关键词：
适配体
氯霉素
T-2毒素
黄曲霉毒素B1
截短优化
结合机理
虚拟突变
摘要：
适配体是通过SELEX（Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment）技术筛选得到的能特异性识别靶标的寡核苷酸,具有稳定性好、易于化学修饰、亲和力和特异性好以及免疫原性低等特点,在疾病诊断与治疗、生物成像和分析检测等领域得到了越来越广泛的应用。食品安全危害物指的是食品中所含有的对人体健康有潜在不良影响的生物、化学或物理因子,其中,食品中抗生素的残留和真菌毒素的污染是食品安全监测的重要组成部分。本论文以氯霉素和真菌毒素为研究对象,对适配体序列进行了截短优化和虚拟突变,提高了适配体的亲和力,并结合等温滴定量热法、圆二色谱法、荧光标记法、酶切法、分子对接和分子动力学研究了适配体与靶标的结合机制,同时基于适配体的识别机制,结合聚合酶链式反应、核酸酶的信号扩增技术和杂交链式反应等建立了灵敏、准确和快速的新型检测方法,为适配体在食品安全危害物检测中的应用提供了新的思路和理论基础。首先,利用经SELEX技术筛选得到的原长80碱基的氯霉素适配体,构建了荧光偏振法检测氯霉素。适配体与氯霉素在结合缓冲液中孵育,通过氧化石墨烯的吸附去除未与氯霉素结合的游离适配体,以分离得到的适配体-氯霉素复合物为模板,荧光基团FAM标记的引物为初始荧光偏振信号,进行聚合酶链式反应（PCR）扩增,再向PCR产物中加入链霉亲和素,利用链霉亲和素-生物素作用进一步扩增PCR产物的分子量,实现了对荧光偏振信号的双重放大。在最优的检测条件下,荧光偏振值与氯霉素浓度的对数值呈良好的线性关系,检测的线性范围为0.001 nmol/L-200 nmol/L,检测限为0.5 pmol/L,在蜂蜜样品中的加标回收率为95%-107%。其次,基于分子对接得到的适配体和氯霉素的关键结合域,利用无两端引物区碱基数量为40的氯霉素适配体,构建了核酸外切酶I（Exo-I）和杂交链式反应（HCR）双重扩增的荧光适配体传感器。首先利用等温滴定量热法、圆二色谱法和分子对接研究了适配体与氯霉素的识别机制,确定适配体结合氯霉素的关键结合域。HCR的引发链与适配体结合域通过碱基互补配对连接,适配体识别氯霉素时发生构象变化与引发链解离,Exo-I剪切适配体-氯霉素复合物循环释放氯霉素,暴露出更多HCR引发链,加入HCR的两种茎-环链后,引发HCR,荧光信号实现扩增。在优化的实验条件下,该方法可实现对氯霉素在0.001 nmol/L-100 nmol/L浓度范围内的线性检测,检测限为0.3 pmol/L,在牛奶样品中的加标回收率为91%-109%。第三,通过在序列两端逐步去除碱基的方式,对氯霉素适配体进行了系统性的截短优化,并利用优化后碱基数量为30的适配体LLR10的变构象结合模式构建了简便的荧光偏振适配体传感器。利用圆二色谱法、紫外可见光分光光度法和分子对接研究了LLR10识别氯霉素的机制,发现缓冲液中阳离子浓度尤其是Mg2+浓度对LLR10识别氯霉素发挥着至关重要的作用,LLR10的小沟区域为氯霉素的结合域。基于LLR10与氯霉素的识别机制,利用SYBR Green I提供荧光偏振信号、LLR10为识别探针构建了无标记的荧光偏振法检测氯霉素,在最优的实验条件下,对氯霉素检测的线性范围为0.1nmol/L-10 nmol/L,检测限为0.06 nmol/L,在牛奶和蜂蜜样品中检测的加标回收率分别为95%-98%和94%-108%,该方法操作简便,检测用时短,灵敏准确且无需分离。第四,利用分子对接指导定向截短优化了T-2毒素和黄曲霉毒素B1（AFB1）的适配体,系统性地研究了优化适配体与靶标的结合机制,利用优化的适配体和SYBR Green I实现了对T-2毒素的快速检测。根据分子对接预测的适配体和靶标的结合域,通过2次截短和1次截短分别得到了T-2毒素的含有40个碱基的适配体T40和AFB1的含有32个碱基的适配体B32。利用圆二色谱、荧光标记、酶切和分子对接系统性地研究了T-2毒素与T40和AFB1与B32的结合机制,发现T40与T-2毒素的结合域位于T40的茎部区域,B32与AFB1的结合域位于B32的环部区域。以T40作为识别探针,SG扩增荧光信号,实现了对T-2毒素的灵敏和快速检测,在0.03 nmol/L-30 nmol/L的浓度范围内,荧光强度与T-2毒素的浓度呈良好的线性关系,检测限为0.01 nmol/L,在啤酒样品中的加标回收率在94%-107%。该方法检测灵敏度高,操作简便且检测用时短。第五,利用圆二色谱和分子动力学系统性地研究了适配体B32与AFB1、AFB2、AFM1和AFG1的识别机制。B32对4种靶标亲和力大小顺序为AFB2、AFB1、AFM1和AFG1,即B32对AFB2的亲和力最好而对AFG1的亲和力最差
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