关键词： 黄曲霉毒素B1   纳米抗体   电化学免疫传感   黑磷烯   仿生矿化MOF  

摘要： 黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1,AFB1）是由真菌产生的毒性次级代谢产物,具有较强的“三致作用”和广泛的污染性,因此开发快速、灵敏、准确的AFB1检测方法是十分必要的。电化学免疫传感器集成了免疫分析技术和电化学传感各自的特点,兼具快速、灵敏、特异和易于便携化等优点,是食品污染物监控的重要手段。本研究构建了标记型和非标记型两种电化学免疫传感器,并将其应用于AFB1的检测,均表现出良好的传感检测性能。研究主要包括以下两部分:（1）基于高敏感传感界面的非标记型AFB1电化学免疫传感器研究采用黑磷烯（BP）和羧基化多壁碳纳米管（MWCNTs-COOH）制备的功能化纳米复合材料（MWCNTs-COOH@BP）修饰玻碳电极,以AFB1纳米抗体为识别元件构建界面敏感的非标记型免疫传感器。其中MWCNTs-COOH与BP通过P-C键结合而稳定BP,复合材料能够显著提高检测探针的电催化响应。同时,由于纳米抗体体积较小,对传感界面的敏感性影响小于传统单克隆抗体。基于上述原因,本研究构建的免疫传感界面对待测AFB1有较高的敏感性和良好的检测性能。在最优条件下,所构建的非标记型免疫传感器对AFB1的检出限为0.27 p M,检测的线性范围为1.0p M-5.0 n M。该传感器还表现出良好的稳定性、特异性和重复性,对实际样品的加标回收率为90.38%-99.64%,表明该传感器能够满足实际样品的检测需求。（2）基于新型免疫探针的标记型AFB1电化学免疫传感器研究本研究以辣根过氧化物酶（Horseradish peroxidase,HRP）、有机配体（3-甲基-1,2,4-三氮唑,Hmtz）和金属盐(硝酸锌,Zn（NO3）2)为原料,合成仿生矿化MOFs（HRP@MAF-7）。HRP较低的表面电势能加速有机配体和金属离子自组装形成MOFs,由此导致HRP被MOFs封装,MOFs骨架能够保护HRP结构稳定。MOFs内部封装的HRP可以催化其底物产生可检测的信号,外部的纳米抗体可作为免疫探针用于特异识别目标检测物,从而构建痕量检测AFB1的标记型电化学免疫传感器。该电化学免疫传感器具有较高的灵敏度,最低检出限（LOD）为20 fg/m L,线性范围为50 fg/m L-10 ng/m L,同时具有较好的稳定性、特异性和重现性,本研究为食品和环境样品中小分子的竞争性免疫测定提供一种新思路。

关键词： 医疗机构   中药制剂   成果转化   人用经验  

摘要： 医疗机构（医院）中药制剂发展至今，有较为丰富的人用经验，而基于人用经验的中药新药研发是中医药的优势，也是发展的趋势。随着新的法规以及针对中药人用经验整理和总结的技术要求进一步明晰，中医临床实践在中药新药注册审评中的作用日益显现。如何有效、充分地开发利用中医药独特优势的原创资源并实现成果转化，是中医药工作者需要深入思考和解决的关键问题。本研究从医院中药制剂转化为中药新药的优势以及新政策等方面，阐述医疗机构中药制剂成果转化的现状，从临床成果转化的观念、临床价值、临床数据、质量标准等方面说明医院中药制剂新药转化的难点并提出建议，以期为日后更多优质的医院中药制剂转化为中药新药提供参考。

关键词： 黄曲霉毒素B1   共培养肝微球模型   圆弧偶氮酸   联合毒性   落新妇苷  

摘要： 近年来,粮食中多种真菌毒素共存污染产生的协同毒性风险日趋增加,引发全球广泛关注。圆弧偶氮酸（Cyclopiazonic acid,CPA）作为一种新兴毒素广泛污染花生、无花果、玉米等食品,与污染范围最广和毒性最强的真菌毒素——黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1,AFB1）存在共暴露途径,且有报道显示二者可能产生协同毒性。因此,研究AFB1和CPA的协同毒性评价及干预控制非常重要。目前,毒素的体外毒性评价依然以贴壁细胞模型为主,但贴壁生长的细胞与体内微环境差异较大,存在很多不足。而多细胞共培养所构建的评价模型,相比单一细胞更能模拟体内实际生理环境,提高毒素毒性评价的精准性。因此本论文构建并优化了一种共培养肝细胞微球模型,对比贴壁模型与肝微球模型的差异,选出更加贴近体内微环境、仿生性更高的评价模型;将其用于AFB1和CPA的毒性评价,发现CPA与AFB1的协同毒性作用及干预机制,应用落新妇苷干预对毒素协同毒性有较好的缓解效果,为毒素毒性评价和控制奠定基础。主要研究内容如下:1.构建新型无支架肝微球模型并将其应用于AFB1的毒性评价。选用肝实质细胞Hep G2、内皮细胞*** 926、星形细胞LX-2,通过细胞初始数量、细胞比例、培养时间等条件优化,构建三种不同的肝微球模型;以AFB1为研究对象,通过多项指标测试,对比肝微球评价模型的优势。结果显示,AFB1对贴壁细胞的细胞膜损伤显著（0.01μg/m L,24 h;p<0.01）,还可显著影响贴壁细胞的活性、增殖活力和氧化应激水平（1.0μg/m L,24 h;p<0.05）。相比之下,肝微球更不容易受到AFB1的影响。结合基因表达分析,发现肝微球的细胞色素P450酶和药物代谢酶活性都高于贴壁细胞,而且三种细胞共培养形成的肝微球更优于单种细胞形成的肝微球。因此,推断具有强肝功能和高代谢活性的共培养肝微球可以更好地自我调节以应对外来刺激引起的损伤,更加真实地模拟体内微环境,可作为后续毒性研究的评价模型。2.基于上述构建的共培养肝微球模型,研究AFB1和CPA的联合毒性效应及作用机制。根据AFB1和CPA单独暴露的毒性效果,选择了等毒性暴露和不同比例暴露两种模式刺激48 h,对AFB1及CPA的联合毒性进行研究。CI模型分析显示,AFB1+CPA的联合毒性受毒素剂量影响较大,而受浓度比例影响较小。在IC50比率下,AFB1和CPA在低剂量水平(<1/8 IC50)会产生协同作用,高剂量水平(>1/8 IC50)会转为拮抗作用。线粒体和活性氧（ROS）水平测试也得到了类似的联合效应趋势。基因表达分析显示,联合效应的转变可能与AKT基因及CPA的生物学活性有关。毒素刺激48 h,过表达AKT基因（13.28倍）的细胞活性即显著高于正常细胞（AFB1:3.06%,p<0.001;AFB1+CPA:3.36%,p<0.05）。3.利用代谢组学技术进一步分析AFB1和CPA作用于肝微球的代谢协同机制。基于前期实验,分别选择0.625μg/m L AFB1+3.125μg/m L CPA(1/16 IC50,协同)和5μg/m L AFB1+25μg/m L CPA(1/2 IC50,拮抗)两个剂量组合研究AFB1和CPA的代谢联合机制。结果显示,毒素组的代谢轮廓与对照组存在显著差异,且多种代谢物及代谢通路受到毒素影响。其中,低剂量的协同浓度点,乙醇胺、L-天冬氨酸等能量代谢物质代谢水平显著下调（p<0.001）,而高剂量的毒素还显著影响了抗氧化物质的代谢水平（p<0.01）。代谢通路富集也表明,各处理组的AFB1和CPA都对氨基酸代谢（丙氨酸、天冬氨酸、甘氨酸等）扰动较大,可能破坏胞内的氧化还原稳态。此外,含有CPA的毒素组扰乱了更多的代谢通路,还可能通过三羧酸（TCA）循环影响脂类和糖类代谢。4.探究落新妇苷干预对AFB1及其与CPA联合毒性的影响。在前期研究中发现,AFB1和CPA共暴露会影响胞内氧化还原水平,并产生协同毒性。因此,选用抗氧化活性提取物——落新妇苷,对AFB1和CPA的协同作用浓度点(1/16 IC50)进行干预。结果显示,落新妇苷有助于维持毒素暴露后的细胞活性,最高可将肝微球内的细胞抑制率降低9.36%（p<0.001）,且提前干预的效果不如与毒素同时共暴露。此外,落新妇苷还可提高联合给药组的胞内线粒体含量,促进能量代谢。抗氧化能力表现更显著,10μg/m L的暴露浓度即可显著降低毒素引起的胞内ROS水平上升（p<0.001）。代谢组学分析发现,落新妇苷干预影响了胞内的氨基酸代谢、糖代谢和脂代谢,使得其代谢轮廓与对照组更为接近。综上,本论文构建了一种共培养肝微球模型,并将其用于真菌毒素的毒性评价,提供了一种新型的仿生性更高的毒性评价模型。论文还探究了新兴真菌毒素C

关键词： 黄曲霉毒素B1   电化学发光   钙钛矿量子点   分子印迹技术  

摘要： 黄曲霉毒素(AFs)是一类由黄曲霉、寄生曲霉等产生的有毒次生代谢物,广泛存在于花生、玉米、豆类等多种重要农产品中。玉米及玉米油作为人类饮食中不可缺少的一部分,在种植和储存过程中很容易被AFs污染。毒性最强的亚型黄曲霉毒素B1(AFB1)由于具有严重的致癌性等对人类和动物健康造成了严重的危害。对此,探索合适的方法对玉米及玉米油中的AFB1进行超灵敏检测具有重要意义。电化学发光(ECL)是由高能电子转移反应后产生的激发态物质回到基态时放出光子的过程,凭借其超高的灵敏度和出色的可控性等优点逐渐在环境监测及食品安全检测等领域获得了广泛的关注。发光体在ECL技术中起着电光转换器的重要作用,在各种具有ECL活性的材料中,有机-无机卤化钙钛矿纳米粒子因其灵活的波长可调性和高的荧光量子产率等优异的光电性能成为极具潜力的ECL候选材料。然而钙钛矿的结构不稳定性以及在水环境下易降解的特性,极大程度上限制了对其ECL性质的研究与应用。因此,选择合适的弱极性溶剂作为检测环境,以此避免钙钛矿材料与水分的接触,或通过有效的封装材料对钙钛矿进行保护,提高其水稳定性成为了重要的解决策略。基于此,本论文工作合成了两种钙钛矿基复合材料,结合分子印迹技术构建了电化学发光传感器,并成功用于玉米油及玉米中AFB1的分析检测。本文的研究内容主要包括以下两个部分:(1)CHNHPbBrQDs@Si O电化学发光传感器检测玉米油中黄曲霉毒素B1通过一锅法制备了CHNHPbBr(MAPB)QDs@Si O纳米复合材料,以实现MAPB QDs的原位形成以及高效封装。在以乙酸乙酯为溶剂的有机电解液中,所合成的MAPB QDs@Si O表现出了良好的稳定性和明显增强的ECL响应,表明合适的弱极性溶剂及二氧化硅有效地保护钙钛矿量子点免受水分引起的降解,同时,封装策略也有效地提升了发光体在电极表面的负载能力。进一步结合能特异性识别目标分子并适应非水环境的分子印迹技术,构建了基于MAPB QDs@Si O的ECL平台,用于AFB1的超灵敏和高选择性定量检测,检测限为8.5 fg/m L。该传感器在实际玉米油样品中对目标物AFB1具有良好回收率,并与传统HPLC方法检测结果进行比较,无显著性差异的结果表明其在食品分析和公共卫生健康等领域具有潜在的应用前景。(2)CHNHPbBrQDs@ZIF-8电化学发光传感器检测玉米中黄曲霉毒素B1以金属有机框架ZIF-8作为封装基质,采用溶剂控制法制备了CHNHPbBr(MAPB)QDs@ZIF-8纳米复合材料,从而提升杂化钙钛矿量子点的长期稳定性。ZIF-8对钙钛矿量子点表面缺陷的钝化,提高了量子点的平均荧光寿命,同时实现了MAPB QDs@ZIF-8水稳定性及ECL性能的增强。结合高选择性的分子印迹技术,成功构建了基于MAPB QDs@ZIF-8的ECL传感器用于玉米中AFB1的定量。超低的检测限和良好的抗干扰能力证明了该平台的潜在应用价值,并拓宽了钙钛矿纳米材料在水环境中的分析应用。

关键词： 熔融沉积   3D打印   个性化   灵活性   银杏酮酯   穿心莲内酯   释放速率   掩味  

摘要： 3D打印技术是一种快速成型的增材制造技术,该技术已在汽车、机床、航空航天和医疗器械等领域的工业生产中得到广泛应用。近年来,3D打印技术在药物制剂领域的研究也愈发增多,体现出3D打印在个性化药物制剂制备方面的应用潜力。中药讲究因人因病调整制剂配伍及用量,这与个性化制药理念是相符的。但传统制剂工艺多为大批量生产,难以满足个性化需求。因此,3D打印技术用于个性化中药制剂制备可作为传统制剂工艺的一种有效补充手段。本论文主要分为四部分,综述部分总结了中药制剂现存的问题,概述了新型制剂技术在中药制剂领域的应用,并对3D打印技术制备中药制剂的前景进行了分析和展望。实验一进行了熔融沉积型3D打印技术制备不同释放速率的银杏酮酯片(3D-GBE50)的探索性研究。实验二利用熔融沉积型3D打印技术制备了具备不同缓释效果的穿心莲内酯片剂(3D-AGT)。实验三利用3D打印技术制备了不同释放速率的缓释型穿心莲内酯包封剂(3D-AGE)。实验一熔融沉积3D打印技术制备不同释放速率的银杏酮酯片剂(3D-GBE50)选用具有良好生物相容性和一定粘度的聚乙二醇和交联羧甲基纤维素钠作为制剂辅料,利用熔融沉积型3D打印技术制备了新型银杏酮酯(3D-GBE50)制剂。首先建立了直径为9.00 mm,高度为4.50 mm的圆柱体3D打印模型,进而根据优化的打印辅料配方,设计并打印制备了3种路径(同心圆,之字形和网格状),不同层高和不同填充间隙的3D-GBE50制剂,然后对打印制剂的形态、尺寸、化学性质和溶出度进行了充分的表征和考察。结果表明,3D-GBE50制剂外观光滑,纹理清晰,脆碎度达标,热稳定性好,化学性质稳定。此外,打印路径,层高和填充间隙这些设计参数对3D-GBE50制剂的释放速率都有直接影响。其中,之字形打印路径的3D-GBE50片剂溶出速率最快,而同心圆和网格状打印路径的3D-GBE50片剂的溶出速率都要慢于市售银杏酮酯片剂,且打印路径对制剂的释放机制影响较明显。除此之外,层高越高,填充间隙越宽,3D-GBE50片剂的溶出速率越快。表明熔融沉积型3D打印技术可以通过灵活调控打印参数进而调控药物释放活性,为个性化药物制剂制备提供了有效思路和解决方法。实验二3D打印技术制备不同缓释效果的穿心莲内酯片剂(3D-AGT)选择穿心莲内酯作为模型药物,利用熔融沉积型3D打印技术制备了缓释型穿心莲内酯(3D-AGT)片剂。首先对药用辅料及其配比和打印模型进行了筛选,选用了海藻酸钠和壳聚糖作为载药基质,且成功打印出四种配比的直径为10.00 mm,高度为3.00mm的六棱柱状3D-AGT片剂。然后对打印制剂的尺寸稳定性、重量差异、含水率、含量均匀性、含量差异率、孔隙率、溶胀率、化学结构、抑菌活性及溶出度进行了充分的表征和考察。结果表明,3D-AGT片剂外观光滑,质地柔软,但材料易失水使制剂尺寸稳定性稍差,重量差异符合药典相关规定,含药量较均匀,孔隙率差异较小,仅在盐酸溶液中具有溶胀性,化学性质稳定,具有抑菌活性。此外,不同辅料配比和不同溶出介质对3D-AGT片剂的释放速率存在一定程度影响。其中,海藻酸钠与壳聚糖配比为1:1的3D-AGT片剂的释放速率最慢,配比为2:1的片剂释放速率稍慢于配比为4:1的片剂的释放速率,在不同溶出介质中3D-AGT片剂的溶出行为差异较明显。除此之外,不同配比的3D-AGT片剂在不同p H溶出介质中的溶出速率均慢于市售穿心莲内酯片剂。这表明熔融沉积型3D打印技术可以通过调整药用辅料配比进而调控药物释放行为,为制备个性化中药制剂提供了新思路及研究依据。实验三3D打印技术制备不同释放速率的穿心莲内酯包封剂(3D-AGE)为了制备具有掩味性的不同释放速率的穿心莲内酯制剂,本研究设计了不同尺寸的外壳模型,利用熔融沉积型3D打印技术制备了具有多种载药量的穿心莲内酯(3D-AGE)包封剂。选择海藻酸钠与壳聚糖作为包封剂外壳的制备材料,调整材料配比增加外壳硬度得到具有可组装性的包封剂外壳。根据优化的材料配方,筛选包封剂外壳模型,调整载药量,成功制备了两种尺寸的具有不同载药量的六棱柱状3D-AGE包封剂。然后对打印制剂的尺寸稳定性、剂量准确性、孔隙率、化学结构、抑菌活性及溶出规律进行了表征和考察。结果表明,3D-AGE包封剂外观光滑,质地柔软,封装严密,剂量准确,外壳材料和原料药的化学结构稳定,具有抑菌活性,但在组装过程中包封剂外壳拉伸从而使其尺寸与设计模型存在细微出入。体外溶出实验结果表明不同尺寸的打印外壳对3D-AGE包封剂的释放速率影响较为明显,其中外壳底部越薄释放速率越快,但材料配比与载药量对释放速率几乎无影响。另外,3D-AGE包封剂的溶出速率均慢于市售穿心莲内酯包封剂。最终3D-AGE包封剂的口感测试表明3D打印包封制剂的可接受度较高。这表明熔融

关键词： 丁酸梭菌   肠道上皮细胞毒性   保护作用   黄曲霉毒素B1   呕吐毒素  

摘要： 黄曲霉毒素B1（AFB1）和呕吐毒素（DON）是天然普遍存在的真菌毒素，会污染大多数的食物和动物饲料，引发肠道疾病和免疫抑制。在自然环境下，真菌毒素往往以复合毒素的形式存在，本研究选择AFB1和DON二元复合毒素作为对象展开研究。使用传统的脱毒方法处理食品和饲料产品中的真菌毒素时会产生一些副作用，如化学试剂的残留、营养物质的流失等。因此，迫切需要寻找一种新的解毒方法来控制因真菌毒素污染所造成的经济损失。目前研究发现丁酸梭菌具有益生作用，可以提高细胞活性、减轻炎症及增强肠道屏障等。由于肠上皮是抵抗外界环境的第一道防线，所以本研究选择猪肠上皮细胞IPEC-J2和人结肠腺癌细胞Caco-2作为研究对象。　　本研究使用不同的毒素浓度处理细胞24h：0.1μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL。结果表明，AFB1和DON都能降低肠上皮细胞的细胞活性且具有浓度依赖性。通过计算IC50值，得到AFB1和DON联合作用时的比例：IPEC-J2细胞为AFB1:DON=16:1;Caco-2细胞为AFB1:DON=7:1。使用AFB1和DON联合分别处理肠上皮细胞IPEC-J2和Caco-2，发现AFB1和DON具有协同作用，能够显著降低细胞活性。随后，将丁酸梭菌与细胞共培养后加入真菌毒素刺激。结果发现丁酸梭菌能够缓解真菌毒素的毒性，提高细胞活性。为了探究在肠上皮细胞中，丁酸梭菌缓解AFB1和DON联合毒性的保护机制，本研究使用转录组（RNA-seq）分析。通过对转录组测序结果，进行PCA分析、差异分析和PPI网络分析;发现丁酸梭菌对AFB1和DON的缓解作用，与细胞黏附分子、细胞骨架、细胞连接、线粒体相关基因、Ras信号通路有关。同时对转录组数据的DEGs进行筛选，探究丁酸梭菌缓解过程中的关键受体。从筛选得到的受体中，选择G蛋白偶联受体39（GPR39）和胰岛素样生长因子-1受体（IGF1R）进行验证。发现PPP（IGF1R抑制剂）能有效地阻止丁酸梭菌对真菌毒素的缓解作用，即抑制IGF1R受体表达会导致丁酸梭菌缓解功能的丧失。因此，推测IGF1R受体是丁酸梭菌缓解真菌毒素毒性的关键受体。本研究不仅为丁酸梭菌作为益生菌食品的应用提供了新的理论依据，而且为丁酸梭菌作为微生物制剂及动物饲料添加剂的广泛应用奠定了基础。

关键词： 鸭   黄曲霉毒素B1   肝毒性   解毒   谷胱甘肽巯基转移酶  

摘要： 黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1,AFB1）是已知毒性最强的霉菌毒素,给畜禽生产造成极大威胁。AFB1主要在肝脏中代谢,其主要在细胞色素酶P450家族（Cytochrome P450 enzymes,CYP450s）的作用下转化为剧毒的AFB1-外8,9-环氧化物（AFB1-8,9-exo-epoxide,AFBO）和其它弱毒或无毒的代谢产物。同时,AFBO可以在谷胱甘肽巯基转移酶家族（Glutathione S-transferase,GSTs）的催化下与谷胱甘肽（glutathione,GSH）结合生成无毒的AFBO-GSH,进而达到解毒的效果。研究表明在不同物种中参与AFBO解毒的关键GSTs亚型是不同的,雏鸭是对AFB1最为敏感的动物,然而,其体内解毒AFB1的关键GSTs尚未鉴定。 本试验通过直接合成或从鸭肝c DNA中克隆的方式得到了NCBI中报道的10种鸭肝中不同的GSTs CDs片段（GST、GST3、GSTM3、MGST1、MGST2、MGST3、GSTK1、GSTT1、GSTO1和GSTZ1）,并将它们同源重组到超表达载体pc DNA3.1（+）上;然后,将不同的pc DNA3.1（+）-GSTs质粒转染至鸭原代肝细胞进行超表达;之后,对超表达不同pc DNA3.1（+）-GSTs质粒的鸭原代肝细胞进行AFB1攻毒,测定攻毒后的细胞活率、细胞培养液中的乳酸脱氢酶（Lactate Dehydrogenase,LDH）活性和细胞中的AFBO-GSH含量;最后比较了不同物种的GSTs氨基酸序列和结构域,进一步确定了雏鸭肝脏中参与AFB1代谢的关键GSTs基因。 研究结果如下: 1)成功构建了鸭原代肝细胞GSTs超表达模型 将克隆或合成得到的10个GSTs的DNA序列片段同源重组至pc DNA3.1（+）上,pc DNA3.1（+）-GSTs的测序结果表明,与NCBI数据库中的原始序列对比,克隆或合成的10种不同亚型GSTs的DNA碱基和蛋白质氨基酸序列与NCBI报道的序列分别有99.5%-100%和99.1%-100%相似性。转染pc DNA3.1（+）-GSTs的鸭肝原代细胞培养24h后,细胞中相应GSTs的m RNA表达水平能够提高1.92-3274.69倍。 2)鉴定了解毒AFB1致鸭原代肝细胞毒性的关键GSTs 与对照组相比,75ng/m L和150ng/m L的AFB1可使鸭原代肝细胞活率分别降低约30%和50%（p<0.05）,细胞培养液中的乳酸脱氢酶活性显著升高约25%-50%（p<0.05）。值得注意的是,超表达GST和GST3的鸭原代肝细胞可以有效拮抗AFB1诱导的上述指标的变化,且可以显著提高细胞在75ng/m L的AFB1作用下后AFBO解毒产物AFBO-GSH含量（p<0.05）。然而,超表达其它GSTs基因的鸭原代肝细胞均未能缓解AFB1诱导上述指标在鸭原代肝细胞中的变化。 3)多重比较了不同物种GSTs氨基酸序列和蛋白结构域 将鸭的10种不同的GSTs亚型氨基酸序列与其它五种动物（***,***,***,***,***）体内发挥解毒AFB1关键作用的GSTs亚型的氨基酸序列进行了比对。结果发现鸭的GST和GST3蛋白分别与在火鸡中发挥解毒AFB1毒性的关键GSTA3和GSTA4蛋白具有83.0%和87.3%氨基酸序列一致性和完全相同的结构域,进一步证实了鸭肝脏中GST和GST3具解毒AFB1代谢活性。 综上所述,本试验研究结果显示,GST和GST3基因在鸭肝脏解毒AFB1代谢过程中发挥关键作用。

关键词： 黄曲霉毒素B1   壳寡糖   肝损伤   RNA-Seq   细胞凋亡   抗氧化  

摘要： 黄曲霉毒素B1（Aflatoxin,AFB1）是毒性很强的真菌毒素,可以导致人类或动物肝脏损伤,甚至可引发肝癌。机体暴露于AFB1的污染源主要是农作物及其加工产品,严重威胁人类及动物的健康。来源于天然物质的壳寡糖（Chitooligosaccharide,COS）具有较好的抗氧化、抗肿瘤和提高免疫力等特性,而且极易溶于水,能被机体较好的吸收。关于COS生物特性的研究很多,但关于预防AFB1致肝脏急性损伤的研究较少。本论文主要分为两大部分:第一部分探究AFB1单次急性暴露后对大鼠肝脏的持续性影响,及对基因的影响;第二部分通过第一部分研究的结果确定动物模型的建立方法,探究COS对AFB1引起的急性肝损伤的干预效果,及被调控基因的功能作用。具体方法及结果如下:（1）从表型层面探究单次注射1（LA组）和2 mg/kg AFB1（HA组）后,继续正常饲养2天（LA-2d和HA-2d组）和7天（LA-7d和HA-7d组）,对大鼠肝脏持续性影响。通过分析实验期间大鼠体重变化,肝脏系数和病理变化,肝功能指标,抗氧化酶SOD和GSH-Px活性,脂质过氧化物MDA含量和细胞凋亡率分析AFB1对肝脏的影响。结果表明:与空白对照组（CK组）相比,模型组（LA-2d、LA-7d、HA-2d和HA-7d组）肝功能指标、肝脏内MDA含量和肝细胞凋亡数目均在造模后第2天上升到最高后有恢复到正常水平的趋势。但肝脏系数在造模后第7天变化最显著,肝脏病理学切片显示造模后第7天肝脏损伤并没有减轻,抗氧化酶GSH-Px和SOD活性造模后第7天降到最低。由此可知,AFB1急性单次暴露对大鼠肝脏具有持续性损伤作用。（2）基于RNA-Seq技术研究了单次注射1和2 mg/kg AFB1后对大鼠肝脏基因的影响。通过分析测序数据,发现模型组基因与CK组比较后,显著性差异表达基因（Differentially Expressed Genes,DEGs）分别有1246,356,2354和855个。LA-2d和HA-2d的DEGs主要富集与糖类、脂质和氨基酸代谢相关通路,而LA-7d和HA-7d的DEGs仅主要富集于四条通路,与细胞周期调节,炎症反应和氧化反应等相关。DEGs中与肝癌细胞增殖、分化、转移相关的Lama5和Gtse1基因以及和炎症反应相关的Fabp4基因在模型组中均是高表达,Bcl6基因在造模后第7天组中高表达,而且表达量高于造模后第2天组。由此可知,AFB1急性暴露会引起大量基因失调,但随着影响时间的延长,仅三分之一的基因仍具有显著性差异,通过对它们的功能进行分析,可以得出AFB1单次急性暴露会持续影响并与肝脏疾病相关的基因。（3）通过DPPH法检测COS的抗氧化活性以及采用单剂量注射1 mg/kg AFB1建立大鼠急性肝损伤模型探究COS对AFB1引起的急性肝损伤干预效果。通过分析实验期间大鼠体重变化,肝脏系数和病理变化,肝功能指标,抗氧化酶SOD和GSH-Px活性,脂质过氧化物MDA含量和细胞凋亡率分析COS的干预效果。结果表明:COS具有较强的自由基清除能力,抗氧化活性较高。COS预处理可以从提高抗氧化酶活性、抑制肝细胞凋亡等方面抑制AFB1引起的急性肝损伤。（4）基于RNA-Seq技术探究COS预处理对AFB1急性暴露肝脏基因表达及功能的影响。通过分析测序数据,发现AFB1和HCOS组基因与对照组比较后,DEGs分别有1059和52个;HCOS组与AFB1组比较有965个DEGs。通过KEGG富集分析发现这些基因多富集在代谢,氧化,和细胞周期调节等通路上。由此可知,COS干预可以降低AFB1对肝脏基因的影响,可以降低AFB1诱导引起的肝脏基因功能的变化。综上所述,从表型和基因型层面分析,AFB1单次急性暴露会引起肝脏持续性损伤,DEGs数目和功能也与AFB1剂量以及影响时间相关,并且通过分析持续性被影响的基因可以发现能够治疗肝脏疾病的潜在基因。COS对AFB1引起的急性损伤具有较好的干预效果。干预机制可能为COS能够缓解AFB1引起的肝脏代谢紊乱,氧化应激反应和肝细胞大量增殖。

关键词： 中药提取物   抑菌   模拟瘤胃   替抗   瘤胃微生物  

摘要： 随着集约化农牧业的发展,动物感染各种病菌的机率大大增加。畜牧业生产中,抗生素在预防、治疗家畜疾病、促生长等起到重要作用,但长期使用抗生素会导致动物机体免疫力下降、病原性细菌耐药性上升、肠道菌群失调,其负面效应日益显现。在国家以及全球提倡畜牧业领域禁止使用抗生素的背景下,寻找抗生素替代品的难题迫切摆在人们面前。中草药作为自然界的天然瑰宝,具有抗菌、抗病毒、促生长、提高免疫力和抗氧化性等功效,而且具有低毒性、对病菌不产生耐药性等优势,是抗生素的最佳替代品。本研究对西北主要七种中药材进行有效成分提取,通过体外平板筛选有效抑菌成分,对所筛选成分进行模拟瘤胃抑菌分析,同时观察对微生物区系的影响,最后探讨其抑菌机理,得出中药提取物对畜牧业常见病菌的抑菌功效,为中药材在畜牧业的推广应用提供基础。具体研究结果如下:1.中药有效成分的提取试验选取当归、党参、黄芪、板蓝根、大黄、黄芩和甘草七种西北主要中药材,对其药用部位进行成分分析并提取。提取物包括醇提物、水提物、多糖类、皂苷类和黄酮类。中药成分结果显示,七种中药活性成分可归为10大类,其中黄酮类和酚类为主要类别;依据中药成分进行聚类分析,结果显示七种中药按照成份相似度分为四类,当归、甘草各为一类,大黄和黄芩聚集为一类,党参、板蓝根和黄芪聚集为一类。对中药乙酸乙酯萃取物含量进行分析,大黄乙酸乙酯萃取物中有五种主要成分,其中大黄酸和黄芩苷含量最多;黄芩乙酸乙酯中主要成分为黄芩苷和黄芩素,其中绝大多数为黄芩苷;甘草乙酸乙酯中有四种主要成分,其中甘草酸单铵和黄芩苷含量最多;黄芩苷在三种中药乙酸乙酯萃取物中均被检测到。2.中药有效成分体外抑菌效果试验选取大肠杆菌(CMCC44102)、金黄色葡萄球菌(CMCC26003)、沙门氏菌(CMCC50041)和巴氏杆菌(CVCC393)四种畜牧业生产中常见的致病菌,利用所选中药材的水提液、醇提液、醇提正丁醇萃取部位、醇提乙酸乙酯萃取部位以及不同中药乙酸乙酯萃取部位配伍对其进行平板抑菌效果分析。试验结果表明,水提液中大黄对四种病菌均表现抑制效果;党参对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌表现抑制效果;黄芩对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌表现抑制效果。醇提液中大黄对四种病菌均有抑制效果;党参和黄芩对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和巴氏杆菌有抑制效果;甘草对对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌有抑制效果。大黄、黄芩、党参和甘草萃取获得的中药粗多糖对四种病菌均无抑菌效果,而乙酸乙酯萃取部位抑菌效果优于正丁醇部位,且乙酸乙酯萃取部位抑菌效果均明显优于所选中药的水提物和醇提物。对大黄、黄芩、党参和甘草四种中药乙酸乙酯部位配伍进行抑菌分析,结果表明大黄和甘草乙酸乙酯配伍抑菌效果最佳。3.添加中药模拟瘤胃抑菌研究瘤胃是反刍家畜消化道的第一个消化器官,是一个比较大的厌氧“发酵罐”,家畜饲喂中药或提前物后,首先进入瘤胃,由于瘤胃复杂的内环境,且富含瘤胃微生物,对中药的抑菌功效会产生与体外有所不同。因此,试验选取前述体外平板抑菌筛选出的抑菌效果较好的大黄乙酸乙酯部位、黄芩乙酸乙酯部位、大黄甘草乙酸乙酯部位,在体外模拟瘤胃环境中接种大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌,探究不同浓度中药提取物对所接病菌菌落数和瘤胃微生物组成的影响。菌落计数结果表明,模拟瘤胃环境下,除接种金黄色葡萄球菌时添加大黄甘草乙酸乙酯部位外,其他所选中药提取物在接种三种病菌时均在较低浓度处理下反而比高浓度有更好的抑菌效果;三种病菌在瘤胃环境中生长状况不一,大肠杆菌和沙门氏菌菌落数均明显多于金黄色葡萄球菌,表明金黄色葡萄球菌在瘤胃液中比较容易受到抑制。瘤胃液微生物测序分析结果表明,在接种大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌的瘤胃液中添加大黄、甘草和黄芩乙酸乙酯部位后瘤胃液菌群出现聚类,并与对照组明显区分,但各中药添加组间没有明显区分。在细菌属水平上,在瘤胃液中添加黄芩乙酸乙酯萃取物提高了普雷沃氏菌属(Prevotella)的相对丰度,添加大黄和甘草乙酸乙酯萃取物降低了理研菌科RC9肠道群(Rikenellaceae＿RC9＿gut＿group)等纤维降解菌的相对丰度。4.添加中药在模拟瘤胃不同发酵时间的抑菌效果前述研究结果表明在瘤胃液中中药活性成分浓度过高反而对抑菌效果呈负面作用。根据筛选的中药提取物适宜体外模拟瘤胃抑菌浓度,设置不同浓度梯度,分别接种大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌,在不同发酵时间取样分析抑菌效果以及对瘤胃微生物组成的影响。同时设置不同的病菌及中药添加程序,进一步筛选最适的瘤胃中药抑菌方案。结果表明,100～200 mg/m L的大黄水提液对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌均有抑制作用;浓度为0.2 mg/m L的黄芩乙酸乙酯能够在多次添加后,对大肠杆菌表现较好的抑制效果。瘤胃微生物测序结果表明添加100 mg