关键词： 黄曲霉毒素B1   代谢   胎盘屏障   神经干细胞   体外模型  

摘要： 黄曲霉毒素（Aflatoxins,AFs）是黄曲霉和寄生曲霉的次生代谢产物,广泛存在于几乎所有谷物、饲草和各种食品中,是目前已知的化学致癌物中毒性最大的一种真菌毒素。早在1993年,AFs就被世界卫生组织（World Health Organization,WHO）划定为Ⅰ类致癌物。其中,黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1,AFB1）是AFs家族中毒性最强的一种,且在世界范围内的污染率极高。已知AFB1进入人体后会经肝脏代谢并产生毒性,且能够从母体经胎盘屏障转移至胎儿一侧,导致婴儿出生时身高体重下降,头围较小,甚至引发早产或流产。因此,研究AFB1从母体至胎儿的流动过程以及在妊娠期对胎儿的影响十分必要。 目前已有研究多集中于AFB1在人体内代谢、AFB1跨胎盘屏障转运机制以及单纯的体外胎盘屏障模型构建上,对AFB1跨胎盘屏障的神经毒性几乎无人涉猎。AFB1的毒性评价由于伦理问题无法直接以人作为研究对象,因此难以进行。本研究通过一种表达AFB1相关代谢酶的人肝癌细胞（Human hepatoellular carcinomas,Hep G2）模拟AFB1摄入母体后的代谢,并用人胎盘绒膜癌细胞（Be Wo cells）和人脐静脉内皮细胞（Human umbilical vein endothelial cells,HUVEC）模拟人胎盘屏障细胞,搭建一体化胎盘屏障模型,研究了AFB1肝脏代谢物跨胎盘屏障后对神经干细胞（Neural stem cells,NSCs）生长的影响,以此新型毒理学评估模型测定妊娠期母体摄入AFB1对胎儿神经细胞发育的影响。 本研究的主要内容如下: ***1及其肝脏代谢物对Be Wo细胞的影响 25-200μM的AFB1暴露会使Hep G2细胞发生细胞数量减少、贴壁性变差、细胞直径变小,细胞外形由饱满变为皱缩等形态学变化;5-50μM的AFB1暴露会使Hep G2细胞的存活率由97.13%降低至83.11%,且细胞生长受到的影响与AFB1的暴露浓度呈正相关。当AFB1暴露终浓度为0.0641μM（GB浓度）、5μM和10μM时,LC-MS/MS检测AFB1经Hep G2细胞模拟的肝脏代谢物有AFB1、AFB2、AFG1和AFG2。 将Be Wo细胞暴露于不同浓度的AFB1及其肝脏代谢物后,γ-H2AX免疫荧光染色结果显示,细胞DNA双链断裂点会随着暴露浓度的增大而增多,且AFB1代谢后比代谢前对Be Wo细胞DNA的损伤更大。 2.应用普通培养皿培养法探究AFB1及其肝脏代谢物对NSCs的影响 NSCs在暴露于0.0641μM、5μM和10μM的AFB1及其肝脏代谢物后,会发生细胞直径变小、细胞形态由饱满变为皱缩甚至完全萎缩、胞间丝状联结发生衰竭等形态学变化。同时,细胞DNA的双链和单链都会发生损伤,其中γ-H2AX免疫荧光染色结果显示NSCs中的DNA断裂点随着AFB1及其肝脏代谢物暴露浓度的升高而增多;彗星实验所检测的DNA单链损伤呈相同趋势;整体来看DNA单链损伤的程度要高于双链损伤。不同于Be Wo细胞的是,AFB1代谢前比代谢后对NSCs的损伤更大。 以胞内活性氧、乳酸脱氢酶（Lactate Dehydrogenase,LDH）释放量和细胞凋亡情况作为指标评价NSCs的损伤,发现AFB1肝脏代谢物会造成NSCs胞内活性氧含量升高、细胞膜破损以及细胞凋亡水平的增强,其中存在明显的浓度依赖性,表明AFB1肝脏代谢物对NSCs有明显的细胞毒性和多方面的损伤作用。 3.应用一体化胎盘屏障模型探究AFB1肝脏代谢物对NSCs的影响 利用Transwell培养板,通过Be Wo、HUVEC和NSCs三种细胞的共培养以及Be Wo细胞的合体化诱导,我们建立了胎盘屏障-神经细胞-一体化体外模型。AFB1肝脏代谢物在普通培养皿培养法中对NSCs的损伤作用在一体化模型中都得到了再次体现,且损伤会进一步增强。这表明AFB1肝脏代谢物跨胎盘屏障后对NSCs的影响要大于直接影响,在一定程度上证明了在母体暴露的AFB1经过母体代谢后不仅能够穿过胎盘屏障到达胎儿一侧,还能够通过跨胎盘屏障的过程进一步放大其毒性作用,并对胎儿的神经细胞造成多方面的损伤。 综上,本研究较完整地模拟了“AFB1-肝脏-胎盘屏障-神经”这条代谢通路,将AFB1跨胎盘屏障运输以及对胎儿神经细胞的影响相联系,为研发新型体外毒理评价模型打下了基础,同时为研究妊娠期母体暴露于药物和毒素对胎儿的影响提供了新的思路。

关键词： 纳米递送   酶催化   磷酸钙   榄香烯  

摘要： 随着载酶载药材料的发展,纳米药物与纳米催化两个学科逐步交叉,形成纳米催化药物疗法。催化过程产生的自由基与肿瘤、心血管疾病及糖尿病等多种疾病相关。众多药物可通过催化调控细胞氧化还原过程来改变自由基状态,以达到改善正气亏虚、气滞血瘀、痰湿凝聚以及邪毒内蕴的目的从而实现抗肿瘤、抗氧化、抗炎等药物作用。催化药物虽然具有毒性低、持续效应长、生物兼容性好等突出优点,但其生物降解度低、催化负载量低及外源性等问题仍需要解决。负载材料纳米化技术可提高药物的有效成分水溶性及生物利用度。论文针对催化纳米疗法材料纳米化制备及其与中药榄香烯的联用展开了如下研究工作:1、对作为基础纳米载体材料的碳酸镁、碳酸钙和无定形磷酸钙的制备流程进行了探究。采用共沉淀法制备了碳酸镁、碳酸钙和无定形磷酸钙的载酶颗粒。发现无定形磷酸钙-葡萄糖氧化酶纳米粒子可以形成尺度较为均一的球状纳米结构,同时通过其独特的水合结构保持了良好的酶催化活性,较碳酸镁和碳酸钙体现出更优良的生物应用前景。2、研究了无定形磷酸钙对不同蛋白和天然药物的负载能力。其中对葡萄糖氧化酶的负载量可达到97.3%,牛血清蛋白及发酵虫草菌的负载量达到55.2%、56.3%,说明部分蛋白及天然药物可通过无定形磷酸钙共沉淀方法实现快速负载,为提升蛋白及药物负载量提供了有效制备途径。3、对葡萄糖氧化酶纳米粒子进行了粒径精准调控。通过纳米孔道挤出法可得到粒径可控且具良好稳定性的纳米粒子,粒径精确调控的粒子可适于细胞内应用场景。作为一种不破坏细胞结构且具有高度生物安全性的细胞内葡萄糖检测手段,不仅可结合荧光探针以区分不同糖代谢水平的肿瘤细胞,还可以用来分析筛选不同细胞内的糖代谢状态,为癌症的诊治提供代谢基础数据。4、利用“分子配伍”理论,将榄香烯与级联催化粒子联用,以更安全有效的方式实现抗肿瘤目的。通过细胞凋亡的实验,两药联用与对照组相比可使早凋提高15.57%,晚凋提高14.08%,并超过分别单独给药对细胞早凋与晚凋的影响。利用仿生原理,将细胞膜包覆于级联催化粒子表面,实现高度生物相容性的抗肿瘤应用。通过细胞毒性实验得到其IC50为7.83μg/ml。实验结果说明纳米催化药物技术与传统中药有效成分相结合可以协同高效发挥抗肿瘤作用,同时通过表面修饰提升纳米粒子体内递送效率。

关键词： 黄曲霉毒素B1   黄曲霉毒素降解酶   大肠杆菌   酶法降解   毕赤酵母  

摘要： 自然界中广泛存在的黄曲霉毒素B1（AFB1）由于潜在的致癌性威胁着人类以及动物的健康。酶法降解作为一种有效且环保的方法逐渐被人们应用。但是目前发现的大多数是野生酶,由于野生酶的不稳定性难以被广泛的应用和开发。所以本研究克隆了来自云芝（Trametes versicolor）中的黄曲霉毒素降解酶基因（TV-AFB1D）,成功构建p ET-28a（+）-TV-AFB1D原核表达载体以及p PIC9K-His-TV-AFB1D真核表达载体。研究了TV-AFB1D的酶学特性和降解AFB1的效果,研究了TV-AFB1D在AFB1污染的花生中的应用,本研究为进一步探索TV-AFB1D在AFB1降解中应用提供了依据,主要结论如下:（1）TV-AFB1D基因的克隆和信息学分析。从云芝中通过反转录PCR扩增得到了TV-AFB1D基因,构建重组克隆载体p EASY-TV-AFB1D,转入*** DH5α,测序验证序列正确并进行分析。TV-AFB1D与Trametes versicolor FP-101664 SS1（序列号:txid717944）同源性99.76%。蛋白质进化树表明,TV-AFB1D与Trametes pubescens的黄曲霉毒素降解酶有最高的同源性。目的蛋白由696个氨基酸构成,分子式为C3478H5422N916O1052S7,相对分子质量为33572.34,是亲水性蛋白,其中不含有信号肽。TV-AFB1D有45.26%的α-螺旋,12.93%的β-折叠,41.81%的无规则卷曲,并且TV-AFB1D中没有非常规的二级结构。（2）TV-AFB1D表达优化和酶学特性的研究。构建表达载体p ET-28a（+）-TV-AFB1D,并成功导入*** BL21（DE3）进行表达。重组大肠杆菌中最优诱导条件为:4 h和0.8 mmol·L-1 IPTG。经过Ni2+纯化和SDS-PAGE表明,蛋白质大小为77 k Da。酶学特性研究表明,TV-AFB1D的最适p H和最适温度分别是7和32℃,在p H 6-8和30-34℃内其残余酶活力最好,稳定性最高。酶动力学参数:y=0.01671x+1.80756(R2=0.994,Km=9.24 mmol·L-1,Vmax=553.23 m M·min-1)。反应初始的催化速度和反应温度的关系为:lnv=16.51-3338.73/T（R2=0.999）。圆二色谱研究表明,无规则卷曲、α-螺旋和反平行结构的百分比可能是影响TV-AFB1D活性和稳定性的主要因素。（3）TV-AFB1D催化AFB1的研究。HPLC表明了催化后,有特异性产物的生成,催化时间5 h降解67.4%的AFB1。分子对接模型表明,TV-AFB1D与AFB1之间存在着氢键作用力。LC-TOF-MS表明了有新的产物生成,通过推测产物的分子式有可能是C12H12O2或C13H12O4。（4）重组毕赤酵母（***）GS115的构建和在AFB1污染花生中的初步应用。通过双酶切连接构建p PIC9K-His-TV-AFB1D表达载体。通过电穿孔法转化入*** GS115中,构建出表型为His+Mut+的***。诱导84 h后,经过Ni2+纯化和SDS-PAGE表明出现77 k Da的特异性蛋白条带,酶活达到17.5 U/m L。诱导时间84 h时,温度为28℃和0.8%的甲醇浓度下,重组*** GS115表达的TV-AFB1D诱导条件最优。TV-AFB1D催化12 h,降解率达到75.9%。对于AFB1污染的花生中,催化18 h后,降解率达到48.5%。通过温度探究,发现在34℃下对污染的花生中的AFB1降解效果最好。

关键词： 黄曲霉毒素B1   AA肉鸡   姜黄素   CYP450酶   DNA甲基化  

摘要： 黄曲霉毒素B1(AFB1)是最具毒性、致癌性和污染性的霉菌毒素之一,由黄曲霉和寄生曲霉代谢产生,对人体健康和食品安全极为有害。AFB1是一种前致癌物,在肝脏中,经Ⅰ相代谢酶细胞色素P450(CYP450)酶活化,产生有害的AFB1-8,9-环氧化物(AFB1-8,9-epoxide,AFBO),其可对蛋白质及DNA等生物大分子造成损伤,导致细胞的凋亡、坏死甚至致癌,因此AFB1被国际癌症研究组织定位为“1类致癌物”。DNA甲基化是已知最早被发现的表观遗传机制,在动物细胞的基因组DNA中,约4%的胞嘧啶(C)是5-甲基胞嘧啶(5-m C)的形式,这是最常见的甲基化形式。研究结果显示,一般DNA整体水平的低甲基化和抑癌基因启动子区DNA的高甲基化,是癌症过程中典型的表观遗传学变化。姜黄素(Curcumin)是从姜黄中提取的多酚类化合物,具有多种药理作用,包括抗氧化、抗炎和抗肿瘤作用等,还具有很强的保护肝脏细胞的潜力。前期研究发现,姜黄素能有效缓解AFB1的毒性作用,但姜黄素缓解肉鸡AFB1中毒的作用机制尚不十分明确,尤其DNA甲基化与AFB1致肝毒性及其姜黄素的影响,目前报道较少。在本试验中,将64只1日龄AA肉鸡适应性饲养3日后随机分为4组,即空白对照组、AFB1组(1 mg/kg AFB1)、姜黄素+AFB1干预组(1 mg/kg AFB1+300 mg/kg姜黄素)和姜黄素对照组(300 mg/kg姜黄素),通过对肉鸡血清生理生化指标(ALT、AST、AKP、GGT)、肝脏氧化应激指标(MDA、SOD、CAT、GSH、ROS)、肝组织病理学以及AFB1-DNA加合物的测定,以评估姜黄素对AFB1中毒肉鸡肝损伤的干预效果;采用Real-Time PCR方法检测不同处理组肉鸡肝脏三种Ⅰ相代谢酶CYP1A1、CYP1A2、CYP3A4的基因表达量;采用HPLC方法检测CYP1A2、CYP3A4的酶活性以及AFB1所致肉鸡肝DNA整体甲基化水平,采用Real-Time PCR方法检测DNMT1、DNMT3a、DNMT3b三种DNA甲基转移酶的基因表达量,并分析DNA整体甲基化水平、DNMTs、CYP450酶三者之间的相互关系,初步探究表观遗传学DNA甲基化在AFB1致肉鸡肝损伤中的作用及其姜黄素的影响。本研究结果为预防和治疗AFB1肝毒性及姜黄素在兽医临床的进一步开发提供了理论科学依据。研究结果如下:连续染毒28 d进行检测,发现AFB1组肉鸡出现了肝损伤的症状,血清酶活性增加、抗氧化酶活性降低、活性氧产生增加、肝细胞变性;免疫组化试验显示,AFB1组肉鸡AFB1-DNA加合物含量升高,核中棕黑色小颗粒明显增多。姜黄素干预后可以有效改善上述AFB1所致肉鸡肝损伤症状,表明姜黄素可通过抑制过氧化作用和AFB1-DNA加合物的产生来减轻AFB1的毒性。结合CYP450酶m RNA及酶活检测的试验结果,AFB1组肉鸡肝脏CYP1A1和CYP1A2 m RNA表达量显著上调(P<0.05),CYP3A4 m RNA表达量极显著上调(P<0.01),CYP1A2和CYP3A4酶活性呈现出与m RNA相类似的变化趋势,而添加姜黄素有效逆转上述变化,推测姜黄素可能通过降低CYP1A1、CYP1A2和CYP3A4基因水平的表达,减少AFB1在体内的转化来降低AFB1的肝毒性。DNMTs m RNA及肝脏DNA整体甲基化水平检测结果表明,AFB1组肉鸡肝脏DNA整体甲基化水平和DNMT1、DNMT3a、DNMT3b m RNA表达量均极显著降低(P<0.01),而姜黄素+AFB1组肉鸡肝脏DNA整体甲基化水平和DNMT1、DNMT3a、DNMT3b m RNA表达量明显高于AFB1组,证明DNMT1、DNMT3a和DNMT3b共同作用来维持DNA甲基化模式,姜黄素可通过增加肉鸡肝脏DNA整体甲基化水平以及DNMTs的表达量来减轻AFB1的毒性。结合Pearson检验和相关性分析结果,肉鸡肝脏DNA整体甲基化水平与DNMT1、DNMT3a和DNMT3b水平均呈正相关,而肉鸡肝脏DNA整体甲基化水平及DNMTs基因表达量与CYP1A1、CYP1A2和CYP3A4间均呈负相关。综上所述,本试验结果表明饲喂AFB1会导致肉鸡出现肝功能损伤,同时伴随肝脏CYP1A1、CYP1A2、CYP3A4的表达量显著上升,DNA整体甲基化水平以及DNMTs的表达量的显著降低;给予姜黄素可缓解AFB1所致肉鸡肝损伤;姜黄素可通过提高肝脏的抗氧化能力,降低肝脏CYP450酶(CYP1A1、CYP1A2、CYP3A4)的表达和酶的活性,减少AFB1-DNA加合物的生成,增加DNA整体甲基化水平以及DNMTs的表达量等途径对肝脏提供保护作用。本研究结果为丰富AFB1致肝毒性机制及

关键词： 黄曲霉毒素B1   玉米赤霉烯酮   融合酶   连接肽   真菌毒素降解   乳酸克鲁维酵母  

摘要： 全球食品中的真菌毒素污染正在威胁着人类的健康安全,其中黄曲霉毒素B1（Aflatoxins B1,AFB1）和玉米赤霉烯酮（Zearalenone,ZEN）是最为常见的两种真菌毒素,会引发肝癌、生长迟缓、生殖系统损坏等多种疾病。尽管目前对于以上两种真菌毒素的降解方法多样,但对这两种真菌毒素同时降解的生物法研究较少。而由于谷物中AFB1和ZEN污染的普遍性,亟需一种能够温和、高效实现两种毒素同时降解的方法。玉米赤霉烯酮水解酶ZHD101.1由ZHD101突变得到,优化前对ZEN的降解率为42.91%;锰过氧化物酶Phc Mnp能通过破坏AFB1呋喃环上的8,9位双键实现脱毒,优化前降解率为50.52%。上述两种酶都在食品级酵母乳酸克鲁维（Kluyveromyces lactis）中实现了分泌表达。因此,本文利用连接肽（GGGGS）_n（n=1～4）构建了ZHD101.1和Phc Mnp的融合酶,在乳酸克鲁维酵母中实现融合酶的表达。并对重组菌诱导表达融合酶的条件和重组酵母菌的发酵上清液对两种毒素的降解条件进行了优化。具体研究如下:1、本研究尝试利用多个单位的柔性连接肽（GGGGS）_n（n=1～4）连接玉米赤霉烯酮水解酶ZHD101.1和锰过氧化物酶Phc Mnp以构建融合酶ZPFn,成功得到了以一个单位GGGGS构建的融合酶ZPF1,并构建了食品级乳酸克鲁维酵母重组酵母菌株GG799（p KLAC1-ZPF1）。进行诱导表达后发现其发酵上清液可以降解AFB1和ZEN,降解率分别为46.46%和35.38%。2、对重组酵母菌GG799（pKLAC1-ZPF1）的诱导表达条件进行优化,最优条件为:25℃下诱导72 h,培养基中含40.0 g/L半乳糖、0.5 mmol/L Mn SO4和0.2 mmol/L hemin。3、研究了在两种反应体系中融合酶ZPF1对AFB1和ZEN降解效率,并优化了反应条件。（1）反应体系1（PhcMnp反应体系）中的最优降解反应条件为:将含有0.2 mmol/L Mn SO4、1.0 mmol/L H2O2和2.0 mg/m L发酵液蛋白的丙二酸（p H 4.0）缓冲液在40℃下反应8 h。优化后ZPF1对AFB1和ZEN的降解率分别为64.11±2.93%和46.21±3.17%,分别提高了17.65%、7.45%。（2）反应体系2（ZHD101.1反应体系）中融合酶ZPF1对AFB1没有降解作用,对ZEN的最优降解反应条件为:将含有2.0 mg/m L发酵液蛋白的Tris-HCl（p H 7.5）缓冲液在40℃下反应30 min,降解率为41.45±2.24%,提高了6.07%。4、为制备大量重组酵母菌菌剂,对重组酵母菌GG799（pKLAC1-ZPF1）培养基的成分和培养条件进行优化以提高生物量。优化后的最优培养基为:葡萄糖20.409 g/L、蛋白胨30.455 g/L、酵母浸粉24.725 g/L、KH2PO4 4.477 g/L、Mg SO4 0.646 g/L;最优培养条件为:26℃、220 rpm、初始p H 4.5。在上述条件下,用5 L发酵罐进行高密度扩大培养,其生物量为34.05±3.34 g/L,是普通摇瓶发酵的3.95倍。5、对重组酵母菌菌剂的制备工艺条件（离心条件、保护剂比例、干燥方式、储存方式）进行了优化,最优制备工艺为:发酵结束后在6000 rpm下离心15 min收集菌体,选择保护剂与湿菌体的比例为3:1的喷雾干燥法,并将菌剂置于-20℃下储存得到的菌活最高。储存三个月后复性得到的重组酵母菌发酵上清液,在反应体系1中对AFB1和ZEN的降解率为48.18±3.23%和34.83±2.82%;在反应体系2中对ZEN的降解率为30.1±2.73%。

关键词： 电化学生物传感器   黄曲霉毒素B1   适配体   层层自组装   自支撑电极  

摘要： 食品安全一直是全人类社会重点关注的领域之一,而具有肝毒性、致突变性的黄曲霉毒素B1（AFB1）严重威胁到食品安全和经济发展。开发出具有高效的AFB1检测方法对提高食品安全具有重要意义。目前多数AFB1检测方法都有其局限性,如准确度低、操作复杂、成本高等。为了研发出操作简单、灵敏度高、稳定可靠的AFB1检测方法,本文使用多种碳材料——石墨烯（GN）、碳纳米管（CNT）和碳纤维（CF）,按照不同原理制备出两种AFB1电化学生物传感器。利用多种材料表征手段包括扫描电镜、透射电镜、X射线衍射、X-光电子能谱揭示电化学生物传感器结构;通过电化学阻抗法、循环伏安法、示差脉冲伏安法和恒电位计时电流法测试评价传感器性能。本文设计的两种电化学生物传感器具有低检出限（LOD）、高稳定性、强特异性和抗干扰性等优势,同时两者的检测范围广、重复性好,在实际样品的检测中具备可行性。论文主要内容包括:（1）基于层层（LbL）自组装技术制备的电化学生物传感器。利用LbL自组装技术将表面修饰的GN和羧基化聚苯乙烯纳米球（PS-COOH）交替沉积在玻碳电极上。PS-COOH与GN形成的夹心结构,具有协同增效作用,所制备的电极结合了GN的高比表面积和PS-COOH良好的生物相容性等优势,具有优异的电化学性能。活化后的羧基与适配体（Apt）进行偶联,用乙醇胺钝化游离的琥珀酰亚胺基团,利用牛血清白蛋白（BSA）钝化非特异性活性位点后,传感器与AFB1孵育一段时间,即可在K3[Fe（CN）6]中检测到电化学特征信号。对主要实验参数包括PDDA浓度、静电吸附时间、自组装层数、孵育时间等参数进行了系统优化。优化后的传感器性能测试结果:AFB1检测浓度范围为0.001～0.10 ng mL-1;LOD为0.002 ng mL-1;4℃密封储存30天后,回收率下降不超过10%;在食用油和酱油中的加标回收率为94.5～103.3%,且传感器不受赭曲霉毒素（OTA）和其他干扰物质的影响。（2）辣根过氧化物酶（HRP）作为信号放大探针结合自支撑电极（SSE）的电化学生物传感器。以SSE作为传感器的基底材料,其具备稳定的多孔隙空间三维结构和丰富的碳纳米管活性位点不仅降低了传感器的LOD,而且还提高了其稳定性;同时利用PS-COOH作为载体固定信号放大探针HRP,可以放大电化学信号,从而提高传感器的灵敏度。以草酸镍铜为催化剂前驱体、甲烷为碳源,生成了碳纳米管/碳纤维SSE,通过Au置换SSE上的NiCu颗粒,提高电化学性能。随后将Apt与Au结合,经过BSA钝化后,电极上的Apt能够与AFB1进行特异性结合。而多余的Apt下一步继续与PS-COOH结合,PS-COOH上游离的羧基通过酰胺键与HRP结合,从而将HRP固定在电极上。通过HRP催化电解液中H2O2的氧化还原反应,显著放大了传感器的电化学信号。对上述制备过程中主要实验参数包括Apt浓度、PS-COOH浓度、HRP浓度、以及H2O2浓度进行了系统优化。优化后的传感器性能测试结果为:AFB1检测浓度范围为0.1～10 pg mL-1和1～10ng mL-1,LOD分别为0.016 pg mL-1和0.3 ng mL-1;4℃密封储存四周后,回收率下降10.4%;不受OTA和其他干扰物质的影响;在葡萄酒和酱油中的加标回收率为87.53～106.71%。

关键词： 全基因组CRISPR-Cas9筛选   芳香烃受体   黄曲霉毒素B1   爱泼斯坦-巴尔病毒   鼻咽癌   DNA整合  

摘要： 研究背景:肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是主要起源于肝脏上皮细胞的恶性肿瘤,居世界肿瘤发病率和死亡率的第五和第二位,是我国第四位常见的恶性肿瘤。目前,已经确定的肝癌危险因素包括乙型(Hepatitis B virus,HBV)和丙型(Hepatitis C virus,HCV)肝炎病毒的慢性感染,以及饮食中黄曲霉毒素(Aflatoxin)暴露是肝癌的主要病因之一。黄曲霉毒素相关肝癌是我国肝癌患者区别于国外发病患者的一个显著类型,黄曲霉毒素被人体摄取后,进入肝细胞引起细胞发生恶性转化继而诱发肝癌的进程和结局各有不同,因此探寻肝细胞内与黄曲霉毒素代谢和毒性相关的关键分子,寻找黄曲霉毒素的潜在受体,阐述影响黄曲霉毒素代谢的调控机制并发现筛查黄曲霉肝癌易感靶点迫在眉睫。研究目的:(1)明确肝癌细胞内黄曲霉毒素B1(Aflatoxin B1)的结合分子,揭示AFB1进入肝癌细胞后的关键步骤;(2)明确AFB1对下游代谢通路的调控作用,进一步阐明AFB1诱导肝癌发生的分子机制;(3)预测AFB1与关键抗性分子的作用机制;(4)明确黄曲霉相关肝癌(AF-HCC)免疫治疗靶点的可行性。研究方法:本研究基于全基因组CRISPR-Cas9高通量筛选技术,将AFB1作用于肝癌细胞系PLC/PRF/5,经过6轮AFB1的诱导后,收集存活的肝癌细胞,通过二代测序鉴定出能够抵抗AFB1持续诱导的关键基因。利用非靶向代谢组学检测AFB1对AHR敲降前后肝癌细胞代谢物质的丰度变化。通过大肠杆菌体系纯化出AHR蛋白分子的N端和C端蛋白,利用核磁饱和转移差谱技术(STD)确定AFB1与AHR蛋白的结合能力。通过分子对接预测AFB1与AHR的结合位点,检测关键结合位点的AHR突变体蛋白与AFB1的结合力。收集江苏启东地区黄曲霉相关肝癌患者标本,检测AHR表达水平与PD-L1表达的关系。体内实验验证PD-L1抑制剂对AHR高表达肝癌的治疗效果。研究结果:全基因组CRISPR-Cas9高通量筛选发现AHR敲降的肝癌细胞系可以耐受高浓度的AFB1。AFB1可以增加肝癌坏死过程中长链脂肪酸的积累,且AHR是调控长链脂肪酸代谢的关键因子。AFB1可以激活AHR的表达,并且促进AHR蛋白入核过程,与ARNT形成二聚体,调控下游P450代谢通路相关基因的表达。AHR蛋白的N端可以与AFB1直接结合,第208位的异亮氨酸是调控两者结合能力的关系位点。AHR的缺失可以显著降低肝癌细胞内黄曲霉加合物的形成,减少AFB1对肝细胞的损伤,且AHR的高表达会促进肝癌细胞PD-L1表达,使黄曲霉相关肝癌对免疫治疗更加敏感。结论:本课题通过全基因组CRISPR-Cas9高通量筛选和多种分子生物学实验阐明了 AHR是AFB1潜在的胞内代谢性穿梭受体,其在AFB1代谢和毒素诱导的肝癌中起重要作用,可以作为黄曲霉相关肝癌的候选治疗靶标。AHR的激活可以诱导PD-L1的表达,使黄曲霉相关肝癌对免疫治疗更加敏感。研究背景:爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)与多种恶性肿瘤有关,EBV的持续感染会导致多种恶性肿瘤,包括伯基特淋巴瘤,霍奇金淋巴瘤,鼻咽癌,胃癌等。EBV病毒致癌蛋白的表达和慢性炎症的发生是导致肿瘤发生发展的主要机制,但是目前针对EBV整合到人类基因组中破坏基因表达或基因组稳定性的系统系研究仍然较少。研究目的:我们的工作为多种恶性肿瘤的EBV整合图谱提供了大规模的全基因组分析。我们比较了不同肿瘤中EBV整合位点之间的差异,并且探讨了 EBV整合对基因表达的影响,试图阐明EBV整合与肿瘤发生和发展之间的联系。研究方法:我们收集了多个肿瘤的冷冻组织标本,包括NPC(n=177;中山大学肿瘤防治中心和广西医科大学附属第一医院);胃癌(n=39;中山大学肿瘤防治中心和青岛大学附属医院);NK/T细胞淋巴瘤(n=25;中山大学癌症中心和瑞金医院);霍奇金淋巴瘤(n=11;中山大学癌症中心);鼻咽炎(n=1;中山大学癌症中心)。从这些肿瘤组织中分离基因组DNA,使用靶向EBV的单链DNA探针对基因组DNA进行杂交捕获,并使用生物信息学方法分析全基因组范围内EBV整合位点特征和整合数量差异。同时,我们检测了 EBV常见整合位点附近的基因表达变化,并通过免疫组织化学验证了热点基因与EBV之间的关系。研究结果:我们从33个肿瘤和C666-1细胞系中共鉴定出197个EBV整合位点,其中EBV在胃癌的整合率(25.6%)高于鼻咽癌的整合率(9.6%)。我们发现多个EBV整合位点位于调节TNF-α,NF-κB信号通路的肿瘤抑制基因和炎症相关基因的附近。此外,在EBV基因组中,这些断点经常位于oriP或末端重复序列。这些断点常被微同源序列包围,这与涉及病毒基因组复制和微同源介导的重组的整合

关键词： AFB1   核壳纳米复合材料   复合酶制剂   新型生物解毒剂   协同脱毒  

摘要： 黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1,AFB1）在真菌毒素类中毒性最强,如何快速安全的将其脱除是当前研究的难点。本论文以吸附法和降解法研究了其对AFB1脱毒的效果,首先研究了多种多孔吸附材料在脱毒上的差异,选择脱毒效果最佳的核壳复合材料ZIF-8-MSN-NH2作为吸附剂首选材料。然后通过对比漆酶、黑曲霉粗酶以及复合酶制剂对AFB1的脱毒效果,确定生物法降解AFB1的最佳酶组合。最后设计出一种以降解法和吸附法协同作用的具有核壳结构的新型生物解毒剂。该新型生物解毒剂选择具有最佳脱毒效果的吸附材料与复合酶制剂结合,利用材料的吸附与酶的降解实现AFB1的高效脱除。相对于单一的多孔材料的吸附与复合酶制剂的降解,新型生物解毒剂这种吸附与降解协同的脱毒方法能够在一定程度上避免吸附容量的限制,以及酶难以回收再利用等问题。具体的研究内容与结果如下:（1）ZIF-8-MSN-NH2复合材料呈现出最佳的吸附效果,对AFB1的吸附容量能够达到7.40 mg/g,并且能够在90 min实现AFB1的快速的脱毒。同时,这种核壳纳米复合材料具有较好的重复使用性,在5次之后对黄曲霉毒素B1仍有64.57%的吸附效果。ZIF-8-MSN-NH2复合材料的脱毒效果主要依赖于材料的吸附作用。（2）复合酶制剂表现出最佳的降解效果,在最佳酶配比（漆酶:黑曲霉粗酶=4:2）条件下能够在24 h内降解64.54%的AFB1毒素。复合酶制剂对AFB1的降解率高达67.45%,比黑曲霉粗酶的降解率提高了65.78%。比漆酶的AFB1降解率提高了19.24%。复合酶制剂在温度为35℃的条件下具有最高的64.50%的黄曲霉毒素脱毒率。两种酶对AFB1的降解位点不同。（3）新型生物解毒剂对AFB1具有优异的脱毒效果,其脱毒后产物的分子式为C15H14O2。新型生物解毒剂是通过作用于AFB1的C-O键实现降解目的。新型生物解毒剂在脱毒过程中存在吸附与降解两种脱毒方式。新型生物解毒剂的脱毒效果优异于ZIF-8-MSN-NH2和复合酶制剂。通过对比灭活前后的新型生物解毒剂脱毒效果的差异,证实新型生物解毒剂高效脱毒的主要原因是ZIF-8-MSN-NH2材料的吸附优越性与复合酶制剂的联合降解。新型生物解毒剂中ZIF-8外壳充当AFB1的吸附剂,提高复合酶制剂周围局部毒素浓度,内部的两种生物酶可以发挥复合降解作用。其次,这种特殊的核壳结构有利于解毒剂在使用过程中的稳定性。结果表明,新型生物解毒剂在35℃、36 h能够脱除98.07%的AFB1标准品。在30℃下,新型生物解毒剂在24 h仍能够降解83.76%的AFB1。因此结合实际粮食的储藏条件,选择30℃作为脱毒温度。新型生物解毒剂在实际发霉玉米中的脱毒率能达75.75%。新型生物解毒剂中漆酶和黑曲霉粗酶的总固定化效率（E）为89.55%。通过动力学模型研究发现,新型生物解毒剂的米氏常数（Km）值为5.5×10-5mol/L,较于游离复合酶有所增加。新型生物解毒剂在4℃条件下储存30天,酶活力仍保留为初始酶活力的70.85%。新型生物解毒剂在4次实验后酶的活性保留为80.73%。在4次实验脱毒后对AFB1的脱毒率仍高达87.86%,具有较高的实际应用价值。

关键词： 中药固体制剂   辅料   吸湿行为   防潮工艺   吸湿等温曲线下面积  

摘要： 目的:测定28种常用固体制剂辅料的吸湿行为,优选复方板蓝根利咽颗粒、小儿补肾固表颗粒、平脂胶囊3种中药制剂的防潮辅料及制粒工艺路线,比较干法、挤出、流化3种制粒工艺对中药浸膏颗粒粉体学性质的影响,为中药固体制剂防潮工艺提供依据。方法:1.以静态吸附称重法测定28种44个辅料、3种制剂的28个含辅料浸膏粉、3种制粒工艺的21个制剂颗粒在25℃（下同）6.0%～100.0%RH下0、24、48、72、96、120 h的含水率,每隔24 h计算平均吸湿速率,其不超过0.3 mg·g-1·h-1时为吸湿平衡;以相关系数（R2）、残差平方和（RSS）、赤池信息准则（AIC）为指标,用origin Pro8.0软件,拟合样品68.9%RH下120 h的吸湿动力学曲线和6.0%～100.0%RH下120 h的吸湿等温曲线的数学模型。2.以6.0%～81.0%RH之间120 h吸湿等温曲线下面积（AUHIC）评价样品吸湿性;分别对6.0%～100.0%RH下120 h吸湿等温曲线两侧作直线拟合,以两直线交点横坐标为临界相对湿度（CRH）;以《中国药典》辅料、颗粒剂、胶囊剂水分限度预测其限度相对湿度（LRH）。3.参考《中国药典》相应方法,测定21个制剂颗粒的粒度分布、比表面积、孔体积、孔半径、休止角、堆密度等粉体学性质参数。结果:1.44个辅料、28个含辅料浸膏粉、21个制剂颗粒:初始含水率分别为0.07%～13.16%、0.74%～2.60%、1.44%～4.48%;6.0%～100.0%RH下120 h含水率分别为0.00%～54.42%、0.15%～47.52%、0.58%～48.36%。2.在6.0%～81.0%RH120 h内,除聚维酮K30外其余43个辅料吸湿平衡;除干法、挤出、流化小儿蔗糖颗粒和流化平脂羟丙甲纤维素E6颗粒外,其余17个制剂颗粒吸湿平衡。在100.0%RH120 h内18个辅料吸湿平衡,其余26个辅料吸湿未平衡。所有21个制剂颗粒在92.5%RH和100.0%RH 120 h内吸湿未平衡。3.68.9%RH下120 h的吸湿动力学曲线最优模型:44个辅料为SWeibull2（16个）、SWeibull1（12个）、一级过程（9个）、双指数（4个）、一元二次曲线（3个）;28个含辅料浸膏粉为SWeibull2（16个）、双指数（9个）、SWeibull1（3个）;21个制剂颗粒为SWeibull2（11个）、双指数（6个）、SWeibull1（4个）;所有样品的常见模型均是威布尔分布。所有样品在6.0%～100.0%RH下120 h的吸湿等温曲线最优模型均为Peleg方程。4.以AUHIC优选防潮制粒工艺路线分别为:复方板蓝根利咽颗粒和小儿补肾固表颗粒均为以乳糖为辅料的流化床或干法制粒,平脂胶囊为以山嵛酸甘油酯为辅料的干法或挤出制粒,或以无水磷酸氢钙为辅料的干法制粒。5.44个辅料和21个制剂颗粒的LRH分别为1.6%～100.0%和40.2%～68.9%。6.32个辅料的CRH为40.6%RH～94.4%RH,12个辅料无CRH。复方板蓝根利咽颗粒、小儿补肾固表颗粒、平脂胶囊的含辅料浸膏粉的CRH分别为65.8%～68.8%、64.6%～68.7%、66.1%～68.7%;制得颗粒的CRH分别为69.7%～71.5%、65.2%～71.1%、65.5%～66.9%。7.3种制粒工艺对中药制剂颗粒AUHIC的降低率不同,分别为:挤出利咽糊精b颗粒7.06%、流化利咽乳糖b颗粒25.00%、干法小儿蔗糖颗粒11.47%、流化小儿乳糖b颗粒16.16%、流化平脂羟丙甲纤维素E6b颗粒6.11%、干法平脂无水磷酸氢钙b颗粒4.23%、干法平脂山嵛酸甘油酯b颗粒6.51%。可见3种制粒工艺对3种制剂颗粒吸湿性的影响不同,说明3种制剂颗粒吸湿性与浸膏粉和辅料的吸湿性及制粒工艺相关。8.3种制粒工艺所得21个颗粒的个数平均粒径（为90.0～381.5μm）从大到小排序为挤出>流化>干法,粒度跨度（为1.9～2.9）和堆密度(为0.29～0.74 g·m L-1)均为干法>挤出>流化,比表面积(为0.03～1.19 m2·g-1)和休止角（为26.28～40.41°）均为干法>流化>挤出,孔体积(为0.26～8.46μL·g-1)和孔半径（为8.79～60.91 nm）与制粒工艺的相关性不明显。结论:本文测定了辅料、含辅料浸膏粉、3种制粒工艺所得颗粒的吸湿行为,包括含水率变化规律、吸湿平衡时间、吸湿动力学曲线模型、吸湿等温曲线模型、AUHIC、LRH、CRH等,优选了3种制剂的防潮辅料及制粒工艺,为中药制剂防潮工艺研究提供参考。本文创建了AUHIC数字化表征和评价物料吸湿性的强弱。并根据吸湿等温曲线,以《中国药典》水分限度预测产

关键词： 黄曲霉毒素B1   白藜芦醇   AKT/PI3K信号通路   猪   颗粒细胞  

摘要： 本研究以体外培养的猪卵巢颗粒细胞(PGCs)作为研究对象,旨在了解白藜芦醇是否能够抵御AFB1对PGCs的毒害作用及其是否通过AKT/PI3K通路调控细胞增殖与凋亡。本实验分为四组,即空白组对照组、AFB1组、RES组、RES+AFB1组,并进行一系列检测实验,包括MTT检测细胞活力,荧光显微镜观察细胞形态变化及DAPI核染色变化情况,酶标仪检测细胞上清中葡萄糖浓度,试剂盒检测细胞活性氧(ROS)和膜电位变化情况,流式检测细胞凋亡率,qPCR检测凋亡基因(BAD/Bax/Bcl-2/XIAP/AIF)、Akt/PI3K通路及上下游关键基因(PI3K/Akt/PTEN/Fox O1/m TOR)等表达情况,Western Blot检测Akt/PI3K信号通路及下游相关分子的蛋白表达水平。取得结果如下:***法检测细胞活力结果显示8μM的RES浓度对细胞有最佳保护作用,0.7μM的AFB1浓度为最适攻毒浓度。2.显微镜观察细胞形态结果显示细胞经AFB1处理24h后,和空白组及RES组比较细胞形态明显发生变化,细胞间隙增大,大量细胞出现变圆死亡脱落现象,而RES干预AFB1组细胞和AFB1单独作用组比较,细胞收缩变圆现象有所缓解,并且形态相对较规整,可以明显看出RES对AFB1毒性有缓解作用。DAPI核染色也显示,AFB1组细胞核染色数量明显减少,且细胞核浓缩变小呈致密浓染,而RES+AFB1组较AFB1组可以明显看出,细胞核浓缩变小呈致密浓染的现象明显有所缓解。3.试剂盒检测细胞上清中葡萄糖浓度,并计算葡萄糖的消耗率,结果显示,与空白组和RES组相比,AFB1葡萄糖消耗率最低,而RES+AFB1组较AFB1组葡萄糖消耗率显著增加。4.活性氧(ROS)检测结果显示,与空白组和RES组相比,AFB1组细胞的活性氧水平显著升高,而RES+AFB1组较AFB1组,细胞的活性氧水平显著降低。细胞膜电位检测结果显示,与空白组和RES组相比,AFB1组细胞膜电位显著降低,而RES+AFB1组较AFB1组,细胞膜电位显著升高。*** V-FITC/PI流式分析检测,空白组、AFB1组、RES组、RES+AFB1组凋亡率分别为6.72%、38.78%、5.35%和15.82%,AFB1组细胞凋亡率最大,RES+AFB1组较AFB1组细胞凋亡率显著下降。***和Western blot分析检测结果显示,RES可以影响Akt/PI3K信号通路上的相关基因来抑制AFB1诱导的细胞凋亡。通过以上结果可以看出,黄曲霉毒素B1可以引起猪卵巢颗粒细胞凋亡并且呈浓度相关性变化,而白藜芦醇则可以有效地缓解AFB1致PGCs的毒性作用;并且低浓度的RES对PGCs有增殖作用。同时,qPCR和Western blot分析检测结果显示,RES可以影响Akt/PI3K信号通路上的相关基因来抑制AFB1诱导的细胞凋亡。