关键词：
DNA水凝胶
传感器
铅离子
尿嘧啶-DNA糖基化酶
黄曲霉毒素B1
摘要：
脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)不仅是生命体内遗传信息的载体,而且是构筑材料的理想元件。DNA丰富的功能结构为制备智能响应材料提供了可能。DNA具有可精准编程性、特异性好、识别能力强、生物相容性好、易于合成和修饰、兼具生物功能等特点,吸引了众多领域的研究工作者。此外,DNA基于碱基互补配对原则可以构筑不同形状的纳米结构和块体材料。DNA水凝胶是DNA组装块体材料的典型代表,在传感、医学诊断与治疗、组织工程等领域具有重要的应用价值。针对目前基于DNA水凝胶检测中存在水凝胶用量大以及需要包覆信号分子的问题,构建简单、灵敏、成本低、便携的传感器为DNA水凝胶在即时检测(point-of-care testing,POCT)方面的应用提供了可能。同时,利用生物技术快速制备大量DNA是构建DNA水凝胶的经济高效途径,为构建易制备、价格低廉的传感技术提供了基础。本文将DNA水凝胶与毛细管相结合,利用DNA水凝胶基于孔径的分离性能,构建了铅离子(lead ion,Pb2+)、尿嘧啶-DNA糖基化酶(uracil-DNA glycosylase,UDG)响应的可视化传感装置。此外,利用滚环扩增(rolling circle amplification,RCA)技术制备了 DNA水凝胶微球,并结合荧光成像技术,构建了黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1,AFB1)的检测方法。具体工作如下:(1)利用毛细管的毛细作用和DNA水凝胶的靶标响应性,构建了一种基于DNA水凝胶的毛细管传感装置。首先,我们制备了聚丙烯酰胺-DNA水凝胶,Pb2+辅助的脱氧核酶(deoxyribozymes,DNAzymes)在水凝胶中起交联和响应作用。基于DNA的变性与复性性质,通过加热使水凝胶变为溶胶状态,利用毛细管的毛细作用将水凝胶封堵在毛细管的末端。将毛细管水凝胶一端水平浸入到待测溶液中,溶液中存在的Pb2+能够激活DNAzyme并使交联的DNA链发生断裂,进而使水凝胶的孔径增大,溶液将以更快的速度进入毛细管。通过记录管内溶液的距离和反应时间,即可实现对Pb2+浓度的可视化检测。此装置所需要的DNA水凝胶量极少,且不需要包覆任何物质。此外,该传感器具有制备成本低、操作简单、便携、通用性好且灵敏高等优点,在食品安全、环境监测和分子诊断等方面具有潜在的应用前景。(2)交联链的浓度会影响水凝胶的孔径,进而使水凝胶的分离性能不同。基于此,我们利用毛细管构建了基于DNA水凝胶的UDG传感装置。我们先将UDG与底物链在液相中进行反应。然后,利用UDG处理后的DNA链制备水凝胶。相对于未被处理的体系而言,UDG处理的底物链被切割,制得的水凝胶的孔径更大,孔洞更多。借助毛细管对不同体系水凝胶的分离性能进行检测,通过读取管中溶液的长度即可实现对UDG活性的定量检测。该方法解决了酶与水凝胶体系响应速度慢的问题,实现了基于DNA水凝胶对生物大分子的可视化检测。而且,本方案具有操作简单、灵敏度高、便携且通用等优点,在即时检测、临床诊断和药物筛选等领域具有重要意义。(3)利用恒温滚环扩增技术制备DNA水凝胶微球,结合荧光成像技术构建了一种简便的AFB1传感方法。滚环扩增技术制备DNA水凝胶微球的过程非常简单,同时微球具有类似鸟巢结构,比表面积大、反应位点多。我们以DNA水凝胶微球作为载体,在其表面通过碱基杂交连接荧光探针修饰的适配体。当体系中存在AFB1时,适配体与AFB1特异性结合并从微球表面脱落。随着AFB1浓度的增大,微球的荧光强度逐渐降低。通过检测微球的荧光强度,即可实现对AFB1浓度的检测。此外,通过合理地设计核酸序列,该方法可能扩展到对一个样品中多靶标分子的同时检测。在检测过程中,仅需将微量样品与微球溶液混合即可。因此,本方案具有操作极其简单,耗时短、灵敏度高等优点,在小体积检测、食品安全、环境监测和医学诊断方面具有潜在的应用价值。
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