信号标签电化学发光效率较低、容易受到周围环境（生物组织、pH、温度）影响的问题,所以亟需建立一种高准确性、高灵敏度的检测方法。针对传统的电化学发光传感器所存在的不足,将DNA纳米技术引入到电化学发光传感器中,极大的提高了检测性能,尤其是灵敏度以及抗干扰能力。本文将DNA纳米技术以及功能化的纳米材料与电化学发光传感技术相结合,从降低检测限与提高抗干扰能力的角度入手,构建了两种不同的电化学发光传感器,并将其应用于食品毒素以及动物疾病标记物的检测。主要的研究内容及成果如下:1.基于DNA等温扩增技术的电化学发光传感器用于狂犬病病毒寡核苷酸检测狂犬病病毒主要传播途径是由带毒动物咬伤人后而发生感染,而狂犬病病毒寡核苷酸主要存在于动物的生物组织（如唾液腺）,但是其在唾液中的含量较低,传统的电化学发光（ECL）传感器远不能达到需要的检测限。因此,提出基于DNA扩增技术的ECL传感器用于超灵敏检测狂犬病病毒寡核苷酸。首先合成了介孔二氧化硅纳米球,并将大量的Ru（bpy）32+封装在硅球中并使用一段栅极DNA（ssDNA）将硅球孔道封闭,随后采用DNA等温扩增技术,在目标物存在的条件下,可以扩增得到的大量的与ssDNA互补的产物DNA（Product DNA）序列,该序列可以打开硅球的孔道,释放出孔道中大量的Ru（bpy）32+ECL信号分子,从而达到信号放大的目的。该方法对狂犬病病毒寡核苷酸以及唾液样品的检测均表现出较好的分析性能。前者的检测范围是1.0×10-14 mol/L1.0×10-8 mol/L,检测限（LOD）是1.885×10-15mol/L（S/N=3）。2.基于适配体技术的比率型电化学发光传感器用于食物中黄曲霉毒素B1检测黄曲霉毒素B1（AFB1）是一种已知的毒性最大的化学致癌物。AFB1通常存在于玉米、小麦等食品中,对人体健康危害极大。而食物样品常常又较为复杂,传统的ECL传感在检测时很容易出现假阴性、假阳性等情况。开发简便、准确、灵敏的检测食品中AFB1的分析方法仍是一个挑战。本文在双信号策略的基础上,设计了一种用于AFB1准确、灵敏检测的比率型适配体传感器。首先使用电化学方法作为模型验证AFB1与其适配体（aptamer）的特异性相互作用,其中二茂铁（Fc）修饰的DNA序列和亚甲基蓝（MB）修饰的DNA序列作为双信号。AFB1与其aptamer之间的特异性相互作用通过Fc的“信号打开”模式和MB的“信号关闭”模式得到了验证。随后,电化学传感器进一步扩展到电化学发光适配体传感器（ECL aptasensor）的构建。在ECL系统中,由CdTe/CdS/ZnS量子点（QDs）和鲁米诺（luminol）产生ECL信号作为双信号。辣根过氧化物酶修饰的金纳米棒（HRP/Au NRs）作为猝灭剂/增强剂,通过ECL能量转移猝灭QDs的ECL信号,同时催化H2O2增强luminol的ECL信号。由于比率型传感具有自校正能力,即使在复杂的样品中,两种比率型aptasensor对AFB1均表现出准确、灵敏的分析性能,线性范围为5.0×10-12 mol/L1.0×10-9 mol/L,LOD分别为4.3×10-13 mol/L和1.2×10-10 mol/L（S/N=3）。