关键词： 严重脓毒症   心肌损伤   左西孟旦   中医药治疗   心脏保护  

摘要： 目的研究分析左西孟旦联合中药对严重脓毒症心肌损伤患者血清乳酸(Lac)、可溶性CD14亚型(Presepsin)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)指标水平的影响以及对心脏的保护作用。方法选择2011年6月-2015年6月本院急诊科及ICU病房收治的严重脓毒症合并心肌损伤患者100例作为研究对象,入组患者均符合严重脓毒症及心肌损伤的相关诊断标准,随机数表法将患者分为研究组51例及对照组49例,除基础治疗外给予对照组患者左西孟旦注射液治疗,研究组患者在此基础上联合应用中药制剂柴胡人参汤,观察比较两组患者治疗效果及对心脏功能的保护情况。结果研究组患者治疗疗效率优于对照组(Z=2.511,P=0.012);两组患者治疗后APACHEⅡ评分、中医证候积分(11.02±2.30vs 13.49±3.15)、(7.54±1.23vs 10.88±3.10)比较差异有统计学意义(P<0.05);两组患者治疗前Lac、Presepsin和NOS水平比较差异无统计学意义,治疗后指标均有所降低,且研究组患者改善效果优于对照组(P<0.05);两组患者治疗前心功能指标左心室射血分数(LVEF)、左心室收缩末期内径(LVESD)及左心室舒张末期内径(LVEDD)水平比较差异无统计学意义,经相应治疗后均有所改善,且研究组患者改善效果更佳(P<0.05)。结论左西孟旦联合中医药治疗严重脓毒症合并心肌损伤能有效抗感染、抑制炎症反应,减轻心肌的损伤作用,对心功能保护效果佳,值得临床推广使用。

关键词： 乳制品   黄曲霉毒素B1   黄曲霉毒素M1   酶联免疫法  

摘要： 建立一种快速检测乳制品中黄曲霉毒素B1(Aflatoxin B1, AFB1)、M1(Aflatoxin M1,AFM1)的检测方法。用60%甲醇-水提取样品,1∶4纯水稀释,用酶联免疫法测定样本中的AFB1和AFM1。加标浓度为0.2μg/kg,0.4μg/kg和0.8μg/kg浓度AFB1、AFM1标准品,用酶联免疫法测定,每个浓度做三次平行,分别计算AFB1、AFM1回收率。AFB1的回收率分别为:98.7%、97.3%及103.6%;AFM1的回收率为:100.5%、99.2%及101.5%;方法检出为0.03μg/kg。此方法对AFB1、AFM1的回收率结果均在90%～110%之间,符合国标方法中对酶联免疫试剂盒回收率的要求(50%～120%),方法快速、稳定,适用于乳制品中AFB1和AFM1的检测。

关键词： 黄曲霉毒素B1   微生物   吸附作用   酶解作用  

摘要： 黄曲霉毒素B_1是由寄生曲霉、黄曲霉等真菌产生的次级代谢物,具有极强的致畸、致癌等毒性,不仅对人和动物健康构成严重的威胁,而且也给食品和饲料工业带来巨大的经济损失。如何消除黄曲霉毒素B_1的污染依然是目前学者迫切要解决的重点问题。相比理化法消除黄曲霉毒素B_1的缺点和局限,生物法降解具有安全、高效和绿色环保等优点,使其成为更具有潜力的解毒方法。本文主要对生物吸附作用和生物酶解作用降解黄曲霉毒素B_1的机理及降解产物的结构分析进行了论述。

关键词： 超高效液相色谱-串联质谱   饲料   黄曲霉毒素B1   方法比较研究  

摘要： 利用免疫亲和柱的方法对饲料中黄曲霉毒素B_1进行检测。饲料样品经70%甲醇水提取后,用水稀释,过黄曲霉毒素B_1免疫亲和柱、甲醇洗脱、去离子水稀释洗脱溶液,在超高效液相色谱串联质谱仪上进行检测。结果表明:黄曲霉毒素B_1,在2~20μg/kg上呈良好的线性关系,R^2>0.999;饲料黄曲霉毒素B_1添加浓度在2~20μg/kg上,回收率范围为83.50%~92.40%,RSD值小于2.0%,并用所建方法同标准NY/T 2071—2011的方法进行样品处理对比分析,从而为饲料中黄曲霉毒素B_1检测方法提供更多的选择。

关键词： 中药制剂   质量控制   发展趋势  

摘要： 中药制剂在我国的医学领域中有着非常重要的应用意义,但是其质量控制水平不足,也就阻碍了中药制剂的进一步发展。就需要相关的医学人员能够在结合现有中药制剂质量控制现状以及以往研究的基础上,进行中药制剂质量控制新技术以及新方法的积极总结与归纳,来保障民众的用药安全性以及有效性。

关键词： 肉鸡   锦心口服液   大肠杆菌   中药提取物   治疗效果  

摘要： 本文根据中兽医理论，分析得出鸡大肠杆菌病为湿病的结论，即湿热壅积，其治疗原则宜采用清热解毒、 燥湿止痢、 凉血生津为主，根据这一治疗原则，经过反复研究与论证，确定选择穿心莲、 十大功劳、 地锦草、 黄芩和虎杖五味中药为原材料进行组方，并根据五味中药的不同功效，配置出三个不同比例的组方。通过体外抑菌试验和对大肠杆菌病的临床治疗性试验，筛选出治疗大肠杆菌病效果较好的组方Ⅱ，根据中兽药命名原则命名为锦心口服液。　　通过在实验室对小鼠造模攻毒试验和对大肠杆菌致小鼠死亡的保护作用试验研究得出 20m1/kg 的锦心口服液对大肠杆菌致小鼠死亡有明显保护作用的结论;通过对湿热泄泻模型的止泻作用研究得出10～20ml/kg 体重剂量的锦心口服液对湿热泄泻所致大鼠腹泻具有显著的治疗效果的结论;同时，通过临床试验证明每2m1锦心口服液兑水1L, 自由饮水，连用7d，能够降低大肠杆菌病感染的死亡率、心包炎率和肝周炎率，可有效治疗鸡大肠杆菌病,且临床效果优于恩诺沙星;通过田间验证实验证明锦心口服液用于鸡大肠杆菌的治疗是有效的，在无药残要求下发挥了较好的作用，使死亡率迅速得到控制的同时，减少了抗生素的使用。

关键词： 多氯联苯   CYP2E1   CYP1B1   黄曲霉毒素B1   遗传毒性  

摘要： 背景多氯联苯(polychlorinated biphenyls,PCBs)是一组持久性有机污染物和人类致癌物,可经细胞色素P450(CYPs)酶代谢活化,但大部分PCBs化合物的致突变性及其结构-毒性关系尚不清楚。由于致突变是致癌作用的一个重要机制,分析PCBs致突变性对PCBs危险性评估十分重要。依据氯取代基的位置特征,PCBs可分为两大类,一类因具有与二噁英相似的芳烃受体(aromatic hydrocarbon receptor,AhR)配体活性,又称为二噁英样多氯联苯(dioxin-like PCBs,DL-PCBs),另一类则称为非二噁英样多氯联苯(non-dioxin-like-PCBs,NDL-PCBs)。课题组前期发现多个NDL-PCBs由人CYP2E1酶活化,从而具有致突变作用;邻位仅有单个氯的化合物似乎致突变性最强,但尚无系统的结构-毒性关系研究。DL-PCBs对表达人CYP2E1的细胞未呈现致突变作用,但其可否由其他CYP酶活化为致突变物尚不清楚。PCBs可作用于不同核受体而调控CYPs表达水平,其中DL-PCBs通过激活AhR上调CYP1酶,而NDL-PCBs可激活雄烷受体(constitutive androstane receptor,CAR)和孕烷受体(pregnane X receptor,PXR),诱导CYP2B和CYP3A酶的表达。黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1,AFB1)是一种依赖CYP1A2和CYP3A4活化的人类致癌物,其与PCBs是否具有联合作用尚无直接证据。目的(1)分析含2～4个氯取代基而邻位氯数目不等的NDL-PCBs对表达人CYP2E1和硫酸基转移酶(SULT)1A1 的重组中国仓鼠V79细胞系(V79-hCYP2E1-hSULT1A1)诱发微核与Hprt突变的作用,探讨PCBs的结构-毒性关系。(2)采用表达人CYP1A1、CYP1A2和CYP1B1的重组V79细胞及内源性表达CYPs酶的人肝细胞瘤C3A细胞验证DL-PCBs经CYP1酶活化及致突变作用假说。(3)采用人肝细胞(L-02)系探讨NDL-PCBs对核受体、某些CYP酶表达及AFB1遗传毒作用的影响。方法采用 V79-Mz(对照细胞系)、V79-hCYP2E1-hSULT1A1、V79-hCYP1A1、V79-hCYP1A2、V79-hCYP1B1、L-02和C3A细胞系,以CCK-8法检测受试物的细胞毒作用,微核实验和Hprt致突变实验分析受试物遗传毒性,免疫荧光法分析微核的着丝粒蛋白B(centromere protein,CENP-B)(以区分断裂作用与致非整倍体作用),Western blot法分析蛋白表达水平。结果(1)8个三氯联苯与四氯联苯化合物以6 h/18 h(暴露/恢复)方案处理V79-Mz和V79-hCYP2E1-hSULT1A1细胞,结果显示各受试物对后者诱发微核作用强度远大于前者;多数受试物对V79-hCYP2E1-hSULT1A1细胞均呈现致突变作用,而对V79-Mz细胞无作用。结合前期报道的其他受试PCBs对上述细胞的致突变作用,发现邻位氯的数目为1时致突变性最强,随着邻位氯数目增加,致突变性降低;变化趋势随化合物氯化程度增高而更明显:二氯联苯受此影响不大,三氯联苯明显受影响,四氯联苯更明显(含3、4个邻位氯者已测不出致突变性)。2,4',6-三氯联苯(PCB 32)和2,3,3',4'-四氯联苯(PCB 56)作为代表性化合物对V79-hCYP2E1-hSULT1A1细胞诱导的微核中CENP-B阳性者达60%～70%。(2)采用邻位不含氯取代基的DL-PCBs,即3,3',4,4'-四氯联苯(PCB77)、3,4,4',5-四氯联苯(PCB 81)和3,3',4,4',5-五氯联苯(PCB 126),以不同时程处理V79-Mz、V79-hCYP1A1、V79-hCYP1A2和V79-hCYP1B1细胞,发现在6h/18 h和18 h/6 h方案下,PCB 77和PCB 81对V79-hCYP1B1细胞在μM 水平诱发微核,而对其他细胞系无作用;PCB 126则对上述细胞系均不能诱发微核形成。三个受试物暴露于C3A细胞54 h均诱导CYP1A1和CYP1A2蛋白,对CYP1B1无影响。在54 h/18 h方案下,PCB 77和PCB 81诱发C3A细胞微核并呈浓度相关性,而该效应可被CYP1B1选择性抑制剂tetramethoxystilbene(TMS,30nM)完全抑制。受试物对V79-hCYP1B1和C3A细胞诱发的微核绝大多数为CENP-B阴性。三个受试物暴露于C3A细胞12 h均引起γ-H2AX蛋白水平升高(提示DNA双链断裂),且此效应被TMS(10nM)完全

关键词： 计算机模拟   氨基酸功能单体   分子印迹   黄曲霉毒素B1   富集净化  

摘要： 目的:分子印迹聚合物(MIPs)是一种具有选择性识别性能的高分子材料,本研究拟对影响MIPs性能的关键因素功能单体进行优化,制备对黄曲霉毒素B1(AFB1)具有特殊选择性的MIPs,用于富集净化中药中痕量存在的AFB1,为黄曲霉毒素的分析检测提供一种可行的前处理方法。 方法:选择具有不同侧链的氨基酸为功能单体,包括N-丙烯酰基-L-色氨酸(ATrp)、N-丙烯酰基-L-苯丙氨酸(APhe)、N-丙烯酰基-L-精氨酸(AArg)、N-丙烯酰基-L-谷氨酸(AGlu),采用分子力学和半经验法计算各功能单体与目标分析物相互作用时的结合能,通过计算机模拟筛选出结合力强的功能单体。以AFB1的结构类似物5,7-二甲氧基香豆素(DMC)为替代模板、甲基丙烯酸乙二醇酯(EGDMA)为交联剂,偶氮二异丁腈(AIBN)为引发剂,采用本体聚合法制备不同功能单体的印迹聚合物MIPs及非印迹聚合物NIPs,通过静态吸附法考察各聚合物对AFB1的吸附能力。将筛选的聚合物作为吸附剂制备固相萃取小柱,评价聚合物对中药中痕量存在的AFB1的富集净化能力。 结果: 1.通过计算机模拟,各氨基酸的羧羟基作为氢键供体,与AFB1内酯环上的羰基氧原子形成氢键,各功能单体与AFB1的氢键结合能大小顺序为:ATrp>APhe>AGlu(H' 15)>AGlu(H' 16)>甲基丙烯酸(MAA)>AArg,其中疏水性氨基酸功能单体(ATrp,APhe)与AFB1的结合能大于其它单体。 2.采用本体聚合法分别以ATrp、APhe为功能单体制备印迹聚合物ATrp@MIPs、APhe@MIPs及非印迹聚合物ATrp@NIPs、APhe@NIPs,当吸附不同浓度的AFB1时,NIPs的吸附量均大于以DMC为模板的MIPs以及传统的甲基丙烯酸(MAA)为功能单体的聚合物,其中ATrp@NIPs的吸附量最大,对100ng/mL、5 μg/mL的AFB1的吸附量分别为3.31±0.24 μ g/g、86.69±3.45 μ g/g,推测由于替代模板DMC与目标分子AFB1之间的结构差异,导致MIPs的印迹孔穴对AFB1不能完全匹配,发生吸附时主要依靠聚合物表面基团与AFB1之间的氢键、π-π堆积等作用。 3.以ATrp@NIPs为吸附剂制备的固相萃取柱ATrp@NIP-SPE,以70%甲醇为上样溶剂,上样3mL,经2mL去离子水淋洗、3×0.5mL乙腈洗脱,AFB1的回收率为 78.83±1.13%。用 ATrp@NIP-SPE 处理 1 μ g/kg、5 μ g/kg、10μg/kg、20 μ g/kg加样水平下的中药莲子样品,AFB1的回收率分别为73.26±2.38%(RSD为3.24%)、75.05±0.74%(RSD 为 0.96%)、70.26±1.28%(RSD 为 1.79%)、61.09±1.31%(RSD 为 2.14%)。 结论:计算机模拟技术是一种筛选MIPs功能单体的有效方法。ATrp@NIPs性能稳定,制备简单,成本低,对AFB1具有良好的吸附性能,可用于富集净化中药中痕量存在的AFB1。

关键词： 环氧合酶 2(COX-2)   蛋白磷酸酶 2A(PP2A)   内质网质量控制(ERQC)   NLRP3炎症小体   枯否细胞(KC)   肝脏炎性损伤  

摘要： 外源暴露诱导的慢性肝脏炎症涉及肝组织坏死和局部炎性反应,可进一步导致肝脏纤维化和肝硬化,已成为重要的公共卫生学问题之一。得益于肝脏独特的血窦结构和丰富的免疫细胞亚群,外源因素通过诱导肝细胞与肝内免疫细胞的细胞间互话,促进肝脏局部免疫微环境的形成,介导肝脏炎性损伤。其中,具有肝脏驻留表型的枯否细胞(KC)占体内组织巨噬细胞的80%～90%,可快速响应肝内危险信号。NLRP3炎症小体是广泛存在于胞浆中诱导促炎性因子产生的蛋白复合物,可在多种内、外源性危险信号诱导下,发生具有免疫原性的细胞焦亡;既释放损伤相关模式(DAMPs)促进细胞间通讯,也分泌白介素(IL)-1β等炎性因子激活免疫级联反应,与肝脏炎性损伤密切相关。环氧合酶2(COX-2)可被外源因素或促炎细胞因子诱导表达,如黄曲霉毒素B1(AFB1)可诱导大鼠肝组织COX-2高表达;研究表明,干预COX-2可通过减少线粒体氧化损伤,抑制脂多糖诱导的小鼠巨噬细胞中NLRP3在线粒体上的组装与活化。然而,内质网(ER)驻留蛋白COX-2如何移位至线粒体并调控NLRP3炎症小体的活化,仍待进一步研究。目的:通过建立AFB1诱导肝细胞COX-2高表达和肝脏炎性损伤的模型,探明COX-2的表达、分布与降解参与调控AFB1诱导的NLRP3依赖性肝细胞焦亡的ER质量控制(ERQC)机制;探讨肝细胞焦亡所释放的DAMPs激活免疫级联效应的肝脏局部免疫调控机制;结果为筛查AFB1诱导肝脏炎性损伤的干预靶点提供线索和理论依据。方法:(1)GEO分析:采用GEO数据库(GSE25844),分析AFB1处理HepaRG细胞中PTGS2、caspase相关细胞死亡基因的mRNA水平及其相关性。(2)体内试验:采用AFB1(1 mg/kg)隔天灌胃C57BL/6小鼠4周建立暴露模型、采用COX-2的选择性抑制剂塞来昔布(CELE,30 mg/kg)建立干预模型。小鼠血清样本和肝组织样本等进行如下检测:①检测血清和肝组织匀浆中AST和ALT等肝功能指标;②流式细胞仪(FCM)分析肝脏非实质细胞中F4/80+KC的比例改变;③H&E染色观察肝组织病理学改变;④天狼星红染色观察肝组织胶原沉积;⑤实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测肝组织中Ⅰ相代谢酶(Cp1a2,Cyp3a11)、Ⅱ相代谢酶(Gsta,Gstm,Gstt)、炎性因子(Il1b,Il18,Il6,Tnfa)和Ptgs2的mRNA水平;⑥蛋白免疫印迹(WB)检测肝组织COX-2、NLRP3炎症小体(p65,NLRP3,ASC)和焦亡(p10,IL-1β,GSDMD)相关蛋白的水平;⑦免疫组化(IHC)观察肝组织中COX-2和caspase 1的表达与分布;⑧酶联免疫吸附实验(ELISA)检测血清和肝组织匀浆中IL-1β的分泌。(3)离体试验:采用两步肝灌流法和免疫磁珠法分离小鼠原代肝细胞和KC,体外培养48h后收集样本,或给予AFB1(1μM,24 h)、CY-09(1μM,24 h)处理。①WB检测细胞中COX-2、促炎信号传导相关蛋白(AP-1,c-JUN,STAT3)、NLRP3炎症小体和焦亡相关蛋白;②ELISA检测上清中IL-1β的分泌。(4)体外试验:采用诱导分化的永生化人肝祖细胞系HcpaRG细胞给予AFB1(1μM,24 h)建立暴露模型。①qRT-PCR检测Ⅰ相代谢酶的mRNA水平;②焦亡相关指标:透射电子显微镜(TEM)观察焦亡小体和细胞质膜破裂,激光共聚焦(confocal)显微镜免疫荧光(IF)技术检测GSDMD的表达,WB检测焦亡相关蛋白,FCM检测caspase 1和PI双阳性的焦亡细胞比例,乳酸脱氢酶(LDH)释放实验检测细胞膜完整性,ELISA检测上清中IL-1β的分泌;③NLRP3炎症小体相关指标:WB检测NLRP3炎症小体相关蛋白,IF检测NLRP3的表达及其与线粒体的共定位;④ER氧化还原相关指标:化学发光法检测胞内总ROS的水平,WB检测ER氧化还原(ERO1 α,PDI)和未折叠蛋白反应相关蛋白;⑤免疫共沉淀(Co-IP)检测COX-2与NLRP3或B55δ的蛋白相互作用;⑥采用NLRP3特异性抑制剂CY-09建立干预模型,检测NLRP3炎症小体和焦亡相关指标;⑦采用COX-2的小干扰RNA(siPTGS2)建立基因干预模型,检测COX-2的表达、NLRP3炎症小体和焦亡相关指标;⑧采用siERO1A或高表达质粒建立ERO1α的高低干预模型,检测ERO1α与COX-2的表达及分布、NLRP3炎症小体和焦亡相关指标;⑨采用siPPP2R2D建立B55δ的基因干预模型,检测B55δ与COX-2的相互作用及分布、NLRP3炎症小体和焦亡相关指标;⑩采用永生化人正常肝L02细胞,靶向COX-2的丝氨酸(S)582