关键词： 黄曲霉毒素B1   鼠李糖乳杆菌   嗜酸乳杆菌   蒙脱石   炎性反应   氧化应激   肠道菌群  

摘要： 黄曲霉毒素B1（AFB1）是一种次级真菌代谢产物,广泛存在于食品、饲料原料中,由于其半衰期长、毒性强以及致癌特性,被认为是全球范围内的公共卫生问题。虽然乳酸菌已被证明可以通过调节肠道微生物群的平衡降解AFB1,但却忽略了大多数乳酸菌在宿主体内定植能力差、存活时间短的问题。蒙脱石（MMT）是一种硅酸盐粘土,不仅可以吸附AFB1,还可以作为乳酸菌载体粘附在组织表面,使乳酸菌的定植能力提高,存活时间延长,并重新塑造宿主微生物生态系统,达到预防、治疗的目的。目前,关于乳酸菌与粘土矿物联合降解AFB1的报道较少。我们在前期的预实验中发现,当鼠李糖乳杆菌（LGG）(2×10～9cfu/m L)、嗜酸乳杆菌（LAC）(2×10～9cfu/m L)分别与0.5 mg/kg的MMT联合治疗时,可以有效缓解AFB1导致的小鼠肝损伤。因此,本研究选取浓度为2×10～9cfu/m L的LGG、LAC和0.5 mg/kg的MMT,围绕以下两个试验目的展开研究:（1）建立AFB1诱导的小鼠模型,采用LGG、LAC和MMT进行干预,明确LGG/LAC-MMT联合应用是否可以改善AFB1暴露的组织损伤。（2）LGG/LAC-MMT联合应用是否通过提高乳酸菌的定植使小鼠肠道微生物群达到平衡,从而缓解AFB1所致的组织损伤。本试验将80只4周龄健康雄性Balb/c小鼠,随机分为八组,用AFB1（400μg/kg）、LGG（2×10～9cfu/m L）、LAC（2×10～9cfu/m L）、MMT（0.5 mg/kg）灌胃4周后,结束试验。并对小鼠体重进行统计,剖检观察肝脏、肠道组织病理变化;使用全自动生化分析仪检测血清肝功、肾功指标;荧光定量PCR检测肝脏炎性因子表达量;ELISA检测肝脏、肠道氧化应激指标以及血清炎性因子变化;16S r RNA扩增子测序技术检测盲肠内容物菌群变化。结果表明:AFB1诱导小鼠肝脏、肠道组织出现明显病变,肝细胞肿胀、坏死,空肠粘膜上皮细胞明显脱落;血清肝功指标AST、ALT、ALP、CHE、TBIL、DBIL和IBIL含量极显著上升（P<0.01）;血清肾功指标,BUN、CR和UA含量极显著升高（P<0.01,P<0.001,P<0.01）;血清炎性因子IL-1β、TNF-α和IL-10含量极显著升高（P<0.001）;肝脏组织脂质过氧化物产物MDA含量极显著升高（P<0.001）,抗氧化酶SOD、CAT、GSH和GR活性显著降低（P<0.05）;肠道组织脂质过氧化物产物MDA含量、抗氧化酶SOD和GSH活性极显著升高（P<0.01）;肝脏组织炎性因子IL-1β、TNF-α、IL-10、IL-2和IL-8 m RNA表达量极显著升高（P<0.01）;盲肠内容物菌群丰度和多样性显著下降（P<0.05）;粪便中LGG/LAC-MMT联合应用治疗组AFB1含量显著升高（P<0.01）。然而,添加LGG、LAC和MMT都不同程度的逆转了AFB1导致的上述指标变化,但LGG/LAC-MMT联合应用效果更加显著,其中LAC-MMT联合应用可以显著缓解AFB1诱导的小鼠组织损伤、炎性损伤以及氧化损伤程度。综上所述,AFB1暴露可导致肝脏、肠道组织损伤,炎性因子增加,肠道菌群紊乱。虽然LGG、LAC和MMT均可以不同程度减轻AFB1诱导的肝脏、肠道损伤、减少炎性因子的表达以及调节肠道菌群,但LGG/LAC-MMT联合应用具有更好降解AFB1毒性的潜力,其中LAC-MMT联合应用效果更加显著。说明LGG/LAC-MMT联合应用提高了乳酸菌的定植能力,使小鼠肠道菌群结构发生变化,从而缓解AFB1所致的肝脏、肠道损伤。同时也说明,乳酸菌与MMT的联合应用可以作为复合剂来降低霉菌毒素的毒性。

关键词： 黄曲霉毒素B1   纳米抗体   融合表达   荧光共振能量转移   生物发光共振能量转移   均相免疫分析  

摘要： 黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1,AFB1）是由黄曲霉（Aspergillus flavus）和寄生曲霉（Aspergillus parasiticus）产生的有毒次级代谢产物,主要污染玉米、花生、棉籽、大米等农作物产品,是毒性最强的真菌毒素之一,对人体和动物机体可产生肝毒性、致畸性、致癌性等多种毒害作用。一般针对真菌毒素采用的检测方法操作复杂繁琐、所需的成本较高且耗时耗力等,因此建立一种高效、快速且简便的方法用于农作物产品中AFB1的检测具有重要意义。基于荧光均相免疫分析方法具有快速简便、灵敏度高等优点。荧光共振能量转移（Fluorescence resonance energy transfer,FRET）或生物发光共振能量转移（Bioluminescence resonance energy transfer,BRET）技术为实现纳米尺度的距离变化提供了快速、灵敏的检测,将其与免疫学分析结合运用于真菌毒素的检测将是一种高效的手段。FRET中荧光蛋白（Fluorescent protein,FPs）和量子点（Quantum Dot,QD）作为荧光探针,前者可通过基因编码获得且可作为抗体的融合伴侣、光稳定性好,后者因其斯托克斯位移大、发射光谱窄等特殊的光学性质均获得广泛应用;BRET中供体发色团是一个生物发光分子,属于酶催化底物发光,其中纳米荧光素酶（Nano Luciferase,Nluc）是目前已知最小荧光素酶之一,因发光强度高、稳定性好等而备受关注。供体与受体两个荧光团分子间的距离必须在10 nm内才能发生FRET或BRET,且荧光分子团的光学稳定性及荧光量子产率等是影响FRET或BRET的关键因素。本研究采用抗AFB1纳米抗体（G8）作为识别元件,以绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein,GFP）、Nluc、红色荧光蛋白（Red fluorescent protein,Tag RFP）、QD等荧光分子团作为发光供体或受体,研究不同形式的纳米抗体与荧光或发光蛋白的融合表达对于识别和荧光性能的影响,探索不同的供受体配对形式和条件对能量转移效率的影响,并尝试利用纳米抗体与AFB1间的特异性识别能力,建立一种荧光均相免疫分析检测AFB1的方法。主要研究内容如下:（1）对抗AFB1纳米抗体与荧光分子融合表达形式进行了研究。通过基因工程技术将抗AFB1纳米抗体的单价及多价串联体,分别与GFP编码片段融合并克隆至原核表达载体pET30a,抗AFB1单价纳米抗体与Nluc编码片段融合克隆至原核表达载体pET22b,经大肠杆菌表达系统获得融合蛋白G8-GFP、DiG8-GFP、Tri G8-GFP和G8-Nluc,通过亲和层析纯化,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析结果表明四种融合蛋白均为可溶性表达,表达量分别为6.0、7.5、4.0、2.7 mg/L。采用酶联免疫吸附法（Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA）和光谱扫描法对融合蛋白的识别活性及荧光特性进行了测定。结果显示,未融合蛋白（G8）、融合蛋白（G8-GFP、DiG8-GFP）的半抑制浓度(IC50)分别为12.10、14.10、2.19 ng/mL,表明单价重组蛋白的IC50值与未融合蛋白相似,而双价重组蛋白的IC50值与之相比提高了5.5倍;融合蛋白G8-Nluc的IC50值为1.39 ng/mL,与未融合G8相比提高了8.7倍;三价融合蛋白Tri G8-GFP表现出与抗原的结合活性,但AFB1的阻断活性较差;融合后GFP的荧光强度表现为:双价>单价>三价,融合后的Nluc催化底物腔肠素（Coelenterazine H,CTZ-H）仍表现出较强的发光性质。（2）对能量转移的供受体配对进行了研究。选择三对供受体分别为G8-GFP和AFB1-Tag RFP、G8-GFP和QD-AFB1、G8-Nluc和QD-AFB1进行了比较。结果表明,供受体G8-GFP和AFB1-Tag RFP、G8-GFP和QD-AFB1由于荧光蛋白的量子点产率低,表现出较弱的能量转移效率（分别为12.19%和23.22%）,同时GFP的激发波长导致量子点的背景信号较大,影响检测灵敏度。供受体G8-Nluc和QD-AFB1配对,供体G8-Nluc的酶催化底物发光强度高,无激发波长的背景干扰,光谱测定结果显示,能量转移效率达25.67%。（3）基于G8-Nluc和QD-AFB1作为能量转移供受体的BRET均相免疫分析检测AFB1方法初探。对融合蛋白G8-Nluc表达条件进行了单因素条件优化,在诱导剂异丙基-β-D硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）浓度为2.5 mM条件下,30℃,220 rpm诱导表达12 h,融

关键词： 姜黄素   脂质体   脂质体的评价   相对生物利用度   黄曲霉毒素B1   体外药效  

摘要： 黄曲霉毒素B1(AFB1)对粮食和饲料的污染在世界范围内普遍存在,已成为危害食品安全和畜禽养殖的全球性问题,目前缺乏安全有效防治AFB1中毒的药物。姜黄素是从姜黄中提取的一种植物多酚,具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤等多种药理作用,因其作用于多个靶点,具有巨大的药用价值和治疗意义,近年来成为研究热点。但是姜黄素溶解性差,导致口服的生物利用度大大降低,严重制约了姜黄素的应用范围。脂质体是近年来新兴的药物包埋技术,具有载药效率高、在生物环境中稳定性高、生物利用度高、质量可控等优势,使其在临床研究中具有比其他载体更好的应用前景。本研究首先采用薄膜分散法结合均质技术制备姜黄素脂质体,以包封率为考察指标,通过单因素考察和响应面法对处方工艺进行优化;并系统评价姜黄素脂质体的常规性质、结构性质、外观形貌、稳定性等;然后在建立高效液相色谱法(HPLC)检测家兔血浆中姜黄素含量的基础上,以普通姜黄素为参比制剂,以本试验制备的姜黄素脂质体为受试制剂,研究了两种制剂在家兔体内的药代动力学特征及相对生物利用度,为评价姜黄素脂质体的临床有效性以及合理用药提供理论依据;本研究还建立了体外AFB1致AML-12肝细胞损伤模型,采用分组对比法考察了AFB1对AML-12细胞的毒性及姜黄素脂质体干预效果。研究结果如下:(1)姜黄素脂质体的制备及其评价:以包封率为评价指标,采用薄膜分散法并结合均质技术成功制备姜黄素脂质体,通过单因素考察和响应面法对处方进行优化并验证,最佳处方为:胆固醇含量25 mg、姜黄素含量12 mg、缓冲液体积25 m L;制备的脂质体包封率为96.6%;外观形貌为球形或椭球形,是一个均匀稳定的分散体系,粒径为128±1.5 nm,电位为+1.10±0.09 m V;采用红外光谱法对姜黄素脂质体结构性质进行探究,发现脂质体是通过磷脂双分子层疏水相互作用对姜黄素进行包埋;体外释放度结果表明,与游离姜黄素相比,姜黄素脂质体具有缓释作用(游离姜黄素24 h释放量为75.92%,姜黄素脂质体24 h释放量为42.02%)。姜黄素脂质体稳定性结果显示:脂质体包埋显著提高了姜黄素在4℃避光条件下的稳定性。(2)姜黄素脂质体在家兔体内的相对生物利用度研究:建立了测定家兔血浆中姜黄素含量的HPLC法。血浆样品经乙酸乙酯提取,HPLC法测定,并用外标法定量。方法学研究结果显示:家兔血浆添加姜黄素标准工作液在0.05～10μg/m L范围内线性关系良好(相关系数>0.99),检测限和定量限分别为0.01μg/m L和0.05μg/m L,采用三个浓度(0.05、0.5、10μg/m L)的姜黄素标准添加法考察了方法的精密度与准确度,批内与批间的变异系数分别为6%和11%,回收率在84.4%到117.3%范围内,且稳定性良好。成熟雄性家兔12只,随机分成2组,以100 mg/kg体重剂量分别对2组家兔经口灌服参比制剂与受试制剂,分别于给药后0.17、0.33、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、6 h于耳静脉采血,血浆样品经预处理后采用上述建立的HPLC法进行测定,Winnonlin 5.2.1软件进行分析。结果表明:姜黄素脂质体C显著高于姜黄素组,说明脂质体在包裹药物后,其吸收作用明显改善;同时姜黄素脂质体组T(2h)相比姜黄素组显著后移;姜黄素脂质体组AUC(1906.31±111.87 ng·h/m L)极显著高于姜黄素组(288.33±32.19 ng·h/m L),姜黄素脂质体在家兔体内相对生物利用度为680.02%。(3)姜黄素脂质体的体外药效学研究:建立体外AFB1致AML-12肝细胞损伤模型,将细胞分为AFB1组、姜黄素脂质体对照组、姜黄素脂质体干预组、姜黄素干预组、姜黄素对照组和空白对照组,通过分析比较不同处理组细胞上清转氨酶(ALT、AST)活力、ROS含量、致炎因子(TNF-α、INOS、IL-6、IL-1β)的表达量,研究AFB1对AML-12细胞的毒性及姜黄素脂质体干预效果。与空白对照组相比,AFB1组的血清转氨酶活性极显著上升(P<0.01),ROS含量显著升高(P<0.01),炎性因子(TNF-α、INOS、IL-6、IL-1β)的表达量显著上调(P<0.01),表明在AFB1作用下AML-12肝细胞发生了损伤和炎症。与AFB1组相比,姜黄素干预组和姜黄素脂质体干预组血清转氨酶含量分别极显著(P<0.01)下降了25.94%和31.54%,ROS含量显著降低(P<0.01),致炎因子(TNF-α、INOS、IL-6、IL-1β)的表达量均降低,表明姜黄素脂质体能够显著缓解或拮抗AFB1诱导的细胞损伤和炎症,其干预效果与普通姜黄素相当或略优。综上所述,本研究确定姜黄素脂质体的制备方法和处方,获得了粒径均一、体系稳定、高包封率的姜黄素脂质

关键词： 兽医学   黄曲霉毒素B1   肝细胞毒性   细胞色素  

摘要： 黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFB1）是由黄曲霉和寄生曲霉产生的次生代谢产物。在已鉴定出的大约20种黄曲霉毒素中，AFB1的毒性最大，被认为是最强的天然肝癌致癌物，并被国际癌症研究机构列为I类致癌物。AFB1是一种惰性化合物，它的毒性依赖于细胞色素P450（Cytochrome P450,CYP）将其激活形成高活性和亲电性的AFB1-8,9-环氧化物（AFB1-8,9-epoxide，AFBO）。饲料在运输和贮存过程中极容易被AFB1污染，致使猪接触到AFB1的概率远高于人和其他动物。AFB1的活化代谢机制在人体内已被研究比较明确。然而，却鲜有文献报道AFB1在猪体内的代谢转化过程。本实验室前期通过体外蛋白重组实验已证明猪CYP1A2、CYP2A19、CYP3A29和CYP3A46在AFB1的代谢活化过程中发挥作用。但在猪肝脏中，AFB1活化代谢产物以及主要参与AFB1激活为高毒性AFBO这一过程的CYP亚型尚不清楚。　　本研究采集了18头来自不同品种、性别和年龄的猪的肝脏，并利用差速离心法获得猪肝微粒体（Porcine Liver Microsomes，PLM），检测18个PLM代谢AFB1的活性。结果显示PLM代谢AFB1主要生成AFBO和少量AFM1/AFQ1，将产物AFBO的生成速率V与CYP1A、2A和3A蛋白模式底物的代谢速率V进行相关性分析后，AFBO的生成与CYP2A和3A蛋白具有较高的相关性。在PLM与AFB1孵育中添加高度同源的人CYP蛋白抗体作为抑制剂分别抑制PLM中四个CYP亚型活性。利用抑制剂充分抑制猪CYP1A2后，产物AFBO减少了23.8%;充分抑制猪CYP2A19后，产物AFBO减少了31.1%;充分抑制猪CYP3A29/46后，产物AFBO减少了50.3%。由此，我们发现猪CYP2A19和CYP3A29/46是PLM中催化AFB1代谢生成AFBO的主要亚型。　　AFBO的构型分为外环氧和内环氧两种，外环氧AFBO具有强烈的毒性。为了鉴定PLM代谢AFB1的产物AFBO的构型。我们在永生化猪肝脏细胞（HepLi）稳转了猪CYP1A2、CYP2A19、CYP3A29和CYP3A46蛋白。在不同浓度AFB1处理下，我们发现CYP2A19的稳转HepLi细胞对AFB1毒性极其敏感。通过免疫荧光技术检测稳转细胞内AFBO与DNA的加合物（AFB1-DNA），我们发现CYP2A19的稳转HepLi细胞荧光强度明显强于其余三个稳转细胞系，并且CYP2A19的稳转HepLi细胞内活性氧含量同样高于其他三个稳转细胞系。　　综上所述，本研究鉴定了猪肝微粒体蛋白代谢AFB1主要生成AFBO和少量的AFM1/AFQ1，其中高毒性外环氧AFBO主要由猪CYP2A19代谢AFB1产生，大部分的内环氧AFBO由猪CYP3A29/46催化。本研究证明了猪CYP2A19是猪肝脏中代谢AFB1发挥毒性的重要亚型，揭示了猪肝脏中AFB1有毒有害代谢物形成的机制，为筛选调控其催化活性的天然化学保护剂和关键氨基酸位点以减弱AFB1的肝细胞毒性提供重要参考，对于畜禽健康生产及其产品安全有重要意义。

关键词： 黄曲霉毒素B1   MOFs多功能材料   预警检测   削减   过氧单硫酸盐  

摘要： 黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1,AFB1）是毒性和致癌性最强的一种真菌毒素,普遍存在于农产品及其加工制品中,对人类造成了巨大的健康危害和经济损失。对AFB1全面的风险控制是确保食品质量安全和减少经济损失的重要方针。本论文以AFB1的预警检测以及脱毒为切入点,研究了多功能金属有机骨架（Metal-organic frameworks,MOFs）材料对AFB1前体物质的萃取性能以及对AFB1的吸附和催化过氧单硫酸盐（Peroxymonosulfate,PMS）降解AFB1的性能,并探究相关作用机理和影响因素,为利用MOFs多功能材料实现AFB1的全面风险控制提供了有力的技术支持和理论依据。主要研究结果如下:（1）建立了能准确、灵敏测定AFB1生物合成路径中第二个稳定的前体物质Averantin（AVN）和末端合成AFB1分支路径中的前体物质杂色曲霉素（Sterigmatocystin,ST）的Fe3O4/ZIFs-MSPE-HPLC新方法。通过简单的一锅法制备了Fe3O4/ZIFs,作为磁性固相萃取（Magnetic solid-phase extraction,MSPE）的磁性吸附剂,采用高效液相色谱（High-performance liquid chromatography,HPLC）测定AVN和ST。通过改变Fe2+和Zn2+的比例调控Fe3O4/ZIFs的比表面积和孔径分布,从而提高吸附剂对前体物质的吸附效率。随着Zn2+比例的增加,Fe3O4/ZIFs的比表面积增大,孔径分布更宽。当Fe2+:Zn2+的比例为1:8时,得到的Fe3O4/ZIFs（1:8）对AVN和ST的吸附性能最好。Fe3O4/ZIFs具有丰富的作用位点和与分析物相匹配的多种官能团,可以通过多重相互作用同时高效萃取具有不同极性和结构的AVN和ST。Fe3O4/ZIFs与AVN之间的相互作用以π-π作用和疏水作用为主,与ST以静电和表面络合作用为主。在优化条件下,AVN和ST的检出限分别为0.08μg kg-1和0.36μg kg-1,定量限分别为0.25μg kg-1和1.18μg kg-1。AVN和ST的加标回收率为80.6%-104.1%和79.8%-105.9%,且具有良好的日内和日间精密度。本工作为研究AVN和ST与AFB1的时间进程关系提供了新的研究思路,为建立AFB1的早期预警技术提供了技术基础。（2）以Fe-ZIF-8作为前驱体,在Si O2外壳的保护作用下,经过高温热解制备的Fe/N共掺杂多孔碳（Fe/N-co-doped porous carbon,Fe/N-PC）可用于高效吸附AFB1。由于Si O2壳层的保护作用有效阻止了Fe-ZIF-8在热解过程中的骨架坍塌,制备的Fe/N-PC保留了大的比表面积(848.09 m2 g-1),并形成了分层多孔结构。Fe/N-PC对AFB1的吸附过程为单分子层的化学吸附。Fe/N-PC主要通过疏水作用和π-π作用吸附AFB1。Fe/N-PC对AFB1的最大吸附容量为202.8 mg g-1,高于目前已报道的活性炭、改性蒙脱土等吸附剂。Fe/N-PC在吸附豆腐废水中的AFB1时,吸附效率可以达到99.6%,表现出优异的实际应用性能。本工作首次将Fe-ZIF-8在Si O2壳层保护下制备的Fe/N共掺杂多孔碳材料用于AFB1的吸附,为提高MOFs材料对AFB1的吸附性能提供了一种新的合成途径。（3）在基于PMS的高级氧化技术（Advanced oxidation processes,AOPs）中,开发活性位点丰富和传质能力快速的PMS催化剂是实现高效降解AFB1的关键和挑战。Fe的原位掺杂向Fe/N-PC中引入了具有高PMS催化活性的Fe-N位点。Si O2保护策略有效阻止了Fe-ZIF-8在热解过程中的聚集,使得制备的Fe/N-PC中保留了大的比表面积并引入了分层多孔结构,显著改善了反应物在Fe/N-PC上的传质速率。在宽的p H范围内,Fe/N-PC在降解AFB1中均表现出优异的催化性能。优化条件下,Fe/N-PC/PMS体系可在30 min内降解99.9%的AFB1。1O2是Fe/N-PC/PMS体系中降解AFB1的主要反应活性物质,其形成主要与Fe/N-PC中的Fe-N、石墨化N、C=O基团和永久性自由基活性位点有关。利用高分辨液质联用技术鉴定出了4种AFB1降解产物,并提出了两种可能的AFB1降解途径。Fe/N-PC不仅具有良好的可重复使用性,还在降解豆腐废水中的AFB1时表现出潜在应用价值。本工作为提高MOFs衍生的多孔碳材料的催化活性提供了一种简单易行的方法,也首次将Fe/N-PC作为PMS的催化剂用于高效降解AFB1。（4）Fe3O4是活化PMS降解有机污染物的一种很有前途

关键词： 医院制剂   中药制剂   发展现状   发展思路   质量管理  

摘要： 目的：分析医院制剂发展现状，为医院制剂的管理与发展提供参考。方法：梳理医院制剂生产设备及环境、制剂人才队伍建设、制剂类型及品种、质量管理与注册申报、新药转化情况，浅谈医院制剂发展现状，依据当前国家相关法规及医药学研究领域的最新动态，提出发展策略。结果和结论：新形势下，医院制剂发展面临诸多挑战。结合我院经验和做法提出建议，通过转变发展思路，在政策指引下不断完善自身生产硬件和管理软件等设施，提高医疗机构对医院制剂重要性的认识，利用好中医药发展的良好环境，发挥好医院制剂特色优势，积极发展中医优势病种的特色中药制剂，提高医院制剂质量，加强新制剂研发，开展临床观察及不良反应监测，通过制定专家共识，强化医院制剂配制与质量管理规范化，推进医院制剂研发工作发展。

关键词： 黄曲霉毒素B1   金刚烷胺   双特异性单克隆抗体   免疫层析法   量子点荧光微球  

摘要： 黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1,AFB1）是毒性最强的真菌毒素,主要存在于谷物和饲料中。AFB1因具有较强的致癌、致畸和致突变作用,在1988年被国际癌症研究机构归为一类致癌物质。金刚烷胺（Amantadine,AMD）是用于治疗流感疾病的一类抗病毒药物,由于AMD的滥用严重危害人类健康,目前已禁用于畜禽养殖中。只有饲料安全才能保证动物性食品的安全,因此建立快速、高效及灵敏的检测方法以加强饲料中AFB1和AMD残留检测是非常必要的。本研究制备了一种同时抗AFB1和AMD的双特异性单克隆抗体（Bispecific monoclonal antibody,BsMAb）,在此基础上建立了可高效检测饲料中AFB1和AMD的免疫层析法（Immunochromatographic assay,ICA）。主要研究方法和结论如下:（1）首先将AFB1和AMD杂交瘤细胞分别诱导为次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶和胸腺嘧啶核苷激酶酶缺陷型杂交瘤细胞,然后对两种酶缺陷型杂交瘤细胞进行细胞融合,最终筛选出4株能特异性分泌抗AFB1和AMD抗体的BsMAb细胞株（1B6、1H12、3E1和5D5）。经ELISA进行特异性及灵敏度评价,结果显示,BsMAb只与黄曲霉毒素B2和金刚乙胺有轻微交叉反应;4种BsMAb检测AFB1的半数抑制浓度(Half maximal inhibitory concentration,IC50)分别为2.06、1.28、2.09和3.07 ng/mL,检测AMD的IC50分别为2.04、1.08、0.50和1.30 ng/mL。根据AFB1和AMD的限量要求,最终选择3E1进行后续实验。（2）基于抗AFB1和抗AMD的两种单克隆抗体,分别建立了快速检测饲料中AFB1和AMD的量子点荧光微球（Quantum dot nanobeads,QBs）免疫层析法,并对一些重要参数进行了优化。在4种饲料样本（乳猪饲料、仔猪饲料、母猪饲料和产蛋鸭配合饲料）中,QBs-ICA对于AFB1的检测限（Limit of detection,LOD）分别为0.12、0.13、0.19和0.18μg/kg,对于AMD的LOD分别为0.22、0.21、0.17和0.11μg/kg。虽然本方法的灵敏度可以满足饲料中AFB1和AMD的限量要求,但需要两张试纸条进行检测。（3）基于BsMAb建立了一种QBs-ICA用于饲料中AFB1和AMD的同时检测。在最佳条件下,利用QBs-ICA检测4种饲料样本（乳猪料、仔猪料、母猪料及产蛋鸭配合饲料）中AFB1的LOD分别为0.188、0.221、0.233和0.306μg/kg,检测AMD的LOD分别为0.125、0.187、0.076和0.191μg/kg。本方法的灵敏度满足饲料中AFB1和AMD的限量要求。特异性和回收率实验表明,基于BsMAb的QBs-ICA检测饲料中AFB1和AMD时,具有较高的特异性和可靠性。综上所述,本研究基于制备的抗AFB1和AMD的BsMAb,建立了QBs-ICA,实现了对饲料中AFB1和AMD的高效检测,为食品及饲料中其他有害物质的多残留免疫分析提供了技术支撑。

关键词： 黄曲霉毒素B1   斑马鱼   肝脏发育   肝纤维化   发病机制  

摘要： 黄曲霉毒素B1(aflatoxin,AFB1)由黄曲霉及寄生曲霉等产生,广泛存在于多种农作物中而对饲料造成污染,对动物产生较强的致畸、致癌和致突变作用。为检测AFB1的毒性作用,本研究使用斑马鱼胚胎(AB系和肝脏转基因斑马鱼)作为模式动物,从形态学、组织学、基因(组学)水平及蛋白质水平探讨了AFB1的发育毒性及其作用机制。选取受精4小时(4 hpf)的斑马鱼用于AFB1暴露(对照组,0.05μg/m L,0.075μg/m L和0.1μg/m L),并在不同发育时间检测各项指标。试验结果表明AFB1可引起肝脏脂肪变性及肝细胞核浓缩。与对照组相比,0.05μg/m L,0.075μg/m L,和0.1μg/m L组的核浓缩数量增高,呈浓度依存性。与之对应,AFB1可造成斑马鱼肝脏面积的低下(抑制生长),中浓度组和高浓度组较对照组斑马鱼肝脏荧光面积显著降低,呈浓度依存性。通过基因检测发现AFB1引起肝脏发育基因(Hhex和prox1)基因表达量下降,结果表明在24hpf时,Hhex和prox1各浓度组与对照组相比有下降的趋势,但无显著性差异。在48hpf时,Hhex高浓度组和中浓度组与对照组相比有下降的趋势,但无显著性差异,而prox1的基因表达量,与对照组相比,高浓度组的基因表达量显著下降。在72hpf时,检测细胞凋亡相关基因(p53,Bcl-2,Bax)的表达量时发现p53的基因表达量与对照组相比,高浓度组基因表达量显著增高,Bcl-2基因表达量的对照组与高浓度组相比显著下降,Bax基因的表达量与对照组相比显著上升。进一步探讨AFB1在48hpf和72hpf对脂质代谢平衡相关基因(PPAR-α,PPAR-β,PPAR-γ)基因表达量的变化,发现AFB1可诱导斑马鱼脂质代谢紊乱。以上结果说明,AFB1肝脏引起的肝脏面积低下可能是激活细胞凋亡和影响肝脏发育基因表达量所造成的。为进一步探讨不同时期AFB1对斑马鱼胚胎肝损伤的机制,将幼年斑马鱼在48hpf暴露于不同浓度组的(0.025μg/m L、0.05μg/m L和0.075μg/m L)AFB1中,在144hpf结果发现:与对照组相比,高浓度组和中浓度组肝脏组织变性空泡率显著上升。通过Masson和天狼星红组织学染色发现,蓝色胶原纤维生成,且具有浓度依存性(p<0.001)。高浓度组引起α-平滑肌肌动蛋白蛋白的表达增加,与对照组相比棕色变深。对斑马鱼肝纤维化(Hand-2、Acta-2)和炎症损伤(Tgf-β、SDF)基因的表达量进行检测,结果发现:Acta-2的基因表达量与对照组相比,高浓度组的表达量显著上升。检测Hand-2的基因表达量发现:与对照组相比,中浓度组和高浓度组的基因表达量显著上升。TGF-β的基因表达量发现:与对照组相比,中浓度组和高浓度组的基因表达量显著上升。SDF基因发现:高浓度组和中浓度组的基因表达量较对照组显著上升。本试验表明不同时期暴露AFB1可造成肝脏发育的抑制,肝纤维化的生成,找出相关机制,构建模型,为畜牧业治疗AFB1损害提供高通量药物筛选模型。

关键词： 核酸适配体   镉离子   黄曲霉毒素B1   可视检测  

摘要： 核酸适配体是一类具有特殊碱基序列的寡核苷酸分子,不仅是遗传信息的载体,还可以与不同类型的靶标,如小分子、毒素等进行特异性杂交,同时核酸适配体具有的易于合成、易于修饰、尺寸小、稳定性好以及良好的亲和力和特异性等优点,使得通过核酸适配体制备各种检测探针成为研究的热点。本论文基于核酸适配体建立可视检测体系,主要开展以下两个方面的工作:1.构建基于核酸适配体的镉离子可视检测体系。以镉离子适体修饰金纳米粒子制备镉离子检测探针(Au NPs-DNA),氧化4-硝基苯酚构建可视传感体系,当体系中有镉离子存在时,核酸适配体与镉离子结合,适体卷曲并将Au NPsDNA表面封闭,导致Au NPs-DNA的催化作用被抑制,4-硝基苯酚无法被氧化褪色,体系长时间呈现黄色;当体系中没有镉离子存在时,核酸适配体在Au NPs-DNA表面舒展,4-硝基苯酚被氧化,体系由黄色褪为无色,镉离子越多,褪色时间越长,据此建立相应的比色卡,实现了镉离子的高选择性可视检测。实验结果表明,本方法在0-30μmol/L呈线性关系,检出限5μmol/L2.构建基于核酸适配体的黄曲霉毒素B1的可视检测体系。以黄曲霉毒素B1适体修饰金纳米粒子制备黄曲霉毒素B1检测探针(Au NPs-DNA),氧化3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)构建可视传感体系,当体系中有黄曲霉毒素B1存在时,核酸适配体与黄曲霉毒素B1结合,适体卷曲并将Au NPs-DNA表面封闭,导致Au NPs-DNA的类酶活性被抑制,TMB无法被氧化显色,体系呈现无色;当体系中没有黄曲霉毒素B1存在时,核酸适配体在Au NPs-DNA表面舒展,TMB被氧化,体系由无色变为蓝色,黄曲霉毒素B1越多,体系中蓝色越浅,实现了高选择性的检测黄曲霉毒素B1。实验结果表明,本方法在0-800 nmol/L呈线性关系,检出限为160 nmol/L。

关键词： 稻米   激光诱导荧光   黄曲霉毒素B1   霉变   同步检测  

摘要： 稻米在储藏过程中极易受霉菌及黄曲霉毒素B(Aflatoxin B,AFB)污染,并且难以防控。传统检测方法操作繁琐、耗时长等问题较为突出,因此开发一种快速、无损的检测方法对稻米生产、储藏及加工过程具有重要意义。激光诱导荧光技术(Laser Induced Fluorescence,LIF)由于灵敏度高和特异性强,适用于微量组分的检测等优势被广泛应用。本文首先以霉变稻米为研究对象,探讨基于LIF技术检测稻米霉变程度的可行性;然后以人工接菌稻米为研究对象,建立稻米产毒真菌识别、霉变及AFB污染程度同步判别的定性模型,并对比不同形态样品(稻米籽粒、米粉)的预测效果;最后,为进一步提升LIF技术判别能力,将高光谱技术(Hyperspectral Imaging technology,HSI)融合获取近红外反射信息,比较不同特征参数融合对于稻米霉变及AFB污染程度的预测能力。本研究的目的是提供一种基于LIF技术的稻米中霉菌及AFB污染的快速无损检测方法,为推进该技术在农产品质量安全检测中的应用提供理论基础。本文主要研究内容与结论如下:(1)利用LIF技术可成功实现稻米霉变程度的判别。结果表明:主成分分析(PCA)结果显示,不同霉变程度样品之间聚类趋势较明显。采用主成分线性判别分析(PC-LDA)、偏最小二乘判别分析(PLS-DA)及支持向量机(SVM)分别建立稻米霉变程度的定性判别模型,其中基于连续投影算法(SPA)-PLS-DA模型正确率最高,建模集及预测集正确率均为90%,结果表明LIF技术对于稻米霉变程度检测具有可行性。(2)利用LIF技术实现产毒真菌识别、霉变及AFB污染程度同步判别,并探索了两种形态样品对模型精度的影响。以人工接菌稻米为研究对象,检测稻米籽粒、米粉两种形态样品。将稻米样品分别以AFB含量10μg/kg、以菌落总数2.7 log CFU/g为阈值划分为两类,建模结果表明:对于产毒/非产毒菌株污染样品划分,稻米籽粒和米粉最优正确率为100%、96%和100%、100%;对于AFB污染程度判别,稻米籽粒和米粉最优结果分别为97%、91%和98%、97%;对于霉变程度判别的稻米籽粒和米粉最优结果为98%、97%与100%、97%。以上结果说明该技术对于稻米产毒真菌识别、霉变及AFB污染程度判别均具有实际运用潜力。对比稻米籽粒与米粉结果可知,米粉的分类效果要优于稻米籽粒结果。根据稻米产毒/非产毒菌株污染、霉变及AFB污染程度划分样品,模型平均正确率分别高3.94%、3.89%、3.34%。综上述结果表明,LIF技术可以较好的实现产毒真菌、霉变及AFB污染程度识别,然而米粉由于粒径小,霉菌及AFB分布相对更均匀,模型的预测能力更好。(3)利用高光谱技术融合可提升单一LIF技术建立的稻米霉变及AFB污染定性模型精度。将稻米样品分别以AFB含量10μg/kg和200μg/kg、以菌落总数2.7 log CFU/g和4.0 log CFU/g为阈值进一步划分为三类,结果如下:PCA结果图可知,融合后较单一LIF技术表现出更好的聚类效果。模型结果表明,该融合技术对于霉变、AFB污染识别中,最优模型建模集和预测集正确率分别为97%、91%和91%、85%,较单一LIF技术正确率分别提高了3%、5%以上,说明数据融合后模型的精度更好,具有更好的表征能力。