关键词： 黄曲霉毒素   免疫分析   纳米抗体   融合表达  

摘要： 黄曲霉毒素(Aflatoxins,AFs)是由黄曲霉(Aspergilus flavus)与寄生曲霉(Aspergilus parasiticus)等真菌产生的一种剧毒代谢产物,作为天然污染物广泛存在于农产品和食品中,严重威胁人类和动物健康,并造成巨大经济损失。随着世界范围内对黄曲霉毒素的日益关注,发展可靠的黄曲霉毒素检测技术已成为当前亟需解决的问题。基于抗体和抗原之间特异性结合反应的免疫分析法具有通量高、特异性好、简单快速等特点,已成为快速筛查真菌毒素的常用方法。纳米抗体是最小的抗原结合片段,与常规抗体相比,具有极强稳定性、高溶解性和易于进行基因工程改造等性质,在小分子污染物的快速免疫分析中具有广泛的应用前景。为了提高基于纳米抗体免疫分析法的灵敏度和检测效率,本研究以抗AFB1纳米抗体Nb26为实验材料,采用基因重组技术制备纳米抗体融合蛋白,同时引入不同信号放大技术进行研究,为纳米抗体在免疫检测中的广泛应用提供新思路。本论文的主要研究内容和研究结果如下:1.基于生物素化纳米抗体的免疫分析方法研究。选择2种间隔臂长的生物素分子通过化学偶联法得到八种生物素化纳米抗体Nb26,经BA-ELISA(Biotin-streptavidin-amplified enzyme-linked immunosorbent assay)分析,选择Sulfo-NHS-LC-LC-Biotin与纳米抗体Nb26以10:1摩尔比制备生物素化纳米抗体Nb26。选择SA-HRP和SA-PolyHRP作为“检测示踪物”,结果发现SA-PolyHRP以1:10000稀释倍数进行BA-ELISA能提高灵敏度并降低抗原抗体用量。以生物素化纳米抗体Nb26为检测一抗,以SA-PolyHRP为信号放大器,建立了检测小麦和玉米样品中AFB1的BA-ELISA,该方法的灵敏度(IC50值)为0.21 ng/mL,线性范围为0.08-0.65 ng/mL,检测限为0.04 ng/mL,与传统的基于Nb26的ELISA方法相比,抗体用量减少了近2个数量级。样品加标回收率在87.35%-98.53%之间,变异系数在5.23%-10.77%之间,表明该方法具有良好的准确性和可靠性。2.定点生物素化纳米抗体融合蛋白的制备及免疫检测方法建立。将Nb26基因与AviTag基因进行基因重组并克隆至表达载体pET32m中,构建了四种融合表达载体pET32m-AviTag-Nb26,分别转化至*** BL21(DE3)中进行原核表达。对AviTag-Nb26融合蛋白活性进行分析,选择AviTag-Nb26-His融合蛋白建立了快速检测农产品中AFB1的含量的BA-ELISA,该方法的灵敏度为0.28 ng/mL,线性范围为0.12-0.95 ng/mL,检测限为0.07 ng/mL,对AFB1具有良好特异性。样品加标回收率在91.06%-96.70%之间,变异系数在4.96%-9.47%之间,表明该方法具有良好的准确性和可靠性。3.基于免疫磁珠和生物素-链霉亲和素的免疫分析方法建立。以AviTag-Nb26-His融合蛋白为检测一抗,将完全抗原AFB1-BSA直接固定在羧基化免疫磁珠表面上合成抗原探针MB-AFB1-BSA,结合生物素-链霉亲和素放大系统建立了免疫检测方法MB-ELISA(Magnetic bead-based ELISA),该方法的灵敏度为0.53 ng/mL,线性范围为0.21-1.37 ng/mL,检测限为0.12 ng/mL,对AFB1具有良好特异性,检测时间由传统ELISA方法所需的2 h缩短至26 min。样品加标回收率在90.10%-97.25%之间,变异系数在4.03%-10.55%之间,表明该方法具有良好的准确性和可靠性。4.纳米抗体-碱性磷酸酶融合蛋白的制备及一步法化学发光酶免疫分析方法建立。将Nb26基因与碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,AP)基因基因重组并克隆至表达载体pET32m中,构建了四种重组融合表达载体pET32m-AP-Nb26,分别转化至*** BL21(DE3)中进行原核表达,经纯化获得四种AP-Nb26融合蛋白,均具有识别AFB1的活性和碱性磷酸酶的活性。通过比较比色分析法和化学发光分析法,选择AP-G4S-Nb26融合蛋白为检测抗体,采用化学发光分析法建立了检测小麦和玉米样品中AFB1的一步法CLEIA(Chemiluminescent enzyme immunoassay),该方法的灵敏度为0.25 ng/mL,线性范围为0.09-0.81 ng/mL,检测限为0.05 ng/mL,对AFB1具有良好特异性。样品加标回收率在89.83%-99.05%之间,变异系数在4.78%-9.04%之间,表明

关键词： 乳品安全   黄曲霉毒素   斑马鱼胚胎   发育毒性  

摘要： 乳品中的黄曲霉毒素污染已成为全球范围内日益关注的问题。其中,黄曲霉毒素AFB1及其代谢产物AFM1在乳品中污染频率较高且毒性极强。近年研究发现乳品中的黄曲霉毒素残留对婴幼儿的生长发育具有潜在的严重威胁。目前对于二者诱导发育毒性的具体机制尚不清楚,针对AFM1的研究也不足。因此,本研究以斑马鱼胚胎为研究对象,探究了乳品中AFB1和AFM1对胚胎的发育毒性,并以此为依据建立乳品中黄曲霉毒素的风险识别方法,应用于实际乳品安全风险的识别监测,从而为乳品安全风险评估和黄曲霉毒素污染防控提供依据和手段,主要研究内容及结果如下:首先通过形态学指标测定初步分析了毒性效应的外在表现,明确了毒性靶器官和敏感毒性效应。结果发现AFB1和AFM1均会导致斑马鱼胚胎脊柱弯曲、卵黄囊吸收延迟等发育畸形,引发胚胎吸收不良综合征,提示引起斑马鱼胚胎发育障碍,其中卵黄囊吸收延迟(肝脏毒性)是最为敏感的一项毒性效应指标。毒性指标结果显示二者主要毒性靶器官均为肝脏和神经,同时各项指标均显示AFB1表现出更强的发育毒性。采用多组学手段从内源性代谢角度综合分析了对发育的内在不良影响。结果发现AFB1和AFM1均引起大部分氨基酸和甘油磷脂含量的上调,共同干扰了苯丙氨酸代谢等26条氨基酸代谢通路及甘油磷脂代谢和脂肪酸相关代谢通路,这些途径与能量代谢和氧化应激相关,也进一步从内在揭示了对肝脏和神经的不利影响。其中,AFB1对于氨基酸和脂质代谢的干扰程度更大。进一步通过组织病理学检查等方法验证分析了对肝脏(主要靶器官)发育的影响,结合转录组分析探究了相关机制。结果发现二者通过诱导肝脏脂质代谢紊乱引发脂质蓄积,进一步加重肝脏细胞凋亡和组织病理学改变。原因在于PPAR信号通路干扰导致了脂肪酸转运(cd36,fabp和scp2a)和脂质转运(apoa4a)相关基因表达下调,脂代谢相关基因(ptgs2a和socs3)的表达增加,引起卵黄囊主要脂质(PC)及其前体脂肪酸(花生四烯酸)的代谢紊乱,通过炎症反应对肝脏产生不利影响,这与AFB1对斑马鱼胚胎更强的肝脏发育毒性有关。通过行为分析和生化指标测定验证分析了对神经(主要靶器官)发育和运动行为的影响。结果显示二者引发胚胎神经毒性关键酶(ACh E)和相关氨基酸(谷氨酸等)改变,鱼鳔、脊柱、尾鳍等相关部位畸形并伴随着运动行为受到抑制。这主要与引起的神经递质调节干扰以及突触传递障碍(ddc,fosab等基因改变)以及尾部和身体发育相关基因(mmp9和igfbp1a)的改变造成的运动器官发育异常有关。fosab,mmp9和igfbp1a基因在AFB1处理组更大程度的改变与其更强的神经毒性和行为抑制作用有关。以上研究发现,利用相关发育畸形指标能够灵敏识别AFB1和AFM1在肝脏和神经等方面的发育毒性,用于识别AFB1和AFM1的风险具有可靠性。因此,综合这些指标建立了乳品中黄曲霉毒素风险识别方法并对实际乳粉样品进行了毒性评估。结果显示方法较为可靠,6份乳粉样品的总畸形率均在10%,风险较低。另外高剂量时其毒性受到了乳粉基质的促进,提示需要更进一步关注乳粉基质的促进效应。

关键词： 医疗机构   中药制剂   注册申报   备案申报  

摘要： 目的：为促进医疗机构中药制剂的研发、完善相关管理细则提供参考。方法：梳理我国各省（区、市）药品监督管理部门颁布的《医疗机构制剂注册管理办法/实施细则》和《医疗机构应用传统工艺配制中药制剂备案管理办法/实施细则》内容，总结和归纳各地医疗机构制剂注册申报和医疗机构传统中药制剂备案申报要求的异同点，提出相关建议。结果与结论：各地医疗机构中药制剂注册与备案申报提交资料的要求基本一致，但医疗机构中药制剂注册申报相比备案申报多了制剂临床研究申请、现场考察、抽样等环节；各地《医疗机构应用传统工艺配制中药制剂备案管理办法/实施细则》存在差异。针对主要差异，建议统一备案适用具体剂型，修订处方5年使用历史证明材料申报资料要求，确定每年临床病例数量要求，规范临床资料收集。

关键词： 玉米赤酶烯酮水解酶-漆酶融合酶   黄曲霉毒素B1   玉米赤酶烯酮   代谢组学   重组人铁蛋白重链   24聚体  

摘要： 黄曲霉毒素B1（Aflatoxins B1，AFB1）和玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEN）是严重危害我国饲料加工和畜禽养殖的两种霉菌毒素。AFB1会对牛，鸡鸭等动物造成严重中的肝肾功能损伤;AFB1与人类肝细胞癌（HCC）的发生密切相关。ZEN导致动物生长障碍，生殖系统损伤等多种病症，同时导致女性产生性早熟，乳房发育迟缓，身高矮小等问题。AFB1和ZEN污染范围广检出率高，并且经常同时在粮食作物中存在，因此构建一种能高效降解两种毒素的酶具有重要的理论和应用价值。　　玉米赤酶烯酮水解酶RmZHD是目前降解ZEN毒素效果较好的酶。漆酶CueO是一种多酚氧化酶，具有广泛的底物谱，具有降解AFB1能力。本研究首先将源于Ramichloridium mackenziei的RmZHD与源于大肠杆菌K12中的CueO编码序列克隆到pET-28a表达载体中，在大肠杆菌BL21（DE3）pLyysS成功表达了融合酶。通过比较确定了RmZHD在N端，CueO在C端的表达顺序。经Ni2+亲和纯化，获得纯度90%，浓度达5.6mg/mL的RmZHD-CueO融合酶，其产率为180mg/L培养基。建立了融合酶与ZEN和AFB1两种毒素的代谢孵育体系，利用三重四级杆-飞行时间质谱检测到质核比分别为315.1567和329.0656两种代谢产物，分析确定它们分别是烷基间苯二酚产物+Na+和AFQ1+H+。该结果表明融合酶两个功能域都保持活力，可分别催化ZEN和AFB1两种毒素的代谢。　　通过比较确定50℃，pH7.2，反应时间8-10h为融合酶RmZHD-CueO（GGGGS）同时代谢两种毒素的最适反应条件。为进一步优化酶活，比较了两个酶之间不同连接肽（Linker）对酶活的影响。N端RmZHD的酶活不受Linker的影响。而C端CueO漆酶在无Linker，SGG,和GGGGS三种情况下，代谢AFB1速度分别为9.67，15.91，22.15nmol/h。因此，选用GGGGS的Linker。经整体优化后，0.1mg酶在50℃，8小时，可将2μg ZEN完全代谢，将2μg AFB1代谢95.6%。此外，通过优化反应条件，成功引入1mM铜离子提高了融合酶中漆酶的活性，使其在2小时内代谢AFB1速度提高约50%;在4小时内，可完全降解AFB1。同时，本研究进一步验证了含融合酶的工程菌破碎后，菌液上清对ZEN和AFB1的代谢能力，发现将反应时间延长至10h，可完全代谢ZEN和代谢95%的AFB1。　　利用重组人铁蛋白重链（rHF）表达后自组装形成24聚体的性质，验证了将rHF加在RmZHD C端形成的重组蛋白对ZEN的代谢活性可提高10%，并且耐受SDS的变性。同时作为水解环酯结构的酶，其对24元环的新型大环内酯抗生素macrolactinA也表现出代谢活性。但尝试将rHF加在RmZHD-CueO融合蛋白末端构成新的重组蛋白，其主要以包涵体形式表达，无法获得有活性的蛋白。　　综上所述，本研究构建了一种可同时代谢两种毒素的双功能降解酶，可分别将ZEN和AFB1代谢为烷基间苯二酚产物和AFQ1。通过对蛋白引入GGGGS连接肽，稳定了酶对ZEN的降解，并提高了对AFB1的代谢能力。确定了50℃，pH7.2，反应时间8-10h为酶的最适反应条件。本研究构建的RmZHD-CueO融合酶可同时实现对ZEN和AFB1的高效降解，为解决多种毒素污染问题提供了研究参考，具有一定的开发和应用价值。

关键词： 黄曲霉毒素B1   生物学特性   燕麦发酵乳   植物乳杆菌  

摘要： 由于黄曲霉毒素B1(AFB1)具有毒性强,分布广的特点,给人类健康带来极大威胁,但物理脱毒和化学脱毒成本高,并且会破坏食品内的营养物质,所以绿色、高效的生物脱毒引起了人类广泛关注,乳酸菌作为食品级微生物,成为生物脱毒的主要研究对象。本研究对实验室前期分离出的74株乳酸菌,进行降低AFB1能力的测定,对菌株进行形态学鉴定及分子生物学分析,再进行生物学特性研究,然后测定菌株的培养条件对降低AFB1的影响并采用响应面优化法优化其培养条件,最后采用菌株最佳培养条件制备燕麦发酵乳,测定发酵乳各项指标并测定在贮藏其内,菌株降低AFB1的能力。研究结果如下:通过香豆素初步筛选,有19株乳酸菌可以降低AFB1,分别为菌株E11、A9、E6、H4、Q-2-2、B1、E13、A7、BZ2、Q-2-1、Q-1-7、H3、Q-1-5、G-3、Q-1-8、E2、A3、B3、B2。后对菌株降低AFB1能力通过ELISA的方法进行复筛,有7株乳酸菌,分别为菌株A7、A9、BZ2、B2、Q-2-1、B3、H4,其降低AFB1的顺序为A9>A7>BZ2>B3>Q-2-1>H4>B2,经16s r RNA鉴定菌株A9、B2和Q-2-1为植物乳杆菌,B3为发酵乳杆菌,BZ2为屎肠球菌,A7、H4为瑞士乳杆菌。经生物学特性研究,植物乳杆菌A9在p H2.5的酸性环境、0.3%的胆盐环境及10%的Na Cl环境中的有较好的耐受性,相对于菌株A7和BZ2,菌株A9凝乳时间更短、产酸速度更快。通过研究培养条件对植物乳杆菌A9降低AFB1能力的影响,得出在培养温度为30℃,培养时间为24h,接种量为2%时,降低AFB1的能力最高。以此为基础采用三因素三水平的响应面试验确定最佳培养条件,结果表明,温度为30.84℃,时间为27.15h,接种量为2.49%时,植物乳杆菌A9降低AFB1的能力最高。在最佳培养条件下,以保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌作为对照组,以保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、植物乳杆菌A9为实验组,制备燕麦发酵乳,经质构得出实验组的硬度,胶着度、内聚性分别为18.80±0.69g、14.43±0.43g?s和0.78±0.04g?s。电子舌、电子鼻测定结果显示燕麦发酵乳有较强的燕麦发酵乳的典型滋味和气味,感官评定结果的综合评分为78.28±0.35分。燕麦发酵乳在贮藏14d时,p H值为3.46,酸度为100.99oT,活菌数为9.08log(CFU/g),持水力为18.93%,AFB1的下降率为53.09%。

关键词： 中药饮片   中药制剂   微生物污染   微生物控制   水分   水分活度  

摘要： 微生物污染和增殖影响中药饮片及中药制剂的质量安全。中药饮片污染微生物包括需氧菌、霉菌和酵母菌等。在生产、储存和运输中常因温湿度等条件控制不当,导致中药污染微生物增殖,不仅影响中药饮片的临床用药安全,而且可能将污染微生物传递到下游中成药,影响中成药质量安全。水分活度是表征水分能量状态的重要参数,与微生物增殖密切相关。水分活度已用于食品、化妆品等领域,但在中药微生物控制方面研究较少。中药饮片及制剂的水分活度不仅与自身属性有关,也与环境湿度密切相关。研究中药饮片及制剂水分活度分布特征,探讨中药饮片及制剂水分活度与微生物增殖的关系,对于应用水分活度指导中药饮片及制剂的微生物控制具有较好的应用价值。本文研究了黄芪等26种中药饮片的水分活度分布情况,发现85.2%中药饮片水分活度低于0.60,不支持微生物增殖,通过降低初始生物负载,维持饮片的水分活度将有望实现微生物的控制。部分中药饮片如黄芪、净山楂、苦杏仁和薏苡仁等水分活度高于0.60,宜采取措施降低水分活度,防止微生物增殖。为确定影响中药饮片的关键水分活度,选择枸杞子和山药研究了等温吸湿曲线以分析在特定温度下中药饮片的吸湿规律。通过在75%相对湿度条件下的枸杞子、牡蛎等饮片水分活度与污染微生物增殖的关系研究,探讨中药饮片的吸湿规律及水分活度对污染微生物增殖行为的影响,提出了基于水分活度的中药饮片微生物控制策略。根据中药饮片的水分活度和吸湿特点,可将中药饮片分类,对于营养丰富且易于吸湿的中药饮片,根据等温吸湿曲线可预测关键水分活度,通过干燥、包装等方式控制水分活度,对于不易吸湿的低水分活度饮片,可降低初始生物负载,适度控制即可满足微生物控制需要,降低成本,提高微生物控制水平。为掌握不同剂型中成药的水分活度特征,建立基于水分活度的中成药微生物控制策略。采用露点冷面镜的仪器方法分析了 12种剂型的水分活度分布情况,结果表明剂型是中成药水分活度的主要决定因素,同剂型不同品种中成药的水分活度差异大。洗剂、凝胶剂、糖浆剂、露剂和口服液的水分活度较高,水分活度平均值均大于0.90,占调查剂型的27.3%,易引起微生物增殖;而胶囊、丸剂、颗粒剂、散剂、贴剂、贴膏剂等剂型的水分活度较低,水分活度平均值均小于0.60,占调查剂型的 54.5%。采用 0.328、0.529、0.753、0.902、0.973 系列水分活度条件下放置的方法分析了胶囊剂、丸剂和颗粒剂3种中成药的水分活度和需氧菌总数、霉菌及酵母菌总数的变化规律,不同湿度环境下制剂水分活度变化呈现先快速后缓慢变化并逐渐与环境相对湿度趋于平衡的特点,水分活度相对较低的中药制剂不支持微生物增殖,根据制剂水分活度分布情况及微生物生长特性提出了 12种中药剂型的微生物控制策略。基于水分活度的中药制剂分类为微生物控制提供了新思路,在降低中药制剂生物负载的前提下,可通过控制水分活度降低中药制剂生产、运输、储存等过程的微生物生长繁殖风险,进而提高非无菌中药制剂的微生控制水平。按照水分活度与微生物生长的关系原理,预测6种水分活度相对较高剂型中成药的潜在微生物风险,进而分析同一药品不同剂型的3组制剂处方与水分活度的关系,研究水分活度对中药制剂的潜在污染微生物增殖风险的影响。根据水分活度与微生物的关系以及试验验证认为,洗剂、口服液、露剂类中药制剂细菌易污染和增殖,糖浆和煎膏剂类中药制剂霉菌和酵母菌易污染和增殖。因此,水分活度相对较高的非无菌中药制剂微生物污染和增殖风险较高,可将水分活度作为处方优化、过程控制、质量控制和标准制定的依据。此外,水分活度是影响微生物增殖的重要跨栏因子,低水分活度制剂具有一定的抑菌能力,分析蜜炼川贝枇杷膏与川贝枇杷糖浆、蜜炼强力枇杷膏与强力枇杷露、川贝止咳糖浆与川贝止咳露等3组制剂处方,确定其最大潜在污染微生物,并探讨了抑菌体系的有效性和处方筛选的合理性。

摘要： 中药在我国古籍中通称“本草”，在预防、治疗疾病，促进康复，保健等方面具有重要的作用。为保证药效，医师往往需要将药物进行一定的处理，制成汤、散、丸、膏、酒、丹、露、锭这八种剂型之一，再供患者服用。那么，这些中药制剂各自有什么样的特点呢？|汤|剂|汤剂可能是您最常见到的中药制剂形式。它还经常出现在影视剧等艺术作品中。从《红楼梦》到《西游记》，

关键词： 发酵饲料   芽孢杆菌   真菌毒素   黄曲霉毒素B1   呕吐毒素   玉米赤霉烯酮  

摘要： 饲料及饲料原料中的真菌毒素可通过食物链广泛的扩散,极大的危害畜禽和人类。结合微生物发酵饲料优势和乳酸菌以及芽孢菌对真菌毒素的去除作用,筛选出可降解毒素的菌种,可节约饲料饲喂前的脱毒处理的成本和操作,并且增加饲料的营养成分、提高畜禽消化率和恢复已损伤的动物等,具有极大的经济前景和发展潜力。本研究的目的是筛选出应用于饲料发酵中的可降解黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1,AFB1）、呕吐毒素（Deoxynivalenol,DON）和玉米赤霉烯酮（Zearalenone,ZEN）的菌株,主要工作和结果如下:（1）针对LB培养基,优化了用于检测其中DON含量的HPLC方法,优化后HPLC检测条件为:色谱柱型号Agilent ZORBAX SB-C18（250 mm×4.6 mm,5μm）流动相乙腈-水（体积比10:90）,流速1.2 m L/min,柱温45℃,进样量20μL,检测波长220 nm。该方法检出限约为0.025～0.034μg/m L,定量限约为0.086～0.116μg/m L。（2）从12株产乳酸能力强的乳酸菌筛选出去除DON能力强的饲料发酵用乳酸菌为:鼠李糖杆菌NJ8、屎肠球菌RS1;从49株芽孢杆菌中筛选出可高效去除DON的菌株枯草芽孢杆菌BL-12和贝莱斯芽孢杆菌BL-14,16 h对DON降解率分别达78.98%和82.63%;对49株芽孢杆菌进行亚甲基蓝脱色和过氧化物酶活性筛选,筛选出4株对三种真菌毒素AFB1、DON和ZEN中的两种或两种以上有较高降解率的芽孢菌菌株:枯草芽孢杆菌BL-10、蜡样芽孢杆菌BL-17、蜡样芽孢杆菌BL-24和枯草芽孢杆菌BL-31。其中,菌株BL-17在三种毒素同时存在时对AFB1和ZEN两种毒素的降解率32 h分别达74.38%和98.31%。（3）以菌株BL-17为出发菌株,对其进行紫外和ARTP诱变育种与筛选,筛选出1株诱变菌株BL-17-27,32 h时对培养基中三种毒素AFB1、DON和ZEN降解率分别为63.81%、64.55%和100%。（4）将芽孢菌BL-12、BL-14、BL-10、BL-24、BL-31和BL-17-27各自配合两株乳酸菌RS1和NJ8进行厌氧和耗氧饲料发酵,并尝试将芽孢菌两两组合耗氧发酵饲料,最终确定发酵菌株BL-17-27、BL-24和NJ8、RS1,耗氧发酵饲料3 d对饲料原料中AFB1和DON的降解率分别能达到81.75%和79.86%,对ZEN的降解率则为100%。（5）优化了两株发酵用芽孢菌的液体培养基配方,菌株BL-17-27优化最佳培养基为2%蔗糖、0.8%胰蛋白胨、0.5%玉米浆、1%Na Cl、0.2%K2HPO4;菌株BL-24优化增殖培养基为2%蔗糖、0.8%豆粕粉、0.5%玉米浆、1%Na Cl、0.3%K2HPO4。测定菌株的生长曲线,确定菌株接种发酵饲料的时间为20 h。

关键词： 黄曲霉毒素B1   世代毒性   生殖发育   表观遗传   秀丽隐杆线虫  

摘要： 黄曲霉毒素B1（aflatoxin B1,AFB1）在花生、玉米、燕麦、啤酒等粮食及油料作物中分布范围广、污染水平高,严重威胁粮食安全。现对其多种毒性作用尤其是AFB1的致癌性已进行了深入研究,此外AFB1还具有生长、生殖及神经发育等多种毒性作用。目前对生长发育及生殖毒性的研究大多限于母代及子代（F1）两代动物体,然而关于动物甚至人类世代长期暴露于AFB1时,对生物体母代（P0）及其子代（F1、F2、F3…Fn）会有怎样的影响迄今还鲜有报道。基于此,本实验选择可用于研究世代毒性的模式动物—秀丽隐杆线虫,探究连续暴露（AAAA）、间接暴露（AAAN、AANA、AANN、ANAA、ANAN、ANNA）、仅母代暴露（ANNN）等3类（8种）暴露模式下,AFB1对母代（P0）及其子一代（F1）、子二代（F2）、子三代（F3）秀丽隐杆线虫的生长发育（体长）和生殖能力（产卵量、世代时间及生殖器形态）产生的毒性作用,建立AFB1浓度和线虫代际数双因素混合模型评估二者对AFB1世代毒性的影响,鉴于连续/仅母代暴露两种模式所对应的继代/跨代毒性作用机理是AFB1对线虫世代毒性机理的重要部分,以此为基础,提取两种暴露模式下世代线虫中的mi RNA并进行靶基因对应,随后以VENN图、聚类分析、GO及KEGG数据库等为基础,分析AFB1对线虫代际间的共同和特异性继代/跨代毒性作用机理,从基因、蛋白和生理生化水平验证继代/跨代毒性作用机理并绘制毒性作用机理图,挖掘AFB1对线虫继代毒性和跨代毒性机理的差异,探究AFB1对线虫的世代毒性及其作用机理。主要研究结果及结论如下: 1.研究AFB1在三类暴露模式下对线虫的世代毒性作用,测定世代线虫体长、产卵量、世代时间及生殖器形态。结果表明在AFB1连续暴露模式（AAAA）下,如2μg/m L时AFB1对世代线虫（P0、F1、F2、F3）生长发育的抑制率分别为51%、28%、25%和54%,对产卵量的抑制率达到85%、90%、85%和86%,而对世代时间的抑制率则分别为16%、23%、29%和40%,生殖器形态逐渐畸形,这些结果表明与空白组相比,AFB1会显著抑制每一代线虫的生长发育和生殖能力,且对线虫生殖能力的抑制强于生长发育。间接暴露模式中,F2代AAN暴露时线虫体长和产卵量的EC50值分别为7.83μg/m L和1.43μg/m L,这表明由于胚胎或配子接触毒素,致其子代虽未直接接触毒素但子代线虫生长发育和生殖能力仍受阻;而F1代AA暴露模式下线虫体长、产卵量和世代时间EC50值分别为3.77、0.26和4.61μg/m L,与F1代相比,F3代AANA处理下其EC50分别达到5.27、0.56和4.62μg/m L,对应提高了39.79%、115.38%和0.22%,这表明线虫子代对AFB1的耐受能力提高且线虫产卵量变化最为明显。此外ANNA暴露模式下对F3代线虫体长（EC50=5.90μg/m L）和产卵量（EC50=0.48μg/m L）的损伤作用相比P0代（EC50=3.58μg/m L和0.39μg/m L）分别降低了64.8%和23.07%,可能是由于表观遗传在跨代遗传中的作用。仅母代暴露模式下,P0、F1、F2和F3代体长EC50分别为3.58、7.73、7.67、9.02μg/m L,产卵量EC50分别为0.39、0.85、1.82和1.85μg/m L,世代时间EC50为3.31、6.15、10.74和10.87μg/m L,生殖器畸形和损伤程度逐渐减轻,这些表明线虫的生长发育和生殖能力会随着子代（F1～F3）不再接触AFB1而逐渐恢复但未恢复到空白水平。说明AFB1会对线虫产生世代生殖毒性效应。 2.探究AFB1对线虫的继代毒性作用机理。通过提取连续暴露线虫的mi RNA,并经mi Randa对应靶基因,分析发现差异mi RNA的数量会随着代际数的增加而不断增加（52、55、77、89个）,对mi RNA和靶基因进行RT-PCR测定,结果显示AFB1作用使世代（P0～F3）线虫中cel-mi R-240-5p和cel-mi R-247-3p的表达量均随着代际数的增加而逐渐下降,分别从P0代中的2.96和13.35逐渐降低至F3代中的0.20和0.43,而mi RNA表达量在代际间的逐渐下降可能是调控AFB1继代毒性效应的关键因子,对应的靶基因（hyl-1、R05F9.6及rbx-1）受多种mi RNA的共同调控作用,使其表达量在每一代中变化均有不同（如rbx-1在P0代中上调1.44倍,在F2代中则上调8.46倍）,由此影响解旋酶活性等GO功能,并影响鞘脂代谢、氨基糖和核苷酸糖代谢、糖酵解/糖异生等KEGG信号通路,从而对四代线虫的生长和生殖能力产生继代毒性作用。此外,RT-PCR

关键词： 有机小分子纳米材料   电化学发光   免疫传感器   黄曲霉毒素B1   检测  

摘要： 近年来,随着经济的快速发展,大家对食品中霉菌毒素的检测更加关注。黄曲霉毒素B(AFB)作为最常见的一种霉菌毒素,每年因其产生的食品安全事故为我国甚至世界带来重大经济损失。因此,快速准确灵敏检测AFB至关重要。本论文基于有机小分子ECL纳米发光体的优异光学性质,结合信号放大策略构建了系列高灵敏电致化学发光免疫传感器用于AFB的快速检测。具体研究内容如下:1.通过重沉淀法制备9,10-二联苯蒽立方纳米粒子,其表现出优秀的聚集诱导电致化学发光特性,将其修饰于电极表面,并通过聚乙烯亚胺引入氨基功能化。随着戊二醛、抗体和牛血清白蛋白依次组装后,构建的无标记免疫传感器通过AFB对光发射体ECL信号的直接淬灭进行检测,随着靶标浓度的增加,ECL信号下降。提出的免疫传感器在检测过程中显示了高灵敏度和低检测限。2.构建了一种比率竞争型免疫传感器用于AFB检测,相比第一部分有效排除了外界干扰,获得了更好的稳定性。首先制备新型钨金属有机骨架,并将其用于负载二茂铁甲醛作为电化学信号指示剂,以此复合碳纳米管获得具良好导电性及大比表面积的复合基底材料MWCNTs/Fc-MOF,用于捕获大量抗体的同时,作为内部参考信号用于系统自矫正;其次,制备了纳米棒ECL发射体BPYHBF,将其作为探针标记竞争抗原BSA-AFB。最终,基于竞争免疫反应,构建的传感器产生的ECL信号随靶标浓度的增加而降低,而在0.45 V处产生的电化学信号不随靶标浓度的变化而变化。因此,通过信号ECL/DPV实现对AFB的检测。所制备的传感器表现出优异的稳定性,可接受的灵敏度和准确性。3.构建一种检测AFB的新型差分竞争型免疫传感器,相比第二部分的两种信号输出模式,此构建的传感器可分别在阴、阳极产生两个独立ECL信号。简化了检测操作的同时,单一信号输出也可实现系统自矫正,避免了两种信号输出带来的外界干扰。首先,制备了用于捕获抗体的三维多孔碳材料和具电位分辨ECL特性的聚合纳米棒发射体IBPHF,在TPA/KSO存在下,发射体在1.5 V和-1.5 V左右分别发射出最强ECL信号(ECL和ECL),然后将其用于标记BSA-AFB。在AFB存在下,该竞争型免疫传感器的ECL和ECL均随AFB的增加而减少。最后通过ECL和ECL的差值(△ECL)检测靶标,所用的差分策略可有效消除假信号,实现系统自矫正,完成了对AFB的可靠检测。综上所述,制备的免疫传感器实现了对靶标的灵敏快速检测,并在实际样品中获得了令人满意的准确度,最终,所提出的策略对其他霉菌毒素的检测提供了思路。