关键词： 中药制剂   水分活度   微生物污染   微生物控制   质量控制  

摘要： 目的建立基于水分活度(a;)的非无菌中药制剂微生物控制策略。方法测定11种中药剂型的水分活度分布,采用水分活度为0.328,0.529,0.753,0.902,0.973的条件下放置的方法分析胶囊剂、丸剂等中药制剂水分活度和需氧菌总数、霉菌及酵母菌总数的变化规律,建立中药制剂的微生物控制策略。结果在GMP条件下生产的中药制剂,可根据a;将非无菌中药制剂分为4类,评估微生物生长繁殖风险,采取科学的微生物控制策略。一类产品a;≥0.90,进行TAMC,TYMC以及该剂型规定的控制菌和其他具有潜在危害的微生物测试;二类产品0.90>a;≥0.85,进行TAMC,TYMC和金黄色葡萄球菌测试;三类产品0.85>a;≥0.60,进行TAMC、TYMC测试;四类产品a;<0.60,可结合风险评估,逐步研究减少测试的控制方案。结论基于水分活度的中药制剂分类控制策略为微生物控制提供了新思路,在降低中药制剂生物负载的前提下,可通过控制水分活度降低中药制剂生产、运输、储存等过程的微生物生长繁殖风险,进而提高非无菌中药制剂的微生控制水平。

关键词： 强化用药管理   中药制剂   合理使用   不良反应   管理质量  

摘要： 目的:探讨强化用药管理对中药制剂合理使用的影响。方法:通过随机数表法将湖州市中心医院呼吸与危重科收治的140例采用中药制剂进行治疗的患者分为对照组和观察组,每组70例。对照组用药期间予以常规用药管理。观察组在对照组基础上进行强化用药管理。比较两组患者用药管理后各系统不良反应发生率,同时观察两组患者管理前后的用药安全管理质量变化。结果:观察组各系统不良反应发生率均低于对照组(P<0.05)。管理前,观察组配伍、用量、疗程及贮存方面的评分和对照组比较差异不大(P>0.05);管理后,对照组配伍、用量、疗程及贮存方面的评分高于对照组(P<0.05)。结论:强化用药管理不仅对促进中药制剂合理使用具有积极作用,而且还可以进一步减少患者用药不良反应的发生,有利于提高用药安全管理质量。

关键词： 铈掺杂共价有机框架材料   铈-金属有机骨架材料   纳米模拟酶   适体传感器   赭曲霉毒素   黄曲霉毒素B1   玉米赤霉烯酮  

摘要： 食品安全问题是民生中的大问题,开发快速便捷检测真菌毒素的方法至关重要。适体传感器因其具有较强的特异性和较好的灵敏度而被广泛用于食品中真菌毒素的检测。本研究以共价有机框架材料（COFs）、金属有机骨架材料（MOFs）、黑磷纳米片等作为修饰材料构建了一系列的适体传感器,用于对食品中真菌毒素赭曲霉毒素A、黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮的检测。本文研究分为以下四个部分:（1）提出了一种基于便携式电化学工作站的适体传感器用于真菌毒素玉米赤霉烯酮（ZEN）的定量检测。所构建的适体传感器利用丝网印刷电极（SPE）和U盘式电化学工作站,采用计时电流法（i-t）于Tris-醋酸缓冲溶液（p H 7.0）中测定Au NPs@Ce-Tp Bpy COF材料对过氧化氢还原的催化电流。当体系中存在ZEN时,ZEN会和ZEN适体特异性结合,阻碍了电子的传递,使Au NPs@Ce-Tp Bpy COF对过氧化氢还原的催化电流变小。通过催化电流的减小值（△I）,实现对玉米赤霉烯酮毒素的定量检测。结果表明,所制备的适体传感器在0.01 ng/m L-100 ng/m L范围内,响应电流（△I）与玉米赤霉烯酮毒素浓度的对数呈现良好的线性关系,线性方程为△I=0.401 lgc+1.548,线性相关系数R2=0.9906,检测下限为0.389 pg/m L（S/N=3）。该方法对ZEN具有较好的选择性和较高的灵敏度,使用方便,可以满足即时检测的需要。（2）设计了一种多价生物素化生物支架用于赭曲霉毒素的灵敏检测。该方法以修饰了链霉亲和素的辣根过氧化物酶为信号标记物,基于羧基化的磁珠,构建了一种可视化的赭曲霉毒素生物传感器。在H2O2存在的条件下,辣根过氧化物酶能够将TMB由无色氧化为蓝色,而多价生物素化生物支架能够结合更多的链霉亲和素偶联的辣根过氧化物酶,从而使信号放大。采用紫外分光光度计检测氧化态的TMB经H2SO4终止显色后在450 nm处的吸收。在0.01 ng/m L-500ng/m L范围内,吸光度与赭曲霉毒素浓度的对数呈现良好的线性关系,线性方程为△A=0.203 lgc+0.482,线性相关系数R2=0.994,检测下限为8.57 pg/m L（S/N=3）。该传感器具有灵敏度高、操作简单以及信号放大等特点。（3）以负载有金纳米颗粒的二维层状共价有机框架材料作为电极的修饰材料,以偶联了链霉亲和素的碱性磷酸酶为信号标记物,构建了赭曲霉毒素适体传感器。在碱性磷酸酶的催化下,对硝基苯磷酸二钠能够水解产生对硝基苯酚。通过差分脉冲伏安法检测对硝基苯酚的电流响应信号。在0.005 ng/m L-100 ng/m L范围内,响应电流与赭曲霉毒素浓度的对数呈现良好的线性关系,线性方程为ΔI=0.7477 lgc+2.0829,线性相关系数R2=0.9946,检测下限为1.67 pg/m L（S/N=3）。（4）提出了一种以负载有金纳米颗粒的黑磷纳米片作为电极的修饰材料,以Ce-MOF作为信号标记物,采用棱镜DNA纳米结构修饰的电极作为识别界面构建黄曲霉毒素适体传感器的方法。利用棱镜DNA、引物探针之间的杂交在电极表面引发滚环扩增（RCA）,然后将修饰有Au NPs@Ce-MOF的互补链结合到扩增链上以提供电化学信号。在0.024 ng/m L-100 ng/m L范围内,响应电流与黄曲霉毒素浓度的对数呈现良好的线性关系,线性方程为I=6.4181 lgc+11.975,线性相关系数R2=0.9973,检测下限为1.48 pg/m L（S/N=3）。

关键词： 黄曲霉毒素B1   同位素内标   稻壳   花生油   磁性吸附剂  

摘要： 黄曲霉毒素B1（AFB1）是由曲霉属产生的一种具有强致畸致癌性的次级代谢产物。它易污染于花生等油料作物,进而致使作为花生加工产物的花生油存在毒素残留,造成极大食用安全隐患。因此,加强花生油中AFB1的准确检测及高效脱除极具现实意义。然而,由于花生油样品基质复杂,对痕量AFB1的分析检测带来诸多困难;AFB1的脂溶特性,对于降低花生油中毒素残留也增加了难度。因此,本论文采用同位素内标结合冷冻离心消除样品基质干扰,建立了花生油中AFB1的检测方法,并作为分析手段用于后续脱除研究;综合选材、系统优化,制备以稻壳为原料的磁性稻壳生物炭,深入探究其对花生油中AFB1的吸附特性及吸附机理,并探讨其实际应用的可能性。主要研究结果如下:（1）建立了同位素内标-超高效液相色谱-串联质谱定量分析花生油等花生类食品（花生、花生酱、花生奶）中AFB1的检测方法。表明4种花生类食品均存在显著的基质抑制效应,采用4℃冷冻离心净化基质,结合稳定同位素内标(13C17-AFB1)校正,可有效消除基质干扰。经过方法学验证,AFB1在0.01～30μg/L范围内线性关系良好,相关系数（R2）为0.9998,检出限为0.07～0.36μg/kg、定量限为0.24～1.20μg/kg,加标回收率为80.3%～103.4%,日内、日间精密度均小于5.8%,可以用于花生油等花生类食品中AFB1的准确分析检测。（2）以稻壳为原料制备磁性稻壳生物炭,优化制备流程,以实际花生油中AFB1吸附率为评估标准,表明稻壳粉最佳用量为10 g,热解最佳温度为500℃,吸附率为96.16%;不同生物壳（花生壳、板栗壳、葵花籽壳及黄豆壳）的吸附率为54.64%～58.37%,筛选出稻壳为最佳生物壳来源;制备磁性脱硅稻壳生物炭,吸附率为30.95%,综合选材表明硅含量对吸附率有显著影响,通过微观表征表明硅元素通过扩大比表面积及抑制有效吸附位点团聚进而增强材料吸附性能。同时,材料磁性能优异,可通过外部磁场实现与花生油的分离。（3）系统研究磁性稻壳生物炭对花生油中AFB1的吸附特性、吸附机理及在食品领域的应用价值。结果表明,吸附剂可在室温条件下,以10 mg/g的吸附剂量在1 h内实现对污染花生油的高效吸附,对20μg/kg AFB1污染花生油（国标限量）的吸附率为92.12%;吸附过程更加拟合Langmuir模型及准二级动力学模型;吸附机理主要为Fe3+与黄曲霉毒素β-二羰基之间的螯合作用;对比研究表明吸附过程未对花生油营养质量（酸价、过氧化值、脂肪酸及维生素E）造成影响,同时,通过TM4及HT22小鼠细胞毒性实验初步证明吸附剂的高安全性。

关键词： 液晶微阵列   光子晶体   光学信号   核酸适配体   表面活性剂   可卡因   黄曲霉毒素B1   乙酰胆碱酯酶   马拉硫磷  

摘要： 液晶状态是物质的一种存在状态,广泛存在于各种合成分子和生物分子中。液晶（liquid crystal,LC）传感器是一种利用液晶分子作为信号转换元件,将液晶界面的化学物理信号变化转化为光学信号,可实现对多种生物分子及离子的免标记、高灵敏度检测。但是目前发展的液晶传感体系仍面临一些问题,比如,液晶响应基底制备要求较高,难以重复利用;传感界面易受到外界环境（温度、湿度）的影响;利用液晶光学图像进行分析,难以精确定量等等。反蛋白石光子晶体（inverse opal photonic crystals,IOPh Cs）是一类在空间上具有特定周期性排列的有序多孔材料,具有优良的光学性质,在光学调制、生物检测、催化防伪等领域显示出独特的优势。通过调节IOPh Cs空隙中折射率的大小,可以实现对IOPh Cs光学信号的调控。本论文以反蛋白石光子晶体为模板,液晶分子作为响应单元,制备液晶微阵列（liquid crystal microarray,LCM）薄膜作为传感响应基底,探究核酸分子、表面活性剂对LCM薄膜光学信号的调控作用,发展新的液晶传感信号。在此基础上进一步构建并发展LCM传感器,用于多种小分子的免标记、快速灵敏检测,主要研究内容如下:（1）第二章中,结合反蛋白石光子晶体的有序微孔结构,以及液晶分子的双折射性,制备LCM薄膜并构建LCM传感平台。通过光纤光谱仪,光学显微镜等,探究反蛋白石液晶聚合物薄膜（IO-LCP）的光学性质;通过分析LCM薄膜的光学图像、反射峰强度的变化等,研究在液晶分子注入前后,液晶分子折射率的变化对LCM薄膜光学信号的调控作用。此外利用不同质量分数（0.2 wt%-1wt%）以及不同粒径的Si O2悬浮液（200 nm,230 nm,250 nm,280 nm,320 nm）制备光子晶体模板,并探究所制备的IO-LCP薄膜以及LCM薄膜的光学信号变化规律。制备具有优异光学信号、高稳定性的LCM薄膜,构建液晶微阵列传感界面,发展液晶微阵列传感体系。（2）第三章中,利用液晶微阵列（LCM）薄膜,探究核酸分子对LCM薄膜光学信号的调控作用;利用荧光图像、偏光显微图像以及LCM薄膜表面电位值,研究核酸分子与液晶分子的相互作用。结果表明单链核酸分子通过暴露的碱基基团,通过分子间作用力吸附在LCM薄膜上,并对薄膜中的液晶分子具有诱导作用,导致液晶分子的取向发生改变,实现对LCM薄膜光学性质的调控。该LCM传感界面在室温放置6个月之后,仍然对单链核酸分子具有很好的响应性能;并且LCM薄膜在10次的循环使用测试中,显示出优异的响应性能,可进行重复可循环的使用。利用核酸适配体与目标物的特异性结合能力,通过核酸适配体对LCM薄膜中液晶分子的诱导作用,调控LCM薄膜的光学信号;当可卡因分子加入之后,核酸适配体与目标物的特异性识别结合,形成具有空间立体的结构,进而从LCM薄膜上解吸附;液晶分子的取向发生改变,导致LCM薄膜反射峰强度的变化,实现对可卡因的免标记高灵敏检测,最低检测浓度为100 p M。利用光纤光谱仪记录的LCM薄膜的反射峰,通过显微光谱液晶传感信号,构建以核酸适配体为基础的液晶微阵列生物传感器。（3）第四章中,利用单链DNA（ss DNA）对LCM薄膜光学信号的调控能力及核酸适配体与AFB1的特异性识别能力,设计了signal-on型的LCM生物传感器。利用AFB1触发含有适配体的双链DNA(ds DNAAFB1)释放ss DNA,ss DNA对LCM薄膜中的液晶分子进行诱导,液晶分子取向发生改变,LCM薄膜的光学信号发生改变,通过光纤光谱仪记录LCM薄膜的光学信号和反射峰强度的变化,实现对AFB1的高灵敏定量分析检测（300 p M-100 n M）。进一步地,利用荧光显微镜、偏光显微镜以及圆二色光谱仪对LCM传感器的检测原理进行验证。该传感器不仅对AFB1具有很好的选择性,而且可以实现实际样品（玉米粉及啤酒）中AFB1的检测,抗干扰能力较好。此外,根据ss DNA对LCM薄膜中液晶分子的诱导响应作用,通过LCM薄膜的光学图像以及偏光图像,利用局部响应机理（PSM）,探究ss DNA对LCM薄膜光学信号的调控原理。（4）第五章中,首次探究了不同种类及不同烷基链长的表面活性剂（SDS、C_nTAB、C12E4）在LCM薄膜界面的自组装以及对LCM薄膜光学性质的影响规律,对LCM薄膜发射峰强度及位移的变化进行讨论。利用具有类似表面活性剂结构的氯化肉豆蔻酰胆碱（Myr）初步诱导LCM薄膜,从而对LCM薄膜的光学信号进行调控;当乙酰胆碱酯酶催化水解Myr之后,水解产物（十四烷酸）的亲水性较弱,对LCM薄膜中液晶分子的诱导能力增强,导致液晶分子逐渐接近垂直取向,并向法线方向靠近,进一步引起LCM薄膜反射峰位移的变化;当乙酰胆

关键词： 静电纺丝   表面分子印迹   氯霉素   黄曲霉毒素B1   共价有机框架  

摘要： 食品安全一直是公众关注的热点问题,如今大量抗生素的滥用和真菌毒素的污染为食品安全带来了潜在风险。因此,研发食品中污染物的吸附去除技术,对于维护国家食品安全、保障人们身体健康具有重要意义。静电纺丝纤维凭借可降解、成本低、孔隙率高等优势而被广泛应用于环境、食品和生物医学工程等领域。将静电纺丝纤维与分子印迹聚合物进行结合,赋予其特定的结合位点,可以高亲和力地识别并结合目标分子。共价有机框架材料具有比表面积大、热稳定性好等优势,将其与静电纺丝纤维结合,可以大大提高其吸附效果。因此本研究制备了静电纺丝纤维-表面分子印迹聚合物复合材料和静电纺丝纤维-COF复合材料,分别实现对氯霉素和黄曲霉毒素B的高效吸附去除,主要研究结果如下:(1)本研究基于表面印迹法,以氨基化二氧化硅(Si O-NH)微球为载体制备了核壳结构的氯霉素分子印迹聚合物。并对材料的形貌特征、吸附性能和稳定性进行了研究。结果表明Si O-NH@MIP对氯霉素的吸附速率快,吸附容量为65.36 mg/g,吸附过程为单层化学吸附,经过5次吸附-解吸循环后,Si O-NH@MIP对氯霉素的吸附率仍可达到94%以上。采用混纺法将静电纺丝纤维膜作为载体结合分子印迹聚合物制备吸附膜。所制备的印迹与非印迹纤维膜仍具有吸附差异性,分离效果好,解决了粉末状聚合物难分离、易发生二次污染的问题。(2)基于以上研究结果,本研究选用比表面积更大、热稳定性好的COF原位生长于纤维膜上。先将单体2,5-二乙烯基对苯二甲醛与聚丙烯腈纺丝液混合,为COF的形成提供生长位点,通过静电纺丝工艺制备PAN/DVA,然后生长“花状”COF制备PAN@COF纤维膜(PAN@COF),用于去除黄曲霉毒素B。通过对材料的表征、吸附性能、稳定性和吸附机理的研究,发现活化的PAN@COF对黄曲霉毒素B吸附30 min即可达到平衡,吸附容量为30.98 mg/g。使用后的吸附膜经过碱性溶液进行洗涤即可重复使用,10次吸附-解吸循环后的去除率仍在98%以上,主要通过氢键、π-π堆积和疏水作用力进行吸附。本方法与之前相比,吸附位点完全暴露、比表面积更大,提高了吸附效率。本文基于静电纺丝技术,分别采用混纺法和原位生长法制备出可特异性结合氯霉素的PAN/Si O-NH@MIP吸附膜和高效去除黄曲霉毒素B的PAN@COF,均显示出优异的膜性能,具有作为去除食品中污染物的环境友好型滤膜的潜力。

关键词： 索诺拉沙漠芽孢杆菌   黄曲霉毒素B1   发酵条件优化   降解  

摘要： 黄曲霉毒素B(Aflatoxin B,AFB)是一种常见的真菌毒素,由黄曲霉和寄生曲霉等若干真菌在一定条件下产生的次级代谢物,具有极强毒性,可普遍污染饲料及食品原料,可直接或间接的威胁人和动物的健康,每年都会造成数以亿计的经济损失。与物理及化学降解黄曲霉毒素相比,生物降解法具有更优的特性,且安全性较高。本文主要利用索诺拉沙漠芽孢杆菌(Bacillus sonorensis)降解AFB,研究了该菌株的降解特性,并对其降解活性物质进行了初步探讨。具体研究内容如下:(1)通过单因素试验(接种量、初始p H、发酵时间和发酵温度)探究了索诺拉沙漠芽孢杆菌对降解AFB效果的影响。结果表明,该菌株降解AFB的最适接种量为5%,最适培养基初始p H为7,最适发酵时间为48 h,最适发酵温度为37°C。在此单因素试验结果基础上,通过响应面试验设计对降解AFB的发酵条件进行优化,最优发酵条件为:接种量6.2%、发酵时间47.9 h、发酵温度38.5°C,降解率较优化前提高了4.97%。随后对黄曲霉毒素主要产生菌进行抑菌观察,结果表明,该菌株对黄曲霉和寄生曲霉的生长无抑制作用。(2)测定不同组分(无细胞上清液、菌体细胞和细胞破碎液)对AFB降解的能力,结果表明,无细胞上清液对AFB的降解率为90.60%,菌体细胞对AFB的降解率为29.74%,细胞破碎液对AFB的降解率为41.10%。由此得到,起降解作用的活性物质成分主要分布在无细胞上清液中。针对无细胞上清液进行不同方式的处理,验证降解AFB的活性物质成分是否有蛋白参与。首先,验证热处理对无细胞上清液的降解活性是否存在影响,沸水浴(15 min)处理对降解活性无显著影响(P>0.05),经高温高压(121°C,20 min)处理后,无细胞上清液对AFB的降解率从90.60%降低至78.94%(P<0.05)。两种热处理方式说明无细胞上清液中含有的有效降解活性成分具有一定的耐热性。随着降解温度的升高降解AFB所用时间逐步缩短,降解温度为90°C时,终浓度为1μg/m L的AFB与无细胞上清液共同孵育12 h即可被完全降解。其次,通过蛋白酶K和SDS对无细胞上清液进行处理,其降解能力分别从90.60%下降至83.46%和45.72%,说明耐热的胞外酶类可能是降解AFB主要活性物质。研究金属离子对无细胞上清液降解AFB的影响,结果表明,Cu、Fe可促进无细胞上清液对AFB的降解,Mn、Zn则不同程度的抑制了降解活性,而Mg对降解效果无影响(P>0.05)。(3)采用不同饱和度的硫酸铵分级沉淀无细胞上清液得到粗酶液,并研究了各级沉淀粗酶液对AFB的降解效果。结果表明,不同硫酸铵饱和度处理对AFB降解能力有所影响,不同浓度硫酸铵沉淀的粗酶液与AFB共同孵育后,发现55%饱和度的硫酸铵沉淀能够分离出更多具有降解活性的物质,使AFB的降解率达到51.17%,而硫酸铵饱和度80%时沉淀的去蛋白上清对AFB的降解率为63.48%。将55%硫酸铵饱和度的沉淀复溶得到的粗酶液进行质谱检测,推断降解AFB的活性物质可能是组成型蛋白。(4)荧光光谱检测显示AFB降解产物的荧光明显减弱,判断其荧光特性减弱可能是内酯环断裂所造成。进一步分析了无细胞上清液和AFB转化体系对猪小肠上皮细胞(IPEC-1)的细胞毒性,采用MTT法验证了无细胞上清液和其降解产物的毒副作用。结果表明,在本试验无细胞上清液浓度为1000μg/m L的范围内对IPEC-1细胞生长无抑制作用,即无毒副作用;AFB被转化后的体系对IPEC-1细胞的存活率与空白对照组相比无显著差异(P>0.05),说明降解产物无毒性。

关键词： 玉米   水辅助微波   黄曲霉毒素B1   降解效果   降解产物   玉米品质  

摘要： 玉米是世界上重要的粮食作物之一,同时也是食品、饲料和工业的重要原料。由于玉米中黄曲霉毒素B1（AFB1）污染严重,食品和饲料中的黄曲霉毒素污染每年在全球范围内造成巨大的经济损失和健康风险。因此,寻找合适的方法消减玉米中的AFB1,保障玉米原料及其制品的质量安全,是全球范围内高度关注的问题。 本研究首先探讨了水分子在微波降解AFB1过程中的重要作用和水辅助微波降解AFB1的效果及规律,分析了其降解AFB1的化学反应动力学以及降解过程中的“非热效应”。其次,通过超高效液相色谱（Ultimate 3000）串联四级杆-静电场轨道阱高分辨质谱（UHPLC-Q-Orbitrap）研究了水辅助微波降解AFB1的产物,及多种因素对降解产物种类的影响,明确了AFB1的降解路径。最后,分析了该方法降解玉米中AFB1的效果和各因素对降解效果的影响,以及该方法在降解玉米中AFB1的过程中对玉米品质的影响。研究结果表明: （1）水分子在微波降解AFB1的过程中可以作为传热介质提高AFB1的升温速率,同时降低AFB1降解所需的温度,增加AFB1的降解率。高压密闭条件下,微波功率越大,体系的温度越高,AFB1的降解率越高。当微波加热温度恒定时,提高微波功率可以增加AFB1的降解率;水辅助微波降解AFB1的效果还受到AFB1初始浓度的影响,即在一定的浓度范围内（0.05 mg/L～5 mg/L）,AFB1的降解率随着AFB1初始浓度的增加呈现先增加后减少的趋势;水辅助微波降解AFB1的过程中存在“非热效应”加快了AFB1的降解速率,促进了AFB1的降解。对水辅助微波降解AFB1的动力学研究表明该降解过程属于伪一级反应动力学。 （2）AFB1被水辅助微波降解后,使用UHPLC-Q-Orbitrap检测和SIEVE软件的差异性分析共找到了6个主要的降解产物。微波加热温度影响AFB1降解产物的种类,而微波加热时间、微波加热功率、AFB1初始浓度则主要影响AFB1降解产物的数量。依据6个降解产物的分子式及二级质谱信息,参考AFB1的化学结构,推测了6个降解产物的化学结构。并通过化学结构验证软件Mass Frontier 7.0对6个降解产物的化学结构进行验证。同时依据降解产物的化学结构,推测了水辅助微波降解AFB1的路径。AFB1化学结构中内酯环的水解是最主要的降解方式,若微波加热温度较高（≥130℃）,可同步发生呋喃环结构的水解。AFB1被降解后,最主要的两个毒性基团(C（8）-C（9）双键和内酯环)被破坏,因此其毒性显著降低。 （3）玉米粒度、微波加热温度、料液比、微波功率、AFB1初始含量对水辅助微波降解玉米中AFB1的降解率具有显著影响。玉米粉中AFB1的降解率优于玉米粒,且通过实验确定2 W/g（400 W/200 g）的升温速率有利于准确控制体系终止温度。提高微波加热温度（100℃～160℃）,AFB1的降解率从6.6%增加至90.6%;随着料液比的减小（1:1～1:9）,AFB1的降解率从45.6%增加至62.5%;随着微波功率增加（200 W～800W）,AFB1的降解率从49.1%增加至83.3%;随着玉米中AFB1初始含量增加（120μg/kg～400μg/kg）,AFB1的降解率从62.0%增加至74.0%。另外,对不同条件下玉米中AFB1的降解动力学模型研究表明,水辅助微波降解玉米中AFB1的过程也符合伪一级动力学模型。 （4）水辅助微波降解AFB1过程中对玉米的色泽、霉菌数量、过氧化值、体外消化性、糊化特性具有显著的影响。处理后玉米色泽发生不同程度的褐变,玉米中的主要霉菌被大量杀灭,且玉米粉的体外消化性增加（快消化与慢消化淀粉百分含量增加）。随着处理时间的延长,玉米中过氧化值、抗性淀粉含量、玉米粉的热糊稳定性和冷糊稳定性呈现不断增加的趋势;随着温度的升高,玉米中过氧化值呈现先增加后减少的趋势,玉米粉的热糊稳定性和冷糊稳定性呈现不断增加的趋势,但不影响玉米粉中抗性淀粉含量;随着料液比的减小,玉米中过氧化值和抗性淀粉的含量表现为不断减少的趋势;随着微波功率的增加,玉米中过氧化值、玉米粉的热糊稳定性和冷糊稳定性呈现不断增加的趋势,但对抗性淀粉含量影响不大。 综上,水分子在AFB1降解过程中既是AFB1的溶剂,又参与了AFB1的降解反应,且水分子降低了微波降解AFB1所需的温度,提高了AFB1的降解率。同时,水辅助微波降解玉米中的AFB1时,若其它微波处理条件不变,通过增加水的比例（减小料液比）,不仅可以进一步增加AFB1的降解率,而且有利于避免玉米色泽的褐变、过氧化值的升高、抑制抗性淀粉的产生、使玉米的糊化特性最接近未处理玉米。这充分体现了水辅助微波法在降解玉米中AFB1时的潜在优势及具有的应用前景。

关键词： 黄曲霉毒素   纳米抗体   非竞争   抗免疫复合物肽   化学发光免疫分析  

摘要： 黄曲霉毒素（Aflatoxins,AFs）是由黄曲霉和寄生曲霉等真菌产生的一类毒性次生代谢产物,目前已经确定了20多种,其中黄曲霉毒素B1（AFB1）是毒性最强的一种,具有高度致癌性、致畸性等毒性,严重危害人、畜健康。因此,对黄曲霉毒素进行灵敏、快速检测具有重要意义。免疫分析法具有快速、简便、高通量的优点,非常适宜黄曲霉毒素的快速检测。小分子污染物的免疫分析法主要有竞争型和非竞争型两种基本模式,目前开发的黄曲霉毒素的免疫分析方法多为竞争型模式,然而非竞争型免疫分析通常被认为比竞争型免疫分析更灵敏。为了建立快速灵敏的黄曲霉毒素B1的非竞争免疫检测方法,本研究首先构建了p8展示的噬菌体线性8肽库（pIT2-p8-x8）,通过噬菌体展示技术,从中筛选出了能够识别AFB1纳米抗体与AFB1形成的免疫复合物的噬菌体多肽,并建立了基于抗免疫复合物噬菌体多肽的磁非竞争免疫分析方法（noncompetitive magnetic phage anti-immune complex immunoassay,Nc-MPHAIA）和磁非竞争化学发光免疫分析方法（noncompetitive magnetic chemiluminescent phage anti-immune complex immunoassay,Nc-MCPHAIA）两种快速检测方法,具体结果如下: （1）AFB1纳米抗体Nb28免疫磁珠的制备。本研究根据抗AFB1纳米抗体Nb28的氨基酸序列,合成了其DNA片段,并在Nb28的C端引入一个铰链结构域和半胱氨酸残基。通过原核表达和纯化,获得末端带有半胱氨酸残基的可溶性的Nb28融合蛋白。通过双功能偶联剂sulfo-SMCC将其C端的巯基与氨基磁珠（NH2-MBs）的氨基偶联获得了免疫磁珠Nb28-MBs。 （2）抗免疫复合物多肽的筛选。本研究首先将随机8肽的基因插入到pIT2-p8载体中,获得了噬菌体展示随机线性8肽库（pIT2-p8-x8）,以纳米抗体Nb28与AFB1形成的免疫复合物为靶标,经过四轮淘选,从p8展示的噬菌体线性8肽库中,筛选到了12个抗免疫复合物噬菌体多肽,测定分析SC50和ODmax/SC50值,最终选择性能最好的噬菌体多肽p13（D-L-L-W-V-P-S-T）进行下一步研究。 （3）建立了基于抗免疫复合物噬菌体多肽p13的磁非竞争免疫检测方法。利用噬菌体多肽p13和免疫磁珠Nb28-MBs,建立了AFB1的磁非竞争免疫分析方法（Nc-MPHAIA）,经优化确定该方法最佳工作条件为:Nb28-MBs与p13孵育时间30min,甲醇浓度17.5%,p H值8.0,离子强度40m M PBS,脱脂奶粉浓度8%。最优条件下该方法检测AFB1的50%信号饱和浓度(SC50)和检出限（LOD）分别为0.13和0.004ng/mL,线性范围为0.021～0.72ng/mL,与基于Nb28的竞争型免疫分析法相比,该检测灵敏度有了很大的提高。使用该方法测定了大米、玉米、面粉、花生、花生油、玉米油等六种样品的AFB1加标回收率,回收率为91.1%～118.1%,变异系数（CV）为1.3%～8.2%。 （4）建立了基于酶标噬菌体多肽p13的磁非竞争化学发光免疫分析方法。首先将噬菌体多肽p13进行生物素化标记,然后将其与辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素（SA-HRP）混合孵育,获得酶标噬菌体多肽p13。然后,建立了基于酶标噬菌体多肽p13和免疫磁珠Nb28-MBs的直接磁非竞争化学发免疫分析方法（Nc-MCPHAIA）。Nc-MCPHAIA检测AFB1的SC50和LOD分别为0.089和0.006ng/mL,线性范围为0.019～0.41ng/mL。Nc-MCPHAIA孵育时间仅需10min,与Nc-MPHAIA相比缩短了6.5倍。使用该方法测定了大米、玉米、面粉、花生、花生油、玉米油六种样品的AFB1加标回收率,回收率为83.8～119.2%,变异系数为1.8～8.9%。此外,使用Nc-MCPHAIA与高效液相色谱法对市场中大米、玉米、面粉共15个样品的平行检测分析显示,两种方法的结果相符,且Nc-MCPHAIA具有更高的检测灵敏度。