关键词：
玉米青贮
黄曲霉毒素B1
污染调查
瘤胃模拟技术
高通量测序
瘤胃内环
摘要：
河南地处中原,是农业大省,也是畜牧业大省。近年来随着国家利好政策的支持,牛羊产业发展非常迅速,牛羊饲养量已成为畜牧产业发展的重要支撑,连续多年居全国前列。饲草料原料是草畜业发展的物质基础,全株玉米青贮饲料占奶牛日粮比重的60%～70%,其质量直接影响着奶牛生产性能（增重、增产、繁殖率等）与奶牛健康。黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1,AFB1）是饲料中常见的霉菌毒素,影响奶牛健康和牛奶质量,造成奶牛业养殖损失,并且伤害犊牛危害人类健康。为了解河南省玉米青贮AFB1污染情况,及其对奶牛瘤胃内环境的影响,为奶牛生产及疾病防控提供参考。课题组于2020年10月至2021年10月,连续两年从河南省5个地区15个市的200余家奶牛场采集全株玉米青贮饲料样品200余份,采用酶联免疫吸附法检测AFB1的含量,并利用双外流人工瘤胃模拟系统和宏基因组测序方法,研究AFB1对瘤胃内环境的影响。2020年、2021年河南省玉米青贮AFB1污染情况调查结果显示,河南省不同区域的黄曲霉毒素B1检出率略有差异,各地区黄曲霉毒素B1检出平均值低于限量值30μg/kg,但各区域检出比例较高,且最高值超出限量值3倍;2020年调查结果显示:河南省全株玉米青贮样品检出率为65.14%,样品超标率为4.59%;河南省不同地区样品检出率和超标率差异显著（P<0.05）,5个地区的检出率豫西36.84%、豫中57.89%、豫南58.33%、豫北75.00%、豫东92.30%,样品超标率豫西0%、豫南0%、豫中5.26%、豫北6.81%、豫东7.69%;2021年调查结果显示:河南省全株玉米青贮样品检出率为97.16%,样品超标率为0;河南省不同地区样品检出率不显著（P>0.05）,5个地区的检出率豫北95%、豫中95%、豫东100%、豫西100%、豫南100%,检出率均较高,样品超标率均为0。这两年调查结果表明:河南省5个地区奶牛场青贮饲料AFB1污染范围分布广泛,但总体污染程度较轻,其中豫东、豫北、豫中这3个地区污染相对较为严重。利用体外人工瘤胃模拟技术和宏基因组测序方法,研究添加不同浓度的AFB1日粮对荷斯坦奶牛瘤胃内环境的影响。试验采用平衡的5-5拉丁方法设计5个不同浓度黄曲霉毒素B1日粮组,分5个周期,每个周期培养10天,在早晚投喂前,分别采集各人工瘤胃发酵罐内接种3天、8天、9天、10天的发酵液两份,一份用于其pH值测定和原虫计数,另一份﹣20℃冻存测氨态氮浓度和提DNA进行宏基因测序。对样品pH值测定、原虫技术、氨态氮浓度测定和16S r RNA V3-V4区及18S r DNA V4区宏基因组测序分析,结果表明:1)AFB1对瘤胃理化指标造成一定的影响,AFB1日粮添加各组pH值低于空白对照组,AFB1日粮添加各组间pH值变化差异不显著（p>0.05）,说明AFB1的添加降低了瘤胃的pH值,使瘤胃的酸度增加;人工瘤胃模拟技术对样品的氨态氮浓度有着显著的影响（P<0.05）,空白对照组样品的氨态氮浓度先下降后上升,总体呈上升趋势;添加AFB1组的氨态氮浓度与未添加AFB1组差异不显著（p>0.05）,使氨态氮浓度降低的主要因素是人工瘤胃体外模拟技术。2)AFB1对瘤胃内部分微生物造成了显著影响,试验组与空白对照组相比分类＿普雷沃氏菌科、未分类＿拟杆菌目和未分类＿厚壁菌门的相对丰度显著降低（P<0.05）,未分类＿变形菌门的相对丰度显著上升（P<0.05）,试验组与空白对照组相比瘤胃原虫数量显著降低（P<0.05）,AFB1能够抑制瘤胃原虫侧口纲和瘤胃壶菌属真菌的生长,促进枝梗鞭菌属真菌的生长,添加不同浓度的AFB1日粮各组相比瘤胃内微生物种群的变化差异不显著（p>0.05）,总体呈AFB1浓度越高影响越大。3)人工瘤胃模拟技术对瘤胃内细菌种群结构的影响显著,空白对照组与原瘤胃液相比,厚壁菌门、变形菌门及迷踪菌门的相对丰度显著降低（P<0.05）,拟杆菌门、疣微菌门和黏胶球形菌门的相对丰度显著上升（P<0.05）,真核生物的优势物种发生显著变化,瘤胃真菌相对丰度处于高水平,瘤胃原虫处于低水平。4)随体外人工瘤胃培养时间的延长,人工瘤胃内微生物种群结构发生变化,瘤胃原液与体外培养3天、8天、9天、10天相比梭状杆菌的相对丰度显著降低（P<0.05）,未分类＿拟杆菌门、密螺旋体属、Candidatus＿Endomicrobium的相对丰度显著上升（P<0.05）,丁酸弧菌属的相对丰度先下降后上升,新美鞭菌门的相对丰度显著降低（P<0.05）。5)添加不同AFB1浓度日粮各组相比,AFB1能够显著降低（P<0.05）人工瘤胃内拟杆菌门内细菌的相对丰度,导致瘤胃水解蛋白的能力降低;人工体外培养时间的延长能显著提高（P<0.05）人工瘤胃内丁酸弧菌属、拟杆菌门内
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