关键词： 在线开放课程   中药制剂技术   内容选取   建设实践  

摘要： 随着教育改革的不断推进,各类先进的教育教学方式被应用到专业教学中,极大地提高了教学效率。笔者在高职中药专业中药制剂技术课程教学过程中,通过应用在线开放式教学模式,利用学习通这个教学网络平台,搭建了教师与学生、学生和学生之间沟通交流的桥梁,有效提高了开放教学的实效性。本文结合笔者的实际教学工作经验,分析了高职院校中药制剂技术在线开放课程的具体特点,探究了精品在线开放课程的具体建设策略。

关键词： 黄曲霉毒素B1   呕吐毒素   酶制剂   柠檬酸   毒素降解  

摘要： 近年来,我国在真菌毒素快速检测、储粮真菌及毒素早期监测预警、储粮真菌及毒素抑制及去除等方面取得了较大的进展。但是,有关真菌毒素在食品加工过程中转化规律的研究仍处于起步阶段,其中很重要的原因可能在于食品加工过程以及食品组分的复杂性。本研究选择了面食制品中常用的酶制剂、柠檬酸为食品单组分的研究对象,开展其对谷物粮食中常见的污染物黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1,AFB1）和呕吐毒素（Deoxynivalenol,DON）的转化、降解影响研究,以期为食品加工过程的合理化使用以及真菌毒素的降解方法提供初步的理论指导,本研究取得的主要进展分述如下:1)发现面食加工常用的四种酶制剂对AFB1存在降解效应,其中α-淀粉酶（5000 U）、木聚糖酶（2500 U）、半纤维素酶（1000 U）、葡萄糖氧化酶（0.24 U）对AFB1的降解率分别为:20.93±14.94%、70.12±4.39%、2.47±5.8%、48.09±2.48%。同样地,上述四种酶在中筋面粉、高筋面粉、低筋面粉基质下均可对DON产生降解效应,其中半纤维素酶（2500 U）在低筋面粉基质条件下对DON的降解率最高,达到64.78±1.26%,半纤维素酶（2500 U）在中筋面粉基质条件下对DON的降解率也接近60%,提示半纤维素酶、木聚糖酶可能是一种优良的可用于降解DON、AFB1的酶。通过UPLC-Q-TOF/MS检测方法对DON降解产物进行了初步定性分析,但是,由于面粉、酶基质复杂,在总离子流图中未能有效地鉴别出DON降解产物的离子图,后续还需对该工作进行深入的研究。2)本研究证实柠檬酸与碘的混合液对AFB1可起到降解作用,并产生三种新的产物,分别为P1（m/z=329.06）、P2（m/z=456.97）和衍生化AFB1（m/z=347.07）。碘的处理对于柠檬酸降解AFB1起到了至关重要的作用。通过AB Sciex公司的质谱数据分析软件Peak View计算分析,我们推测出P1（m/z=329.06）的可能分子式为C17H13O7,P2（m/z=456.97）的可能分子式为C17H14IO7,衍生化AFB1（m/z=347.07）的可能分子式为C17H15O8。推测碘将AFB1衍生化为m/z=347.07后,在柠檬酸的参与下衍生化的AFB1（m/z=347.07）脱氢后成为P1（m/z=329.06）,同时衍生化的AFB1（m/z=347.07）中的一个羟基被碘取代,形成P2（m/z=456.97）。

关键词： 黄曲霉菌   黄曲霉毒素   RPA   CRISPR-Cas14a   快速检测  

摘要： 黄曲霉毒素(aflatoxins,AFs)是由黄曲霉菌(***)等真菌产生的具有强毒性和强致癌性的次级代谢产物。AFs分布广泛,是粮食及其制品中常见的污染物,给食品安全带来了极大的威胁。因此,尽早检测出被***和AFs污染的食品,对于监测预警、防控和降低AFs的危害具有积极意义。但传统的***和AFs的检测方法均存在操作复杂、技术和设备要求较高等不足,不能满足快速检测的需要。为更好的控制AFs污染,本文研究建立了食品中***和黄曲霉毒素B(aflatoxin B,AFB)的快速检测方法。主要研究内容及结果如下:1、建立了粮食中***的荧光定量PCR检测方法。针对***的转录间隔区(Internal transcribed spacer,ITS)保守序列、毒素合成关键基因afl R、afl D、afl P分别设计三对引物,通过实验筛选出扩增效果最好的ITSⅠ引物用于荧光定量PCR检测。评估了该方法的特异性和灵敏度,结果显示其具有较高的特异性,可检测出绝大部分的***,而对其它菌株不产生扩增信号。其检测限为10 conidia/g样品,与已报道的使用FLAQ引物的方法相同,可作为日常检测的新选择。2、建立了基于重组酶聚合酶等温扩增技术(Recombinase Polymerase Amplification,RPA)的现场化快速检测***的检测体系。建立了通过洗涤、抽滤、研磨快速提取粮食中*** DNA的方法,使用0.5 M氢氧化钠(Na OH)作为研磨缓冲液,并设计制作了相应的简易工具,可在10 min内完成DNA的富集提取。设计了RPA引物并对RPA扩增体系进行了优化,使得RPA在37℃下10 min即可完成。同时选择了Celfinder核酸染料对扩增产物进行可视化检测。所建立的RPA检测体系可实现在30 min内对粮食中***污染的高灵敏度检测,其灵敏度可达10 conidia/g样品,其实际应用情况也得到了验证。且整个检测过程不需要大型仪器设备,只需一些便携的工具即可完成,非常适合基层等实验条件不足的单位开展粮食***污染情况的筛查,对于监测预警和控制***污染在粮食中传播,降低AFs对人类的危害具有积极地意义。3、探索设计并建立了一种用于检测AFB的基于CRISPR-Cas14a的适配体传感器模型。首先,成功建立并优化了基于CRISPR-Cas14a系统的单链DNA(single-stranded DNA,ss DNA)检测体系,该体系可在短时间内实现对ss DNA的高灵敏度检测,检测限低至0.5 n M,进一步证明了CRISPR-Cas14a系统在ss DNA检测方面的可行性。其次,探究了该检测模型的可行性,经研究该传感器在AFB存在时可产生信号响应,虽然经过初步优化,该适配体传感器灵敏度仍较低,在实际样品的检测中只能用于AFB含量在100 ng/m L以上的样品检测,还不具有实际应用价值。但该检测模型首次将CRISPR-Cas14a系统与适配体相结合,将CRISPR的检测范围由核酸靶标拓展为小分子物质靶标,对新检测方法的开发具有积极意义。同时,目前正在通过对适配体及其互补序列的优化来提高其检测灵敏度。

关键词： ALV   三重PCR   分离鉴定   中药提取物  

摘要： 禽白血病（Avian leukosis,AL）是禽类感染禽白血病病毒（Avian leukosis viruses,ALV）造成的一种接触性、传染性、肿瘤性的病毒病,以淋巴细胞性白血病、髓细胞性白血病、结缔组织性肿瘤等为主要临床特征,严重阻碍了养禽业的健康发展,该病也成为危害禽类的重要传染病之一。ALV的检测方法较多,但能在短时间内鉴别不同亚群的方法较少;此外,ALV亚群多,鸡对ALV抗原成分的免疫反应较差,目前还没有有效的疫苗和特效治疗药物,筛选出具有抗肿瘤中药对防控ALV有一定的意义。因此,本研究拟建立可同时检测A/B/J三个亚群的多重PCR方法;分离鉴定ALV毒株,以了解ALV在贵州的流行趋势;以分离的ALV毒株为研究对象,探究四种中药提取物对其复制的影响,以筛选出具有抗ALV的药物。主要内容如下: 1.禽白血病病毒A/B/J亚群三重PCR检测方法的建立及初步应用 试验根据Gen Bank数据库中登录的ALV-A、ALV-B和ALV-J原型株基因组gp85基因的核苷酸序列利用Primer Premier 7.0软件,分别设计了3对特异性引物,建立了一种能同时检测3个亚群的三重PCR方法,对该方法的特异性、敏感性和重复性进行检验,并进行了临床初步试验。结果显示,该方法对携带有不同亚群ALV gp85基因序列的质粒有特异性扩增,而对传染性法氏囊病病毒、马立克病病毒、禽腺病毒、禽流感病毒和新城疫病毒的核酸均无特异性扩增,说明本研究建立的三重PCR具有较强的特异性;对携带有不同亚群ALV gp85基因序列的质粒的最低检测量分别为11.7 pg、1.17 pg、11.7 fg,说明本研究建立的三重PCR具有较高的敏感性;该方法对携带有不同亚群ALV gp85序列的质粒模板均能扩增出与预期大小一致的目的条带,说明本研究建立的三重PCR重复性较好;临床初步应用结果显示,三重PCR方法对2份ALV-A样本的检出率为100%,对18份为ALV-J样本的检出率为88.9%,说明本研究建立的三重PCR具有一定的临床适用性。本试验建立的三重PCR方法具有操作简单、成本低廉、特异性高、稳定性好的优点,可为临床上快速鉴别A、B、J亚群ALV提供重要的技术支持。 ***毒株分离鉴定、全基因组测序及生物信息学分析 试验将PCR检测为ALV阳性的16份病料制备成病毒悬液分别接种至DF-1细胞培养7 d并盲传一代,使用p27群特异性抗原ELISA试剂盒检测,分离鉴定出3株J亚群ALV毒株,分别命名为GZ20CS-1株、GZ20CS-2株和GZ20LPS株,并对其进行了全基因组扩增、克隆、测序和生物信息学分析。结果显示,3株分离毒株全基因组核苷酸序列分别长为7 795 bp、7 718 bp和7 776 bp;3株分离毒株的TCID50分别为10-1.67/0.2 m L、10-3.25/0.2 m L、10-1.67/0.2 m L;全基因组核苷酸序列同源性分析结果显示3株分离毒株的核苷酸序列同源性在96.5%～99.6%之间,与不同亚群ALV参考毒株的核苷酸序列同源性在82.2%～94.6%之间,与J亚群ALV的核苷酸同源性比其他亚群高,在93.0%～94.6%之间,证明3株分离毒株均为J亚群ALV毒株,遗传进化树结果显示分离毒株与ALV-J亚型在同一分支;env基因核苷酸序列同源性分析和遗传进化树构建结果与全基因组比对结果一致;env基因编码氨基酸突变位点分析结果显示:GZ20LPS株有14处突变,GZ20CS-1和GZ20CS-2株有12处突变,3株ALV分离毒株的突变位点主要集中在hr1区、hr2区。 3.不同中药提取物对ALV复制作用的影响 试验以分离的ALV-J GZ20CS-2株为研究对象,以CCK-8法测定黄芪多糖、苦参碱、黄连素和茶多酚四种待试中药提取物对DF-1细胞的最大安全浓度,将配制成100TCID50的病毒液与最大安全浓度的待试中药分为预防组、治疗组和综合组接种至DF-1细胞,提取细胞组RNA转录为c DNA,以ALV gp37为特异性引物进行q PCR扩增,从基因水平探索中药对ALV复制作用的影响;分别于ALV感染后的第3 d和第5 d收集细胞样品,采用Western Blot方法从蛋白水探索中药对ALV复制作用的影响。结果（1）最大安全浓度结果显示,黄芪多糖、苦参碱、黄连素和茶多酚四种中药的最大安全浓度分别为10 mg/m L、400μg/m L、80μg/m L和2 mg/m L;（2）基因水平表达结果显示:黄芪多糖可明显下调ALV-J GZ20CS-2株gp37基因的表达,茶多酚、苦参碱和黄连素也具有一定的下调作用,但效果不如黄芪多糖明显,总体来说治疗组效果较好;（3）蛋白水平表达结果显示:黄芪多糖能明显抑制ALV-J

关键词： 肝细胞癌   蛋白质磷酸酶2A   过氧化氢   黄曲霉毒素B1   人肝癌细胞  

摘要： 目的:探讨蛋白磷酸酶2A催化亚基c（PP2Ac）蛋白在人肝细胞癌（HCC）组织中的表达;探讨急慢性氧化应激条件下肝癌细胞中蛋白磷酸酶2A催化亚基（PP2Ac）对肝癌细胞Huh-7和SMMC-7721增殖的影响及其相关调控蛋白的表达水平。 方法:1.共选取广西医科大学附属肿瘤医院2017年7月至2019年7月期间75例患者术后病理诊断为HCC的新鲜肿瘤标本。采用免疫组化实验测定PP2Ac在肝细胞癌组织和癌旁组织的表达情况。2.选取不同浓度的H2O2（0、50、100、200、400、800μmol/L）与人肝癌细胞（Huh-7细胞和SMMC-7721细胞）共培养2h、4h、6h和8h后,选取不同浓度的AFB1（0、1.25、2.5、5、10、20、40μmol/L）与人肝癌细胞（Huh-7细胞和SMMC-7721细胞）共培养24h、48 h和72h后,采用显微镜观察细胞形态变化;CCK-8法检测细胞增殖活性,采用Western Blot实验检测去甲基化PP2Ac（Dem-PP2Ac）蛋白、甲基化PP2Ac（Me-PP2Ac）蛋白和PP2Ac蛋白及其调控蛋白亮氨酸甲基转移酶1（LCMT-1）、蛋白磷酸酶甲基酯酶（PPME-1）的表达情况。 结果:1.免疫组化结果显示PP2Ac在人HCC组织中以高表达为主,并且主要表达部位位于细胞质。 2.在不同浓度H2O2急性刺激的条件下,100μmol/L及以上浓度的过氧化氢作用的Huh-7和SMMC-7721细胞活性逐渐降低,与对照组相比差异有统计学意义（P<0.050）。在200μmol/L H2O2与人肝癌细胞共培养2h后成功构建急性肝癌细胞损伤模型。 3.在不同浓度AFB1慢性刺激的条件,2.5μmol/L及以上浓度细胞活性逐渐降低,与对照组相比差异有统计学意义（P<0.05）。在10μmol/L、5μmol/L AFB1与人肝癌细胞共培养24h后成功构建慢性肝癌细胞损伤模型。 4.用200μmol/L H2O2分别刺激Huh-7细胞,SMMC-7721细胞2h后PP2Ac、Dem-PP2Ac和PPME-1蛋白表达水平与对照组相比升高,LCMT-1、Me-PP2Ac蛋白表达水平与对照组相比表达降低,与对照组相比差异有统计学意义（P<0.05）。 5.用10μmol/L AFB1刺激Huh-7细胞24h后,PP2Ac、Dem-PP2Ac和PPME-1蛋白表达水平与对照组相比升高,LCMT-1、Me-PP2Ac蛋白表达水平与对照组相比降低,与对照组相比差异有统计学意义（P<0.05）;用5μmol/L AFB1刺激SMMC-7721细胞24h后PP2Ac、Dem-PP2Ac和PPME-1蛋白表达水平与对照组相比升高,LCMT-1、Me-PP2Ac蛋白表达水平与对照组相比降低,与对照组相比差异有统计学意义（P<0.05）。 结论:1.在75例人肝细胞癌标本的癌组织与癌旁组织中,PP2Ac蛋白在人HCC组织中以高表达为主,并且主要表达在细胞质。 2.H2O2和AFB1均对人肝癌细胞（Huh-7、SMMC-7721）的杀伤具有明显的时间和浓度依赖性。在200μmol/L H2O2与人肝癌细胞（Huh-7、SMMC-7721）共培养2h后成功构建急性肝癌细胞损伤模型。在10μmol/L、5μmol/L AFB1分别与人肝癌细胞Huh-7、SMMC-7721细胞共培养24h后成功构建慢性肝癌细胞损伤模型。 3.在H2O2和AFB1分别刺激人肝癌细胞（Huh-7、SMMC-7721）的急慢性氧化应激模型中,PP2Ac蛋白、去甲基化PP2Ac蛋白和PPME-1蛋白高表达;LCMT1蛋白、甲基化PP2Ac蛋白表达降低;提示LCMT-1、PPME-1可能与PP2Ac的甲基化调控有关。

关键词： 林蛙   嗜水气单胞菌   中药   五倍子   红花  

摘要： 林蛙（Rana dybowskii）作为一种经济的养殖动物,主要集中在我国北方地区养殖。近年来,随着人们生活需求量的大幅提升,林蛙的集约化养殖迅速发展、养殖面积迅速扩大,其相关病害也频繁爆发,尤其是日益增长的细菌性疾病,已经对林蛙养殖业的长期稳定发展造成了巨大影响。其中,嗜水气单胞菌作为一种常见的水产养殖业致病菌,严重危害水产养殖业的同时,对两栖动物也具有较强的致病性。针对其防治措施主要集中在抗生素的投喂,极易造成耐药菌株的产生以及抗生素的体内残留。新型免疫增强剂可有效提高机体免疫力,缓解细菌性疾病的发生发展。因此,开发新型免疫增强剂将作为替代抗生素的一种有效途径表现出可观的发展前景。本研究收集养殖场患病林蛙,分离患病组织部位病原菌,并进行溶血活性,致病性,生理生化,药敏,生长特性,半数致死量,毒力基因携带以及分子鉴定等试验,初步探究致病菌特性。通过分离培养,从患病林蛙体内成功分离得到三株具有致病力的病原菌,其中变形杆菌提示养殖环境和饵料质量存在问题。致病性以及药敏试验显示嗜水气单胞菌（R5）存在较强的致病力,较ATCC 7966较低,对环丙沙星、卡那霉素和氯霉素等药物敏感。该菌株的生长速度较ATCC 7966略快;且携带act、exu、Ser、Lip、aha和Luxs六种毒力基因。为开发预防此种细菌性病害的新型免疫性增强剂,以第一章分离得到的嗜水气单胞菌作为试验菌株,通过体外抑菌试验,中药MIC和MBC,中药抑制R5生物被膜形成能力试验,筛选能够有效抑制该菌的中药提取物;并通过混合饲料对林蛙饲喂56d,于第0d,14d,28d,42d和56d随机选取3只林蛙采集血清以及心、肝以及脾测定相关免疫指标。通过腹腔注射R5悬液评估中药的保护作用。体外抑菌试验结果显示,五倍子和红花均能显著抑制R5生长,且五倍子的MIC和MBC分别为0.05g/m L和0.1g/m L,红花的MIC和MBC分别为0.1g/m L和0.15g/m L,显著优于其他中药。通过ELISA检测血清中的AKP、SOD和LZM,结果表明,五倍子能够显著提高血清AKP、SOD和LZM水平,红花能够显著提高血清中AKP和SOD水平。q PCR检测结果显示,五倍子和红花能够上调心脏、肝脏和脾脏中IL-10、IL-1β、TNF-α和IFN-γ等细胞因子的表达水平,提高宿主的免疫力。腹腔急性攻毒检测结果显示,五倍子和红花能够缓解***对***的侵袭,表明该两味中药具有一定的保护作用。综上所述,本试验从患病林蛙中成功分离到变形杆菌、希瓦氏菌和嗜水气单胞菌（R5）,且R5对林蛙具有较强的致病力。此外,五倍子和红花能够显著抑制R5生长和生物被膜的形成。通过混合饵料口服饲喂能显著提高林蛙的免疫反应,提高各类酶活以及促炎因子表达水平,显著降低了感染嗜水气单胞菌后林蛙的死亡率。研究成果为进一步开发新型免疫增强剂鉴定一定的理论基础。

关键词： 烤烟   中药复配剂   产质量   土壤酶   病虫害  

摘要： 为有效解决江西抚州烟区长期连作导致的连作障碍问题,优化连作土壤环境,提高烟叶产质量,本研究以“云烟87”为试验材料,通过大田试验,研究中药提取物复配物料对连作烤烟和植烟土壤的影响,试验结果如下:1、中药复配土壤改良剂对植烟土壤及烤烟产质量的影响。采用大田试验方法,将中药复配土壤改良剂与基肥一起在移栽前施入土里,依据中药复配土壤改良剂施用量的不同,共设4个处理:T1(常规化肥)、T2(常规化肥+20kg/亩中药复配土壤改良剂)、T3(常规化肥+25kg/亩中药复配土壤改良剂)、T4(常规化肥+30kg/亩中药复配土壤改良剂)。结果表明,中药复配土壤改良剂能调节土壤p H值,有效提高氮磷钾及土壤有机质的含量和土壤脲酶、蔗糖酶、酸性磷酸酶和过氧化氢酶活性,表明与常规化肥相比,增施中药复配土壤改良剂能够提高土壤酶活性,改善土壤环境,提高土壤肥力。另外,增施中药复配土壤改良剂能够提高烤烟的株高和叶面积,对叶绿素、光合作用指标也有一定的促进作用,可在一定程度提高烤烟抗赤星病和蚜虫的能力,在经济性状方面增施中药复配土壤改良剂的处理均优于T1对照,且能够降低烟叶的烟碱含量,使其达到优质烟的范围内,在化学成分协调性中,增施中药复配土壤改良剂效果优于单施常规肥料处理,以T4(常规化肥+30kg/亩中药复配土壤改良剂)效果最好,中药复配土壤改良剂对烤烟上部叶和中部叶中性香气物质总量有一定的促进作用,以T4处理效果最佳,较对照分别增加了33.79%和31.57%,能够提高烟叶微量元素的含量,使其达到适宜范围内。2、中药复配剂对烤烟生长及产质量的影响。采用大田试验方法,在常规农药防治病虫害的基础上依据中药复配剂使用次数的不同,共设5个处理:T1(对照,常规农药防治)、T2、T3、T4、T5(在T1的基础上分别于栽后15、30天,15、30、45天,15、30、45、60天,15、30、45、60、75天各喷1次中药复配剂)。结果表明,喷施中药复配剂的各个处理在农艺性状和光合作用指标等方面都有一定的促进作用,以T5处理效果最佳;对赤星病的防治有明显的效果,以T5处理病指最低,防效最好,同时能够降低烤烟的有蚜株率和蚜量指数;喷施中药复配剂的各个处理其产量、产值均高于对照,以T5处理最高,分别比对照提高了41.46%和46.62%;喷施中药复配剂各个处理的化学成分与对照差异不明显;中药复配剂能够增加烤烟上部叶和中部叶中性香气物质总量,较对照分别增加了13.39%和20.27%,同时使烟叶微量元素含量更加协调,以T5效果最明显。

关键词： 黄曲霉毒素B1   复合益生菌   黄曲霉毒素降解酶   鸡胚原代细胞   肉鸡   生长性能   器官损伤  

摘要： 黄曲霉毒素B1（AFB1）是已知的所有毒素中污染范围最广、危害性最大的毒素。黄曲霉毒素AFB1的毒性及在动物生产中的危害已经被广泛关注。对已经污染的谷物进行解毒,常用的方法有生物法、化学法和物理法。整体来看AFB1在体外被不同吸附剂或者降解剂降解效率较高,但体内试验依然无法完全避免毒素对动物的危害,主要原因是体外降解和体内试验的相关性较差。从毒素引起危害的分子机制来看,毒素通过引起DNA损伤导致的细胞凋亡的研究已经被广泛认可,但毒素在引起细胞凋亡的过程中炎症反应的机制还不太明确。鉴于目前研究的现状,本文首先建立了通过人工模拟胃肠液的试验体系,系统评估了物理吸附剂、益生菌和AFB1降解酶的体外降解效果,并进行复配筛选出高效的AFB1复合脱毒剂。然后通过肉鸡肠、肝和肾原代细胞的培养,研究复合脱毒剂缓解毒素引起细胞损伤的分子机制,重点考察模式受体在毒素引起的炎症通路中的作用。最后通过肉鸡饲养试验验证复合解毒的效果,分别从生长性能、氧化、血清生化指标、肠道微生物区系以及免疫组化分析等多方面系统评估脱毒剂的效果。主要结果如下:（1）首先研究了发霉玉米中AFB1的释放特征,并评估物理吸附剂（蒙脱石、膨润土和酵母细胞壁）对AFB1吸附效果。结果表明三种物质适宜添加量分别为蒙脱石0.1%、硅藻土 0.2%和酵母细胞壁0.2%,AFB1去除率分别为84.27%、77.21%和40.23%,以蒙脱石吸附效果最好（P<0.05）。另外,利用人工胃肠液分别评估了 4种益生菌（枯草芽孢杆菌、干酪乳杆菌、粪肠球菌和产阮假丝酵母）和来自米曲霉的霉菌毒素降解酶的解毒效果。结果表明,4种益生菌对AFB1最大降解率分别为20.59%、19.97%、28.75%和25.67%;0.1%霉菌毒素降解酶对AFB1解率最高达到44.48%。为了进一步提高AFB1降解率,采用响应面设计对4种益生菌进行优化组合,结果表明,枯草芽孢杆菌、干酪乳杆菌、粪肠球菌和产朊假丝酵母组合制备复合益生菌（Compound probiotics,CP）的最佳配比为 1.0×10～5、1.0×10～5、1.0×10～7和1.0×10～5 CFU/mL时,AFB1最大降解率达到了 41.5%。进一步的研究表明,复合益生菌与霉菌毒素降解酶复配,使AFB1的降解率提高到55.28%,显著高于单独处理组的降解率（P<0.05）。最后以复合益生菌和AFB1降解酶（AFB1-degradation enzyme,ADE）为主,尽可能地减少蒙脱石的添加量,经过复合优化后确定去除AFB1的最佳配方为:复合益生菌+0.1%降解酶+0.03%的蒙脱石,使AFB1去除率达到了 90.11%。本试验为开发绿色高效的AFB1脱毒剂提供了新方案。（2）本研究旨在研究复合益生菌（CP）、复合益生菌上清液（CPS）、AFB1降解酶（ADE）对肉鸡原代肠细胞、肝细胞和肾细胞存活率的影响,并探讨CP+ADE（CPADE）或CPS+ADE（CPSADE）对AFB1引起的细胞毒性的缓解作用。结果表明,黄曲霉毒素B1对原代细胞的细胞活力具有时间和剂量效应,通过试验得到的细胞损伤模型的最佳AFB1浓度和作用时间为:肠上皮细胞为200 μg/L,作用时间为12 h;肝、肾细胞为40 μg/L,作用反应时间为12 h。肠上皮细胞的活力为85.71%（P<0.05）,肝、肾细胞的活力分别为80.95%和89.47%（P<0.05）。CP或者CPS分别单独添加作用于肠、肝和肾细胞,最佳结果为CP作用于肠细胞,CPS作用于肝和肾细胞最大细胞活力分别可以达到231.58%、105.29和115.84%。通过试验发现,ADE对三种细胞活力的影响,伴随着降解酶的降低,细胞活力逐渐升高,最后确定ADE最佳浓度为0.001%,并与对应的CP或者CPS复合制备成CPADE和CPSADE用于更进一步的深入研究。分别将损伤模型和对应的CPADE或者CPSADE同时作用三种细胞,结果表明:黄曲霉毒素B1能显著降低肠上皮细胞、肝细胞和肾细胞的存活率,分别为87.12%、88.7%和84.19%（P<0.05）,CPADE或者CPSADE能显著提高细胞存活率,分别提高至93.49%、102.33%和94.71%（P<0.05）。3种原代细胞IL-6、IL-8、肿瘤坏死因子-α、诱导型一氧化氮合酶、NF-κB、NOD1（肝细胞除外）和TLR2 mRNA相对丰度在CPADE或CPSADE作用下均明显低于毒素组（P<0.05）,结果表明CPADE或CPSADE可通过抑制NF-κB、NOD1和TLR2信号通路的激活而减轻AFB1诱导的细胞毒性和炎症反应。通过流式细胞仪对细胞凋亡的影响进行分析,结果表明CPADE和CPSADE对毒素引起的细胞凋亡有良好的缓解作用。（3）霉菌毒素

关键词： 肺癌   肿瘤类器官   中药提取物   澳洲茄边碱   功能性筛选   Hedgehog通路  

摘要： 肺癌是全球最常见的、导致死亡人数最多的呼吸系统恶性肿瘤,严重危害着我国人民的身体健康。肺癌新药的发现一直是制药工业和临床研究的热点,虽然临床上广泛应用着有EGFR、ALK等靶点的新药,但是目前仍需要发现更多的新药分子以供大部分肺癌患者及耐药患者使用。新药先导化合物的发现是新药研发的关键,而有意义的新药先导化合物的发现需要选择临床相关性高的检测技术方法和建立高质量的药物化合物库。 肿瘤类器官技术是一种新型的体外3D细胞培养技术,被认为是近十年来肿瘤干细胞技术的重大突破。体外培养的肿瘤类器官不仅能够有效建立基于肿瘤组织的体外肿瘤模型,而且具有与肿瘤组织类似的遗传背景、细胞结构及连接方式,能够有效保留大量的肿瘤生物学信息以及肿瘤对药物反应的特征,这使其成为肿瘤个性化医疗和抗癌药物研发的重要工具。提取肺癌患者的肿瘤组织并建立肺癌类器官库,进而建立基于该类器官库的药物筛选模型具有个体多样性高、临床相关性强、表型检测信息量大、药物筛选通量高等特点。 药学专家及生物医学专家在过去的研究中创造了大量化合物合成技术,也构建了庞大的人工合成化合物库,然而,与大自然中的化合物规模相比仍然非常渺小。中药是中华民族的瑰宝,中药中化合物的规模远远高于现有人类所能合成的化合物的规模,但是由于中药成分复杂,临床科学的评价方法困难,虽然近年获得一定的突破,仍待进一步提高。中药现代化是指用现代新药研发的思路和方法,通过现代化肿瘤检测技术和高通量筛选技术,筛选、研究和开发中药及其天然提取物,为中药现代化提供新的思路。中药现代化是目前推动中药获得临床认可的重要手段,也是本研究的重要指导思想。 目的: 本研究按照现代生物医药研发的思路和方法,利用肿瘤类器官标本库、天然化合物标本库、高通量药物筛选平台、肿瘤细胞生物学和肿瘤信号通路研究等技术平台,模拟临床应用中的药物反应,探讨、筛选提取自中药的天然化合物,并对其进行机制检测,探索新的抗癌新药发现模式。 方法及结果: 第一部分:肺癌肿瘤类器官模型的建立 1.肺癌肿瘤标本的获取 本研究所用肺癌肿瘤组织,依靠研究者发起的临床试验,包括“非小细胞肺癌肿瘤类器官临床相关性研究”,“北京胸科医院伦理委员会的伦理批件号为“2018年临审第48号”。根据临床研究设定的入组标准,入组患者签署知情同意后,在手术或者穿刺组织转移到实验室进行肿瘤类器官建模。 2.肿瘤类器官模型的建立和培养 2.1酶解单细胞和肿瘤细胞分离 将肿瘤组织剪成小块(约1-2mm),磷酸盐缓冲液清洗3次,转移至50ml离心管中,视组织块大小加入5-6倍的0.25%胰酶解复合物溶液,组织在电动匀浆器的搅动下变成细小碎片,在37℃,200rpm摇床中酶解1小时。孵育1小时后,使用200/300目尼龙网过滤细胞2次,获得无明显细胞团块形成的单细胞悬液或者接近单细胞的少量细胞的悬液,其在经过二次离心后以磷酸缓冲盐进行重新悬浮。加入到培养基的蔗糖层面上,再次离心分离肿瘤细胞层。 2.2类器官放大培养步骤 将悬液快速转移至培养液中,混匀,离心后弃上清,然后加入细胞培养液中。向15ml离心管中加入5-9ml培养液(取8ml),使用移液管将细胞悬液转移进该离心管,5min低速(1000rpm/min)离心,弃上清,之后用8ml培养液清洗。再次离心并弃上清,加入3ml培养液到离心管中,混匀(滴管轻吹)。将离心管中的混合液(分离得到的肿瘤细胞)加入三维培养基质中,低温条件下在特制的细胞培养器中完成种植,37℃孵育30min后,待肿瘤层形成,加入到含有经过优化的生长因子和营养成分EGF、noggin、R-spondinl等的培养层中,这些成分将提供肿瘤类器官生长的微环境。类器官被培养在三维环境内,每天观察细胞的状态。细胞团不断长大,颜色透亮,一周内镜下观察克隆直径大于200微米的类器官判定为状态较好;细胞团不生长,颜色呈棕色,一周内镜下观察直径小于50微米,判定细胞死亡或者无法扩增。 2.3类器官建库步骤 放大培养的肿瘤类器官经蛋白酶酶解,消化为单细胞状态。离心后用培养基重悬,重悬的细胞进行计数,重新离心后,按照2×106细胞/管置入类器官冻存液。之后通过程序降温,最后转移到液氮中长期超低温保存。 2.4结果: 取材时间为2018年1月至2019年1月,标本取自首都医科大学附属北京胸科医院胸外科的肺癌手术患者,共收集27例标本,利用其培养条件筛选和优化系统,成功确立肺癌细胞3D类器官培养的条件并构建了24例肺癌患者的类器官模型,其中患者男性13例,患者女性1 1例,腺癌患者13例,鳞癌患者11例,年龄分布从47-68岁,Ⅰ期7例,Ⅱ期11例,Ⅲ期6例,肿瘤直径1-3cm大小13例,肿瘤直径3-5cm大小7例,肿瘤直径大于7cm的4例,总建模成功率达到88.9%,建模周期稳定在3-4周左右。

关键词： 黄颡鱼   黄曲霉毒素   生长   肝脏功能  

摘要： 为研究黄曲霉毒素B1(Aflatoxin B1, AFB1)对黄颡鱼幼鱼生长、肠道消化酶及肝脏功能的影响,用添加不同梯度黄曲霉毒素B1(AFB1)(0、50、100和200μg/kg)的4种等氮等脂配合饲料饲喂初始体质量为(6.00±0.10) g的黄颡鱼幼鱼8周。结果显示:(1)饲料中添加AFB1对黄颡鱼幼鱼的存活率、饲料系数和特定生长率等均无显著影响,但使胰蛋白酶活性显著提高,而高含量AFB1(100和200μg/kg)显著降低肠道淀粉酶和脂肪酶活性;(2)随着AFB1添加量的上升,血清中谷丙转氨酶、谷草转氨酶活性及葡萄糖、甘油三酯、总胆汁酸和总胆固醇含量显著升高,肝脏中谷丙转氨酶、谷草转氨酶活性显著下降;(3) AFB1添加组的肝脏过氧化氢酶活性和丙二醛含量显著高于对照组,100和200μg/kg AFB1组超氧化物歧化酶活性显著高于对照组,其余各组无显著差异;(4) AFB1添加组肝脏sod基因及炎性因子il-1β基因的相对表达量显著上调,200μg/kg AFB1组cat基因及炎性因子il-8、il-10相对表达量显著上调;(5)通过组织学观察,AFB1会引起部分肝细胞出现轻微萎缩、肝细胞核移位、细胞界限模糊和肝细胞内空泡化的现象。研究表明,在本实验条件下,饲料中AFB1含量低于200μg/kg不影响黄颡鱼幼鱼生长性能,但饲料中AFB1≥50μg/kg时会影响黄颡鱼幼鱼肠道的消化吸收功能,同时引起肝脏氧化应激及炎性反应,造成肝脏功能损伤。