关键词： 激光诱导荧光光谱   开心果   黄曲霉毒素   信号增强   动态检测  

摘要： 开心果是世界四大树坚果之一,在我国年产量仅次于板栗和核桃,位居第三。开心果果仁中富含多种营养成分,受收获前、中、后期不良天气、运输、加工和储藏环境的影响,极易发霉变质。霉菌的新陈代谢活动会产生包含真菌毒素在内多种次级代谢产物,对人畜健康造成潜在威胁。黄曲霉毒素是真菌毒素中毒性最强且化学性质非常稳定的一类,包括十多种衍生物,其中黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1,AFB1）的分布最广泛,且致癌性和致畸性最大。开心果黄曲霉毒素污染的检测多年来一直备受人们的关注,然而在实际产业分析中仍然存在许多问题与挑战亟待解决。因此,本文针对早期研究中存在的目标物荧光强度弱、特征信号获取难和检测限高等问题开展试验,探究了溶液中AFB1、霉菌次级代谢产物(曲酸（Kojic Acid,KA）和曲酸衍生物（Kojic Acid Derivative,KAD）)的荧光特性及其信号增敏方法;分析了开心果及低浓度毒素污染样品在激光照射下荧光光谱曲线的异同,以及优选了模式识别算法;提出了多路复用荧光光谱检测方法,并对比了单、双和三探头检测模式的预测效果;设计了动态LIFS平台,并评价了该系统检测多品种样品的适用性。本文的目的在于提供一种基于LIFS技术的黄曲霉毒素污染开心果的快速无损检测方法,为推进荧光光谱技术在农产品品质与安全检测分析中的应用提供理论基础。本文的主要研究内容与结果如下:（1）探究了溶液中AFB1、KA和KAD的吸收光谱与荧光光谱特性,并确定了最优激发波长。结果表明:KA在紫外-可见光区域没有出现明显的吸收峰,AFB1主要特征吸收峰的位置随溶剂极性的减小而出现蓝移,在水、甲醇和乙腈中的位置分别位于364、360和356 nm,KAD的吸收峰在378 nm处。高浓度KAD的存在会影响AFB1特征吸收峰的鉴别,使毒素主峰的位置出现红移。三维荧光光谱结果显示AFB1与KAD的荧光峰存在差异,其中AFB1在234、265和365 nm三个波长激发下的荧光峰的位置均处于430 nm,最优激发波长为365nm。KAD仅在375 nm激发下出现一个荧光峰,位于493 nm,受234和265 nm紫外光（Ultraviolet,UV）激发无荧光响应。另外,与KAD相比,AFB1的荧光信号强度更容易受到溶剂类型的影响,其在80%甲醇中的信号强度远高于KAD。综上,采用深UV光源激发高浓度甲醇中的AFB1,可以降低或者消除KAD荧光信号的干扰。（2）提出了一种基于分子包合技术的AFB1荧光信号增敏方法,并阐释了其作用机理。本文共选择三种环糊精（Cyclodextrin,CD）进行对比分析,结果表明:α-、β-和γ-CD均可以显著提高AFB1的荧光强度,但是对KAD信号强度的作用不明显。其中β-CD的增敏效果最佳,对AFB1的倍增值为7.96。溶液中的KAD会在一定程度上抑制β-CD对AFB1的荧光增强作用,但是其对AFB1的倍增值仍然高达4.68,是KAD的3.76倍。甲醇浓度对AFB1-β-CD荧光强度的影响不显著,但是高浓度的乙腈会降低其信号强度。α-、β-和γ-CD的疏水空腔可以与AFB1形成1:1的包合物,其中AFB1-β-CD的稳定性最高,该体系的包合常数log K值为2.49。分子模拟结果表明β-CD与AFB1的亲和力最高,结合基团是AFB1分子中的呋喃环。（3）构建了LIFS系统,研究污染AFB1开心果的荧光光谱,并确定了最优识别模型。将360 nm的激光作为激发光源,搭建静态LIFS系统,检测污染5、10、20和50 ppb水平AFB1的两个品种（“早熟”和“克尔曼”）的开心果样品。结果表明:两个品种未污染组（样品表面不添加乙腈溶剂和AFB1溶液）样品在400～800 nm区间的平均荧光信号强度均略高于污染组样品。基于不同波段建立线性判别分析（Linear Discriminant Analysis,LDA）模型,发现400～610 nm对正确识别污染样品的贡献率更大。与逻辑回归分类（Logistic Regression Classification,LRC）模型相比,结合标准正态变量变换（Standard Normal Variate,SNV）预处理方法建立的支持向量机（Support Vector Machine,SVM）模型的判别正确率更高,其中“早熟”和“克尔曼”单一品种模型的识别率分别≥92.3%和≥93.8%,混合品种模型的识别率≥98.4%,且三组模型均无假阴性误判。（4）提出了一种多路复用光纤LIFS检测方法,并确定了最优检测模式。为采集“克尔曼”开心果样品受激后不同出射方向的荧光信号,设计了一套多路复用光纤LIFS检测装置。结果显示:不同检测模式获得的荧光强度大小顺序为:三探头>双探头>单探头,且三探头检测模式下对照组（样

关键词： 中药制剂   临床应用   不良反应   原因   对策  

摘要： 在我国临床医学治疗过程当中,中药治疗是一种重要的治疗手段。但随着近几年中药出明显治疗的广泛应用,我国的中药制剂的类型、数量越来越多,呈现的多样性。中药制剂的临床应用,一方面能够有效治疗患者的病症,但另一方面也会增加中药制剂临床应用过程中出现不良反应的几率。基于此,本文将简要探讨中药制剂在临床应用中不良反应的原因,并提出几点对策。

关键词： 黄曲霉毒素B1   溶杆菌CW239   生物降解   4-羟基苯丙酮酸双加氧酶   基因敲除   代谢组学  

摘要： 黄曲霉毒素（AFT）是一类主要由曲霉属真菌产生的具有致癌、致畸、致突变作用的低分子量代谢产物,其中黄曲霉毒素B1（AFB1）是公认的毒性最强的真菌毒素,广泛存在于坚果、粮食作物中,对人畜健康构成威胁的同时,也给世界范围内的农业经济带来了巨大的损失。因此,寻找有效的AFB1脱毒方法至关重要。生物脱毒法因其降解效率高、特异性强等优点而备受关注。目前关于微生物对AFB1的脱毒作用的研究较为广泛,但关于脱毒菌株产生的生物酶的研究较少,且AFB1结构复杂降解途径多样,给AFB1降解机制的探究带来了难度。因此筛选能够降解AFB1的关键酶基因,探讨其生物脱毒机理对生物脱毒技术在农业生产和食品工业中的应用具有重要意义。溶杆菌CW239是本实验室分离保藏的一株可高效降解低浓度AFB1的γ-变形菌纲细菌。将该菌株接种至终浓度为20μg/L AFB1的营养肉汤培养基中培养72 h后,其对AFB1的降解率达到75%左右。制备菌株CW239培养后的无细胞上清液、菌体细胞和胞内粗酶液,分别与20μg/L AFB1同等条件下反应,发现该菌株降解AFB1的活性物质主要分布在无细胞上清中。在此基础上,继续研究了无细胞上清降解AFB1的最适温度、最适p H,金属螯合剂、金属离子,SDS、蛋白酶K对降解效率的影响。发现无细胞上清降解AFB1的最适p H为中性,且温度越高降解效率越高。降解反应液中添加0.01 mol/L的Cu2+、Zn2+、Ca2+或Fe2+对降解反应具有明显的抑制作用。经EDTA、EGTA、蛋白酶K在30℃下孵育6 h后的无细胞上清液,对AFB1的降解效果显著下降,SDS处理也能显著降低无细胞上清对AFB1的降解作用,但无论是金属螯合剂,还是蛋白变性剂处理,无细胞上清液中的降解活性物质均不能完全被抑制,说明CW239胞外降解AFB1的活性物质较为复杂,且可能同时含有大分子金属蛋白酶类和非蛋白类物质。另外,结合凝结溶杆菌模式菌株的基因组信息和已报道的黄曲霉毒素降解酶类及降解途径,预测可能的AFB1降解酶,并成功筛选到介导AFB1降解的基因hppd239,基因表达的产物为4-羟基苯丙酮酸双加氧酶r HPPD239。将hppd239分子克隆后与载体p GEX-4T-1连接转入表达宿主*** BL21中,经IPTG诱导表达后,发现hppd239转化子上清液较空载颜色明显加深（呈红褐色）,转化子表达后的无细胞上清液与AFB1反应24 h后,无细胞上清液（不含r HPPD239蛋白）对AFB1的降解效率达70%以上,而*** BL21表达产生的重组蛋白r HPPD239对AFB1几乎没有降解活性,且无细胞上清中降解活性物质也具有热稳定性。为验证hppd239是否为调控CW239降解AFB1的关键酶基因,将该基因从CW239的基因组上敲除,但缺失基因hppd239的突变株CW239Δhppd对AFB1的降解活性并未消失,突变株CW239Δhppd只在48 h时较野生型菌株CW239降解效率有较显著降低（P<0.01）,随着菌株培养时间延长,突变株和野生型菌株降解效率再次恢复了一致。研究结果表明,除了hppd239基因以外,菌株CW239中仍存在其他介导AFB1降解的基因或降解因子。在此基础上,继续探究了HPPD抑制剂磺草酮,对菌株CW239和hppd239转化子*** BL21（p GEX-4T-1/hppd239）降解AFB1的影响,发现抑制剂对转化子降解反应具有明显抑制作用,而对CW239降解AFB1没有显著的抑制效果。由此进一步证实,菌株CW239中有多种途径可以介导菌株CW239无细胞上清液降解AFB1,hppd239介导降解方式只是其中的一种。为探索hppd239介导的降解活性物质,以及基因hppd239转化进入大肠杆菌宿主后引起的代谢变化,通过高效液相色谱串联质谱检测分析,从转化子菌株诱导表达上清液中筛选了13种候选活性降解物质。并结合代谢组学分析发现,基因hppd239的转入,引起了大肠杆菌次级代谢产物和氨基酸的生物合成,嘌呤和氨基酸等的代谢,三羧酸循环和环境污染物代谢等多个过程的变化,其中香豆素类抗生素新生霉素生物合成和三羧酸循环途径的影响最大,其次是嘌呤、酪氨酸代谢过程。验证候选活性物质对AFB1的降解作用,以及这些代谢过程变化与AFB1降解之间的关系,将是后续工作的重要内容。

关键词： 中药材   黄曲霉毒素B1   单克隆抗体   ELISA   GICA  

摘要： 中药材以植物性来源为主,在未能及时干燥、储存不当或因其他外界条件影响时,易发生霉变从而污染黄曲霉毒素B1（aflatoxin B1,AFB1）。其致癌性极强,可引发肝、肾毒性,抑制免疫系统等,对人体健康带来极大损害。因此,为了有效控制中药材AFB1污染,保障中药品质和用药安全性,研究高效灵敏的快速检测方法十分重要。目前传统的用于中药材AFB1的检测方法主要为仪器分析法,包括高效液相以及液质联用等,但其样品前处理繁琐、耗时且操作要求高等,导致在大批量中药材AFB1筛查应用中具有局限性。而基于抗原抗体特异性识别的免疫学检测技术（ELISA、GICA等）具有操作简单、高通量以及可进行现场检测等特点,可作为实验室仪器分析检测技术的有效补充,但是受中药材复杂基质的影响,其在中药检测中需要更高的检测灵敏度和稳定性。基于此,本论文开展了以下研究:获取高灵敏的抗体是免疫学检测技术建立的最重要前提。首先,本研究通过改进的肟化法改造AFB1后,将其与BSA和OVA进行偶联,成功获得AFB1完全抗原,反应无需加热,且未使用苯等有机溶剂,有利于环境保护。此外,采用加大免疫剂量、皮下多点和腹腔注射相结合的方式对Balb/c雌鼠进行免疫,方法中增加了免疫部位,使免疫更加充分,经细胞融合及多次克隆筛选后获得三株稳定的AFB1单克隆细胞株1E5、1E6以及1F7,选择抑制AFB1效果最好的1F7细胞株通过诱生腹水法并纯化以获得大量的AFB1单克隆抗体。该抗体免疫特性鉴定结果显示其属于IgG2b型抗体,灵敏度(IC50)可达0.15μg/L,亲和力常数为2.81×10～8 L/mol,与AFB2、AFG1、AFG2、AFM1交叉反应率分别为35.07%、8.75%、1.15%、36.75%,且与其他类真菌毒素几乎不存在交叉反应,表明本研究制备的抗体在保证高特异性和高亲和力的同时,具有较高的灵敏度,可用于AFB1快速检测方法开发及生产应用。以高通量快速检测为目的,基于制备得到的AFB1单克隆抗体,以易污染中药材酸枣仁为研究对象,通过系统优化同时结合基质匹配标准曲线以消除基质效应干扰,建立了高灵敏的中药材AFB1的间接竞争酶联免疫分析（Indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）快速检测方法,检测限可达1.69μg/kg,AFB1在0.05～0.58μg/L范围内线性良好（R2=0.992）,加标回收率为88%119%。采用所建立的方法对33批酸枣仁中AFB1进行了测定,并采用HPLC-MS/MS对检测结果进行了对比和确证,结果显示,ELISA检测结果无假阳性和假阴性,将两种方法所测得的含量数据进行线性拟合,相关系数R为0.996,表明本研究中建立的ic-ELISA方法准确、可靠,可用于实际酸枣仁样品初筛,同时可为其他中药材AFB1的快速筛查提供参考。此外,以现场快速检测为目的,研究中利用制备的AFB1单克隆抗体,开发了两种不同检测形式的胶体纳米金探针的免疫层析试纸条,即以金标抗体是否固定化分为湿法试纸条法（W-GICA）和干法试纸条法（D-GICA）。研究中重点考察了免疫层析试纸条构建过程中的关键参数,包括抗体与胶体金偶联的pH、抗体偶联量以及抗原浓度等条件。经优化后,W-GICA检测AFB1标准溶液的可视检测限为0.25 ng/mL,灵敏度为0.5 ng/mL,而D-GICA的可视检测限只能达到1 ng/mL。因此最终选择更加灵敏简便的W-GICA法,用于中药材中黄曲霉毒素B1的检测。本研究中选取易污染,同时富含色素的酸枣仁为模式研究样品,检验方法的适用性。结果表明,样品仅需经简单提取后进行一步稀释,其可视检测限即可达到5μg/kg,满足现行《中国药典》及欧盟对中药材中AFB1污染限量标准水平的检测需求。33批酸枣仁样品中试纸条测定结果有12批超标,通过HPLC-MS/MS验证结果一致,该方法中有效地避免了很多快检方法中所采用的样品浓缩步骤,同时还可通过对样品提取液稀释以降低基质干扰,可实现中药材在产地初加工、仓储过程中等现场的快速筛选。

关键词： 真菌毒素污染   黄曲霉毒素B1   农产品质量   电化学传感   比率策略  

摘要： “农业信息传感技术”是现代农业发展的重大技术支撑，也是国家重点发展的前沿科学技术。土壤、作物生长微环境以及农产品质量是其中三个紧密相连的重要命题。农产品质量关乎国计民生，其中精准、快速信息获取是关键。世界卫生组织将真菌毒素列为食源性疾病主要根源，因此各国对农产品中真菌毒素含量均有严格限量标准，而发达国家已将其作为农产品准入技术壁垒。其中，黄曲霉毒素B1（AFB1）、赭曲霉毒素A（OTA）广泛共存于霉变农产品，对农业“种-管-收”均有影响，易造成严重经济损失，同时对人及动物具有致癌、致畸、致突变等严重危害。基于此，实现对上述真菌毒素在农业生产过程的精准监测具有重要意义。色谱-质谱联用、免疫分析等方法检测准确、可靠，但依赖于昂贵仪器和专业操作。电化学传感具有便携、成本低、灵敏度高以及分析速度快等优点，在农产品真菌毒素检测中受到越来越多的关注，然而检测精准度的提升是瓶颈。本论文围绕发展农产品真菌毒素的灵敏、可靠、高效的电化学检测方法，从提高电化学传感器的检测选择性和精准度入手，引入比率策略，构建了多种高性能比率电化学适配体传感器，实现了农产品中AFB1和OTA的灵敏、精准、同时检测。主要研究内容如下：　　（1）为了考察基底材料对电化学传感器分析性能的影响，分别以金纳米粒子负载碳纳米角复合材料（AuNPs/CNHs）、金电极为传感基底，引入适配体为识别元件，构建了2种单信号电化学AFB1适配体传感器。其中，AuNPs/CNHs基传感器对AFB1的线性响应范围为0.3pg/mL～10.0ng/mL，检出限低至0.1pg/mL;金电极基传感器对AFB1的线性响应范围为1.0pg/mL～1.0μg/mL，检出限为0.3pg/mL;2种传感器均有较高的检测灵敏度和选择性。然而，金电极基传感器（RSD=2.0%）比AuNPs/CNHs基传感器（RSD=3.6%）具有更高的检测重现性，且在简化构建步骤方面优势明显。　　（2）在工作1的基础上，为了提高传感的准确度和可靠性，引入比率策略，利用双链DNA和单链DNA在金电极表面对亚甲蓝（MB）吸附能力的差异以及Fc标记互补DNA的构象变化，构建了一种基于双信号放大策略的比率电化学OTA适配体传感器。通过在Fc标记互补DNA和适配体形成双链DNA基础上引入辅助DNA，并在识别目标物OTA后再结合MB，实现了MB电化学信号的双重放大。在最优实验条件下，该传感器对OTA的线性响应范围为10pg/mL～10ng/mL，检出限为3.0pg/mL。该传感器可实现小麦样品中OTA的检测，检测结果与高效液相色谱-质谱法（HPLC-MS）所得结果并无显著性差异，表明了该比率传感器良好的准确度和可靠性。　　（3）为了进一步实现多种真菌毒素的同时检测，通过引入蒽醌修饰的互补发夹DNA按顺序组装Fc修饰的AFB1适配体和MB修饰的OTA适配体，构建了可同时检测AFB1和OTA的比率电化学适配体传感器。相比基于线性单链DNA构建的传感器，发夹DNA可显著提高传感器的灵敏度、重现性和抗干扰性能。在最优实验条件下，该传感器对AFB1的线性响应范围为10pg/mL～3ng/mL，检出限为4.0pg/mL;对OTA的线性响应范围为30pg/mL～10ng/mL，检出限为13.0pg/mL。检测过程中，两种真菌毒素之间无明显的交叉影响。该传感器已成功应用于玉米和小麦样品中AFB1和OTA的同时测定，HPLC-MS的结果验证了该传感器的准确度和可靠性。　　（4）基于上述研究工作，为了便于实现农产品真菌毒素的快速、现场检测，利用双链DNA和单链DNA在均相溶液中对MB吸附能力的差异，构建了一种基于杂交链式反应信号放大策略的均相比率电化学传感器。在最优条件下，该传感器可实现对AFB1的快速、精准分析，其线性响应范围为100pg/mL～100ng/mL，检出限为39.0pg/mL，并成功应用于玉米和小麦样品中AFB1的检测，HPLC-MS的结果验证了该传感器的准确度和可靠性。在此基础上，搭建基于丝网印刷电极及掌上恒电位仪的便携式传感平台，可实现上述真菌毒素的快速、现场检测。

关键词： 食品   黄曲霉毒素B1   暴露限值法   低剂量外推法   风险评估  

摘要： 目的对南宁市部分食品中黄曲霉毒素B1暴露的健康风险进行评估。方法运用秩和检验方法分析2014-2017年南宁市590份大米、玉米碾磨制品、黄豆、花生油样品中黄曲霉毒素B1的污染状况,以食物频率法收集南宁市居民4类食物消费量数据,采用暴露限值法（MOE）和低剂量外推法对食品中黄曲霉毒素B1的膳食暴露情况进行分析,并对造成的健康风险进行评估。结果调查结果显示,花生油、玉米碾磨制品、大米、黄豆中黄曲霉毒素B1的超标率分别为16.77%（52/310）、1.72%（1/58）、0.00%（0/179）、0.00%（0/43）;大米、玉米碾磨制品、黄豆、花生油的黄曲霉毒素B1平均膳食暴露量（ng/kg BW）分别为0.64、1.04、0.07、9.32,引起的肝癌发病风险（例/每年·10;）依次是0.023、0.037、0.003、0.331;MOE值由低到高依次是花生油、玉米碾磨制品、大米、黄豆;花生油是4种食品中人群黄曲霉毒素B1膳食暴露贡献率最高的食品,贡献率为84.19%。结论南宁市市售4种食品引发的肝癌发病风险不大,但是4类食物同时摄入导致的黄曲霉毒素B1总暴露引发的发病风险是不可以接受的。

关键词： 骨质疏松   肠菌群   中药提取物   淫羊藿苷   动物实验  

摘要： 目的　　探讨淫羊藿苷通过改变肠菌群对去卵巢小鼠骨结构及骨代谢活动的影响，揭示淫羊藿苷减轻小鼠骨质疏松症状的新机制。　　方法　　本课题通过建立C57BL/J小鼠去卵巢骨质疏松模型，设假手术组、去卵巢组、淫羊藿苷治疗组与肠菌群移植治疗组进行平行对照以探索其对小鼠骨结构及骨代谢生理活动的影响。实验分以下几个步骤：　　1.取24只小鼠，分为去卵巢生理盐水对照组(OVX)与假手术组(SHAM)，每组12只。模型小鼠接受手术后每日使用生理盐水0.3ml灌胃。各组小鼠分别于手术4w及8w后全身麻醉下处死6只，取出双侧胫骨。制作胫骨近端HE切片;及使用Micro-CT检查造模效果。　　2.取24只小鼠行去卵巢手术。随机分为2组，即淫羊藿苷药物治疗组(MED)、肠菌群移植组(FMT)。淫羊藿苷药物治疗组(MED)术后按每日80mg/kg标准灌服淫羊藿苷溶液，每隔3日停止灌药24h，提取粪便制作肠菌移植液，利用该组小鼠粪便制作粪肠菌群移植液，对肠菌群移植组(FMT)小鼠进行粪肠菌群移植。各组小鼠分别于手术4w及8w后全身麻醉下处死6只，取双侧股骨、胫骨、粪便及血液标本以备检验。通过高通量16SDNA筛查技术对MED组及OVX组小鼠粪便菌群结构进行分析。　　3.制作HE切片，使用Micro-CT检查骨小梁微观变化。使用ELISA分析骨代谢标志物的水平(血钙、GLP、PTH、PINP、BGP、CTX、25-OH-D3)以探究淫羊藿苷通过影响肠道菌群对去卵巢小鼠骨代谢活动的作用。使用免疫组化染色技术，探究淫羊藿苷通过改变肠菌群结构对胫骨近端Osterix及Runx2表达的影响。　　结果　　1.组织学与Micro-CT检测，去卵巢C57BL/J小鼠骨密度、骨小梁厚度、骨体积分数低于假手术组(P<0.05)，骨小梁间隙高于假手术组(P<0.05)。去卵巢组小鼠破骨活动及骨生成活动血生化指标均高于假手术组。　　2.肠菌群移植治疗组(FMT组)的小鼠近端骨密度值均高于去卵巢生理盐水对照组(OVX组)(P<0.05)，血清中成骨活动指标与破骨活动指标都较低(P<0.05)。对各组小鼠粪肠菌群分析显示与卵巢模型组相比，接受粪肠菌群移植的小鼠粪便中与炎症相关的毛螺杆菌丰度较低，有助于短链脂肪酸合成与钙质吸收的拟杆菌及普罗沃氏菌丰度较高。免疫组化染色结果显示：淫羊藿苷组和肠菌群治疗组去卵巢C57BL/J小鼠的Runx2和Osterix蛋白与去卵巢生理盐水对照组相比表达水平更高(P<0.05)。　　3.接受淫羊藿苷溶液治疗的去卵巢C57BL/J小鼠胫骨近端骨密度值更高，但低于假手术组(P<0.05);淫羊藿苷处理组小鼠与去卵巢生理盐水对照组相比，检测血清中成骨活动指标与破骨活动指标都较低(P<0.05)。　　结论　　1.淫羊藿苷可以改变去卵巢小鼠的肠菌群结构。　　2.淫羊藿苷可以通过改变去卵巢小鼠的肠菌群结构有效抑制高转换型骨质疏松症的骨吸收活动。　　3.淫羊藿苷可通过调节肠菌群结果减轻去卵巢小鼠的骨质疏松。

关键词： 中药制剂   泡腾片   含量测定   质量标准  

摘要： 目的:本课题研发缓解视疲劳泡腾片，处方由万寿菊叶黄素、决明子大黄素、葡萄籽原花青素、刺梨维生素C组成，通过对该泡腾片进行原料的质量研究、泡腾片制剂工艺的研究、质量标准草案及质量标准起草说明的建立、基于网络药理学方法研究缓解视疲劳药物作用机理。为确保制剂的质量稳定、可控提供研究依据以及为企业大批量生产提供保障。　　方法:通过对处方进行分析并采用生药学描述法与观察法对万寿菊叶黄素、决明子大黄素、葡萄籽原花青素、刺梨维生素C四种提取物原料进行研究;参考《中国药典》2015版关于中药材质量标准的相关规定，对四种提取物原料中的水分、总灰分进行了含量测定;采用薄层色谱法分别对四种提取物原料进行薄层鉴别。采用紫外分光光度法(UV)对原料中万寿菊叶黄素、葡萄籽原花青素进行含量测定。高效液相色谱法(HPLC)对原料中决明子大黄素进行含量测定。滴定法对原料中刺梨维生素C进行含量测定;选择合适的泡腾崩解剂、填充剂、稀释剂以及甜味剂作为辅料，通过小试筛选主药与各辅料的比例，确定制备该泡腾片的最佳工艺，制得缓解视疲劳泡腾片;研究按照2015版《中国药典（四部）》中片剂项下要求对该泡腾片进行质量标准研究。以性状、鉴别、崩解时限、pH值、含量测定等作为考察项目。对泡腾片进行崩解时限、pH等常规检查。采用薄层色谱法对泡腾片中万寿菊叶黄素、决明子大黄素、葡萄籽原花青素、刺梨维生素进行薄层鉴别。采用紫外分光光度法(UV)对泡腾片中万寿菊叶黄素、葡萄籽原花青素进行含量测定。高效液相色谱法(HPLC)对泡腾片中决明子大黄素进行含量测定。滴定法对泡腾片中刺梨维生素C进行含量测定，制定质量标准草案及质量标准起草说明。基于网络药理学方法研究了“万寿菊-决明子”药对的作用机理。　　结果:经处方分析，缓解视疲劳处方具有清肝明目，平肝解热，明目退翳的保健功能。经研究发现参考2015版《中国药典》对万寿菊叶黄素、决明子大黄素、葡萄籽原花青素、刺梨维生素C四种提取物原料中水分、灰分含量进行测定，水分含量依次为7.50％、7.29％、11.75％、9.22％，灰分含量依次为1.12％、4.56％、0.53％、0.43％。对万寿菊叶黄素、决明子大黄素、葡萄籽原花青素、刺梨维生素C提取物原料进行质量研究，原料质量可控制并合格;选择合适的泡腾崩解剂、填充剂、稀释剂以及甜味剂作为辅料，通过小试筛选主药与各辅料的比例，并最终确定制备该泡腾片的最佳工艺:碳酸氢钠（碱源）和柠檬酸（酸源）作为崩解剂，甜蜜素和阿斯巴甜作为甜味剂，按照处方比例与主药酸碱分开制粒后混合，整粒并压片，制得口感优良、崩解迅速的缓解视疲劳泡腾片;研究按照2015版《中国药典（四部）》中片剂项下要求对该泡腾片进行质量标准草案研究。对性状、鉴别、崩解时限、pH值、含量测定进行常规检查，采用薄层鉴别(TLC)结果显示，泡腾片中万寿菊叶黄素、决明子大黄素、葡萄籽原花青素、刺梨维生素C提取物与对照品在相同位置上有斑点，且阴性无干扰;方法学考察结果显示，紫外分光光度法测定万寿菊叶黄素、葡萄籽原花青素含量线性方程分别为y=0.1546x-0.0003,r2=0.9994y=73058x-132.98,r2=0.999;方法操作简便、分析速度快、准确度高;高效液相色谱法测定决明子大黄素含量专属性强、重复性好、稳定性好;滴定法测定刺梨维生素C含量，线性方程为y=0.0023x+0.0037r2=0.9996方法耐用性高、滴定结果准确。拟规定含量限度为:缓解视疲劳泡腾片，每片重1g(每片含叶黄素不低于4.9mg，大黄素不低于2.1mg，原花青素不低于61.9mg，维生素C不低于6.3mg)。.基于网络药理学方法研究缓解视疲劳药物作用机理，研究表明“万寿菊-决明子”药对信号通路直接或间接参与细胞、蛋白质的转录、参与氧化应激反应，清除自由基，缓解视疲劳的作用机理。与葡萄籽、刺梨强大的抗氧化功能协调作用，阐明了缓解视疲劳泡腾片具有清肝明目，平肝解热，缓解视疲劳的保健功能。　　结论:缓解视疲劳泡腾片中万寿菊叶黄素、决明子大黄素、葡萄籽原花青素、刺梨维生素C四种提取物原料均符合制剂要求，按照最佳工艺制得口感优良、崩解迅速的缓解视疲劳泡腾片，制定了质量标准草案及质量标准起草说明。并基于网络药理学方法阐述了缓解视疲劳药物作用机理。

关键词： 上转换纳米颗粒   适配体   黄曲霉毒素B1   免疫层析试纸条   荧光共振能量转移  

摘要： 当前,随着生活质量水平的改善,人们对于食品安全问题的关注度逐渐增高。其中,存在于食品及农产品中的黄曲霉毒素B1(AFB1)具有非常高的致癌性,主要存在于花生、牛奶、饲料、粮食之中。即使其浓度很低,也会导致食品的污染,引起肝硬化甚至肝癌等疾病,是人类健康的一大威胁。因此,寻找一种简单、灵敏的AFB1的测定方法对于食品安全和人类健康具有重要的意义。稀土掺杂的上转换纳米颗粒能够吸收近红外光并转换为可见光,具有发光稳定、不易被光漂白、荧光寿命长(可长达数十毫秒)等优点,在分析测试领域中具有重要的应用潜力。本文利用高温溶剂热法制备了稀土掺杂的上转换纳米颗粒,并通过层层包覆的方法对其进行壳包覆以提高发光强度,利用AFB1适配体偶联核壳结构上转换纳米颗粒构建了荧光纳米探针。在此之上,我们结合免疫层析技术与荧光共振能量转移原理建立了检测AFB1的两种方法,主要工作如下:第一种是开发了上转换荧光-适配体的免疫层析试纸条用来检测AFB1的方法。首先我们通过配体交换的方法,将上转换纳米颗粒进行改性的同时偶联上AFB1适配体,从而构建上转换荧光纳米探针。然后结合免疫层析试纸条并采用小分子竞争法对AFB1进行快速痕量检出,结果表明AFB1在5-100 ng/mL时具有良好的线性关系,检测限为2.4ng/mL。第二种是基于荧光共振能量转移的原理构建了上转换荧光-适配体传感器检测AFB1的方法。该方法将上转换纳米颗粒与AFB1适配体连接作为能量供体,另一段修饰猝灭基团BHQ1的寡核苷酸作为能量受体,通过碱基互补配对原则使两者结合,从而使上转换纳米颗粒和猝灭基团BHQ1相互靠近,发生荧光共振能量转移,导致上转换荧光猝灭。当待测物中含有AFB1时,AFB1会与其适配体特异性结合,从而导致双链解离,荧光得到恢复。通过检测上转换纳米颗粒546 nm处的发光强度来定量检测AFB1,结果表明AFB1在5-200 ng/mL线性关系良好,检测限为0.2376 ng/mL。

关键词： 肝细胞癌   蛋白质磷酸酶2A   过氧化氢   黄曲霉毒素B1   人肝癌细胞  

摘要： 目的:探索蛋白磷酸酶2A催化亚基（PP2Ac）蛋白在人肝细胞癌（HCC）和癌旁组织中的表达水平;探讨人肝癌细胞hep G2和Huh-7经过氧化氢（H2O2）氧化受损和黄曲霉毒素B1（AFB1）中毒后细胞中PP2Ac-α+β和去甲基PP2Ac蛋白表达水平以及对肝癌细胞的影响。方法:1.收集2017年7月-2019年7月期间广西医科大学附属肿瘤医院肝胆胰脾外科进行肝脏肿瘤切除并且由病理确定诊断是HCC的肿瘤标本作为实验材料。共纳入102例HCC组织及其癌旁组织标本。利用免疫组织化学实验测定PP2Ac-α+β在肝细胞癌组织和癌旁组织的表达情况,采用二级计分法评估实验结果。计数资料采取卡方检验统计分析。2.选取不同浓度的H2O2（0、50、100、200、400、800μmol/L）刺激人肝癌细胞（Hep G2/Huh-7细胞）2h、4h、6h和8h后,以及AFB1（0、1.25、2.5、5、10、20、40μmol/L）刺激人肝癌细胞（Hep G2/Huh-7细胞）24h和48 h后,倒置显微镜进行细胞形态观察,刃天青试剂测定细胞活性,Western Blot实验测定PP2Ac-α+β蛋白和去甲基化PP2Ac蛋白的表达情况。两组间比较选用独立样本t检验,多组间比较使用单因素方差分析以及析因设计资料采用两因素方差分析。结果:***2Ac-α+β蛋白在102例肝细胞癌组织中阴性表达为14例,弱阳性表达为20例,中度阳性表达为44例,强阳性表达为24例;低表达组（阴性和弱阳性表达）为34.3%（35例）;高表达组（中度阳性表达和强阳性表达）为65.7%（67例）。PP2Ac-α+β蛋白在102例肝细胞癌癌旁组织中阴性表达为70例,弱阳性表达为26例,中度阳性表达为6例,强阳性表达为0例;低表达组（阴性和弱阳性表达）为94.1%（96例）;高表达组（中度阳性表达和强阳性表达）为5.9%（6例）。肝细胞癌和癌旁组织中的低表达组与高表达组相比,差异具有统计学意义（=79.377,P=0.000）。免疫组化结果显示PP2Ac-α+β蛋白主要在HCC细胞的胞质中表达,在人HCC组织表达升高,而在癌旁组织表达降低。2.H2O2诱导人肝癌细胞急性损伤后,细胞形态发生变化,随着H2O2浓度的升高细胞活性降低、抑制率升高。在200/400μmol/L H2O2诱导人肝癌细胞2h后成功构建急性肝癌细胞损伤模型。***1诱导人肝癌细胞慢性损伤后,细胞形态发生变化,随着AFB1浓度的升高细胞活性降低、抑制率升高。在10/20μmol/L AFB1诱导人肝癌细胞24h后成功构建慢性肝癌细胞损伤模型。4.用200μmol/L H2O2诱导Hep G2 2h后,PP2Ac-α+β和去甲基化PP2Ac蛋白表达水平与对照组相比升高,差异均有统计学意义（t值分别为-5.553、-2.990,P值分别为0.005、0.040）;400μmol/L H2O2诱导Huh 7细胞2h后,PP2Ac-α+β和去甲基化PP2Ac蛋白表达水平与对照组相比升高,差异均有统计学意义（t值分别为0.073、-5.149,P值分别为0.002、0.007）。结果表明在人肝癌细胞内PP2Ac-α+β蛋白和去甲基化PP2Ac蛋白高表达。5.用10μmol/L AFB1诱导Hep G2细胞24h后,PP2Ac-α+β和去甲基化PP2Ac蛋白表达水平与对照组相比升高,差异均有统计学意义（t值分别为-4.561、-5.788,P值分别为0.010、0.004）;20μmol/L AFB1诱导Huh-7细胞24 h后,PP2Ac-α+β和去甲基化PP2Ac蛋白表达水平与对照组相比升高,差异均有统计学意义（t值分别为-5.120、-6.144,P值分别为0.007、0.004）。结果表明在人肝癌细胞内PP2Ac-α+β蛋白和去甲基化PP2Ac蛋白高表达。结论:PP2Ac-α+β蛋白主要在HCC的细胞质中表达,在人HCC组织中高表达。在人肝癌细胞（Hep G2/Huh-7）内PP2Ac-α+β蛋白和去甲基化PP2Ac蛋白高表达。PP2Ac可能参与HCC发生发展的调控,有可能成为潜在的、有诊断价值的抗HCC的新靶点。