生物医药-专题定制-三峡大学图书馆

张冬

湖南农业大学

摘要： 近年来,食品中真菌毒素污染成为重要的食品安全问题。黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1,AFB1）是毒性最强的真菌毒素之一,对人和动物具有多种毒性作用。酶联免疫吸附实验（Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay,ELISA）是一种广泛用于真菌毒素检测的方法,然而传统ELISA依赖酶催化底物获得比色信号,难以满足痕量检测的需求。荧光信号具有灵敏度高且重现性好等优势,开发基于荧光信号的改良型ELISA有望进一步提高检测结果的灵敏度与重现性。鉴于此,本文以ELISA为基础,结合核酸适配体（Aptamer,Apt）特异性识别的优势,开发了两种新型荧光免疫分析法,实现了AFB1的定量检测。具体研究内容如下:1.基于邻苯二胺和均苯三甲醛原位荧光检测AFB1研究发现,在酸催化下,邻苯二胺（OPD）与均苯三甲醛（BTA）可室温反应后制备具有苯并咪唑结构的荧光底物。另外,反应体系中加入EDTA-2Na,可打破反应平衡,进一步催化反应,从而导致荧光增强。由此,我们提出了一种新型的无酶夹心荧光免疫检测方法。使用Apt修饰的EDTA-2Na（Apt@EDTA-2Na）作为识别探针与信号调节器,通过待检物介导底物荧光增强,实现高灵敏检测。结果表明该方法检测AFB1的灵敏度达到了10-14g/m L,加标回收率在82%～110%之间。另外,实际样品的检测结果与商业化ELISA试剂盒基本一致,说明此方法具有较高的准确性及实际应用性。2.基于Si O2@QDs@Apt探针荧光免疫分析法检测AFB1该工作利用酰胺键将Si O2微球偶联Cd Te/Zn S量子点（Quantum dots,QDs）及AFB1特异性Apt,制备了具有较强荧光信号的Si O2@QDs@Apt捕获探针。通过Si O2@QDs@Apt探针与目标物的特异性结合,形成抗体-AFB1-Si O2@QDs@Apt的“三明治”夹心结构。研究荧光信号的变化与AFB1浓度的线性关系,得到方法线性范围为10-16～10-8g/m L,检测限为10-16g/m L。采用加标回收、实际样品分析以及与商业化ELSA试剂盒检测结果对比,实验结果表明该方法满足分析检测要求。

益生菌和甘草酸组合缓解霍菌毒素诱导的猪肠上皮细胞损伤作用

王晓敏

河南农业大学

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关键词： 黄曲霉毒素B1 玉米赤霉烯酮呕吐毒素 IPEC-J2细胞活力复合益生菌甘草酸

摘要： 黄曲霉毒素B1(AFB1)、玉米赤霉烯酮(ZEA)和呕吐毒素(DON)是目前农产品及饲料中最常见的污染率最高的三种霉菌毒素,人与畜摄入含AFB1、ZEA和DON的食物后会引起一系列的中毒症状。动物肠道是抵御霉菌毒素侵入的第一道防线,故本文以猪肠上皮细胞(IPEC-J2)为模型,研究AFB1、ZEA和DON的互作及累加细胞毒性,再通过复合益生菌、霉菌毒素降解酶及其配伍来降解这三种霉菌毒素,最后在细胞水平上研究复合益生菌和甘草酸配伍对AFB1、ZEA和DON致IPEC-J2细胞损伤的保护作用。试验分为三部分:(1)AFB1、ZEA和DON致IPEC-J2细胞损伤的模型构建利用 Design-Expert 8.0.6 软件,以 AFB1:10、20、30 μg/L,ZEA:150、300、450 μg/L,DON:500、1000、1500 μg/L分别作为Box-Behnke设计三因素的三个编码水平,采用MTT法检测AFB1、ZEA和DON联合染毒IPEC-J2细胞24 h后的细胞活力。结果表明:细胞活力最低(霉菌毒素毒性最高)的AFB1、ZEA和DON组合为30、150和1500μg/L,经测定细胞活力为32.32%;细胞活力最高(霉菌毒素毒性最低)的AFB1、ZEA和DON组合为10、150和600μg/L,经测定细胞活力为53.01%。(2)复合益生菌和霉菌毒素降解酶对AFB1、ZEA和DON的同步降解首先选用拉丁方试验设计获得枯草芽孢杆菌K4、酿酒酵母和乳酸假单胞菌的最佳组合,然后再与霉菌毒素降解酶配伍。结果表明:当枯草芽孢杆菌K4、酿酒酵母菌和乳酸假单胞菌对应活菌数分别为1×105、1×105和1×105 CFU/mL时,对AFB1、ZEA和DON的联合降解效果最好。霉菌毒素毒性最高组AFB1、ZEA和DON的降解率分别为40.55%、56.05%和47.22%(P<0.05),霉菌毒素毒性最低组AFB1、ZEA和DON的降解率分别为43.05%、38.26%和80.49%(P<0.05)。复合益生菌与霉菌毒素降解酶的配伍试验结果表明:在霉菌毒素毒性最高的降解试验中:单一复合益生菌、单一霉菌毒素降解酶及两者的配比为30:1时,对三种霉菌毒素的总降解率最高,分别到达了 1 90.08%、175.10%和184.44%,显著高于其他各组(P<0.05)。在霉菌毒素毒性最低的降解试验中:单一霉菌毒素降解酶对三种霉菌毒素的总降解率最高,达到了 219.23%(P<0.05);其次为单一复合益生菌及两者的配伍比例为30:1和3:2时,对三种霉菌毒素的总降解率较高,分别达到了 178.07%、181.84%和170.33%,显著高于其他组(P<0.05)。(3)复合益生菌与甘草酸对AFB1、ZEA和DON诱导IPEC-J2细胞损伤的缓解作用1)甘草酸(GA)与AFB1、ZEA和DON共培养对IPEC-J2细胞活力的影响。结果表明:在霉菌毒素毒性最高组中,毒素+甘草酸(200、400、600 μg/mL)组较毒素组细胞活力分别提高了 49.40%、72.98%、78.45%(P<0.05)。在霉菌毒素毒性最低组中,毒素+甘草酸(200、400、600 μg/mL)组较毒素组细胞活力分别提高了 30.76%、44.22%、60.09%(P<0.05)。故选用甘草酸400μg/mL进行后续试验。2)复合益生菌、霉菌毒素降解酶、甘草酸与AFB1、ZEA和DON共培养对IPEC-J2细胞活力的影响。结果表明:与毒素组相比,在加入毒素的同时上加入复合益生菌、甘草酸及两者配伍后,在霉菌毒素毒性最高组的试验中,细胞活力分别提高了 31.48%、69.42%、66.52%(P<0.05);在霉菌毒素毒性最低组的试验中,细胞活力分别提高了 53.10%、106.82%、100.21%(P<0.05)。霉菌毒素降解酶没有缓解细胞损伤的能力且与细胞单独培养时显著降低细胞活力,故不进行后续试验。3)霉菌毒素的生物降解产物对IPEC-J2细胞活力的影响。结果表明:与未处理空白细胞组相比,经霉菌毒素降解产物作用IPEC-J2细胞24 h后,细胞存活率达到82%以上,降解后的细胞毒性与降解前相比显著降低(P<0.05),几乎无细胞毒性。4)复合益生菌+甘草酸对AFB1、ZEA和DON诱导的IPEC-J2细胞凋亡的影响。试验分为对照组(Control)、低剂量霉菌毒素组(ADZ)、复合益生菌+甘草酸组(CGA)、低剂量霉菌毒素+复合益生菌+甘草酸组(ADZ+CGA)。结果表明:与对照组(细胞凋亡率为4.37%)相比,ADZ组增加了细胞凋亡率至6.12%(P<0.05),CGA组显著降低了细胞凋亡率至3.47%(P<0.05)。与ADZ组相比,ADZ+CGA组细胞总凋

瞬时弹射式蒸汽爆破与生物法联合降解黄曲霉毒素B1的研究

高蕾

河南农业大学

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关键词： 黄曲霉毒素B1 玉米秸秆瞬时弹射式蒸汽爆破技术降解途径

摘要： 全世界约25%谷物供应受真菌毒素污染。谷物污染给食品和饲料工业带来巨大经济损失,严重威胁着人类健康。真菌毒素中黄曲霉毒素（Aflatoxin,AF）,尤其黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1,AFB1）是迄今发现的最强的一类生物毒素,该毒素对人和动物有极强的致突变、致癌和致畸性。因此,如何高效去除黄曲霉毒素就成为当今亟待解决的重大问题。AF去除方法主要有物理法,化学法和生物法等,这些方法能够降解食品与饲料原料中的AFB1,但都存在一些问题,如成本高、时间长、二次污染、去除效果不佳等,寻求一种高效无毒成本低且可大规模处理AFB1的降解方法是非常必要的。瞬时弹射式蒸汽爆破技术（Instant Catapult Steam Explosion,ICSE）是利用蒸汽弹射原理实现的爆炸过程对生物质进行预处理的一种技术,具有爆破时间短和爆破强度高的优点。本研究利用ICSE降解污染玉米秸秆中的AFB1,在不同的爆破压力（温度）和爆破时间下处理后（AFB1降解率要求达到98%±2%）,将各种降解产物分别基于Ames实验和MTT试验进行毒性评价,确定高效低毒的爆破条件;利用超高效液相色谱质谱联用（Ultra-Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry/Mass Spectrometry,UPLC-MS/MS）分析此爆破条件下的AFB1的降解产物,推测其降解途径,揭示ICSE降解AFB1的内在机制;筛选能高效降解AFB1的微生物,利用ICSE与生物法联合高效降解污染原料中的AFB1,真正实现AFB1的高效低毒降解,为实现农作物资源的无害化和高值化提供理论依据,为进一步推进我国饲料和食品安全奠定理论基础。主要的研究结果如下。（1）基于ICSE处理加标玉米秸秆,确定高效低毒的爆破条件。实验结果表明:选择1.4 MPa 850 s、1.6 MPa 560 s、1.8 MPa 370 s、2.0 MPa 240 s、2.2 MPa 190 s进行爆破处理,此时AFB1的降解率约98%±2%,Ames实验和MTT实验结果表明在1.8 MPa 370 s爆破条件下AFB1降解产物毒性最低。通过UPLC-MS/MS测定此爆破条件下的降解产物,分析出3种降解产物,并推测了3条降解途径,第一条AFB1还原脱羧生成产物1(C16H12O5),第二条AFB1加成脱氢生成产物2(C17H12O7),第三条AFB1加成水解生成产物3(C17H14O6)。（2）生物法降解AFB1的研究。筛选3株高效降解AFB1的菌株,经鉴定3株菌分别为环状芽孢杆菌Gao-00（Bacillus circulans）、矮小芽孢杆菌Gao-10（Bacillus pumilus）、死谷芽孢杆菌Gao-20（Bacillus vallismortis）,AFB1降解率分别达到77.46%、73.25%、81.44%。测定Gao-20无细胞上清液中AFB1降解率,发现降解AFB1的主要成份存在于无细胞上清液中,并且耐蛋白酶K、SDS处理,耐高温。基于UPLC-MS/MS测定Gao-20菌株对AFB1降解产物有2种,分别为产物1和产物2,分子式为C19H19NO8S和C21H15NO9,推测2条降解途径,分别为牛磺酸结合反应和谷氨酸结合反应。（3）ICSE与生物法联合高效降解污染原料中的AFB1的研究。将环状芽孢杆菌Gao-00、矮小芽孢杆菌Gao-10和死谷芽孢杆菌Gao-20菌液及其无细胞上清液与爆破后秸秆水提液混合进行液态发酵,72 h后AFB1浓度发生明显下降,降解率分别为97.23%、96.77%、98.24%、86.85%、98.51%、98.31%,3株菌的菌液及无细胞上清液在爆破后秸秆水提液的液态发酵中对AFB1起很好的降解作用。

试分析中药制剂吸湿性分析与防潮技术

韦慧鲜钟彩娜黄佳伟阮碧芳

广西农业职业技术学院广西南宁 530007

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